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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Tissue-Engineering Nierenfunktion Konstrukte bieten eine Lösung für den Organmangel und die schädlichen Wirkungen der Dialyse. Hier beschreiben wir ein Protokoll zum Mikro murine Nieren zur Isolation von Cortico-medullären Segmente zu sezieren. Diese Segmente werden in zellulären Gerüst-freie Konstrukte bilden renale Organellen implantiert.

Zusammenfassung

Nieren-Transplantation ist jetzt ein Mainstream-Therapie bei terminaler Niereninsuffizienz. Mit rund 96.000 Menschen auf der Warteliste und nur ein Viertel dieser Patienten Transplantation zu erreichen, ist jedoch dringend nach Alternativen für diejenigen Organe versagen. Um die schädlichen Folgen der Dialyse zusammen mit der gesamten Gesundheitskosten zu verringern, die es verursacht, ist aktive Untersuchungen im Gange auf der Suche nach Alternativlösungen zur Organtransplantation. Implantierbare Tissue-Engineering renal zellulären Konstrukte sind ein solcher Machbaren Ansatz zu ersetzen verloren renal Funktionalität. Zum ersten Mal beschrieben, hier Mikrodissektion murinen Nieren zur Isolation von lebenden Corticomedullary renal Segmente. Diese Segmente sind in der Lage, rasche Einarbeitung in Gerüst-freie endothelial-Fibroblasten Konstrukte, die schnelle Verbindung mit Host Gefäßsystem einmal implantiert ermöglichen kann. Erwachsenen Maus Nieren wurden von Lebendspendern, gefolgt von Stereoskop Mikrodissektion, renale Segmente 200-300 µm im Durchmesser zu erhalten beschafft. Mehreren renal Konstrukte wurden hergestellt mit primären renal Segmente, die aus nur einer Niere geerntet. Diese Methode zeigt ein Verfahren, das renal Funktionsgewebe aus Organen zu retten könnte, die sonst weggeworfen würden.

Einleitung

Chronische Niereninsuffizienz (CNI) gehört zu den aktuellen öffentlichen Gesundheitswesens Herausforderungen weltweit1. Die Prävalenz von CKD in den Vereinigten Staaten ist mehr als 14 % der Gesamtbevölkerung, mit mehr als 600.000 Amerikaner leiden an der schwersten Form, terminaler Niereninsuffizienz (ESRD)2. Die aktuellen Behandlungsmöglichkeiten für Menschen mit terminaler Niereninsuffizienz Dialyse und Nieren-Transplantation gehören. Obwohl etwa 25.000 Patienten Nierentransplantation jährlich unterziehen, sind eine beträchtliche Anzahl von Patienten hinzugefügt jährlich eine große Diskrepanz zwischen denen, die warten auf eine lebensrettende Organ und die empfangende Transplantation3. Neben seiner schwerwiegenden negativen Auswirkungen auf Langlebigkeit und Qualität des Lebens ist die Dialyse mit einer erstaunlichen finanziellen Belastung verbunden. Im Jahr 2014 betrug Medicare Ansprüche bezahlt mehr als $ 30 Milliarden für ESRD Patienten2. Mit einer begrenzten Orgel und keine offensichtlichen Abwärtstrend bei Patienten, die eine Dialyse Forschungsanstrengungen zur Ermittlung von Alternativlösungen zur Dialyse und Transplantation sind immer wichtig. Sogar eine relativ kurze Verzögerung bei der Notwendigkeit einer Dialyse erhöht ein Patient qualitätsbereinigten Lebensjahre und Produktivität erheblich während der Dialyse-bezogenen Kosten4,5,6zu verschieben.

Lösungen für funktionale Gewebeverlust, wie in terminaler Niereninsuffizienz, werden derzeit in Gewebe-Engineering und regenerativer Medizin Labore, mit unterschiedlichsten Ansätzen von Gerüst-basierte organoide Fertigung bis hin zu ganzen Organs engineering mit untersucht Organstrukturen für zelluläre Implantation7,8,9,10,11decellularized. Rekapitulation komplexe renale Strukturen aus marginalen oder ausrangierte Nieren ist nur teilweise untersucht worden. In der Tat sind fast 20 % der Nieren zur Transplantation beschafft für verschiedene Gründe12,13verworfen. Renal Funktionsgewebe aus diesen vermeintlichen Transplantate könnten genutzt und in einem oder mehreren Tissue Engineering Konstrukten integriert. Vorherige Studien belegen die Machbarkeit der Arbeit mit dieser ausrangierten Organe, Nieren für die extrazelluläre Matrix für Tissue engineering Zwecke14,15Nutzung. Jedoch haben nur wenige primäre nephronal Gewebe aus gesunden Nieren für Gewebe-Engineering Zwecke16,17,18verwendet.

Eine Methode, die zuvor von Kim Et Al. beschrieben bedeutet Isolation der renalen "Segmente" von gesunden Ratte Nieren, die dann auf Polyglycolic Acid (PGA) Gerüste für Konstrukt Herstellung16ausgesät wurden. Jedoch wenig Angaben über genaue Dissektion Methodik und Segmente stammen aus einer Kombination von fein hacken und Filtration. Wir beschreiben eine Änderung dieses Protokolls, die in ähnlicher Weise produziert diskrete renal Segmente mit intakten nephronal Architektur, sondern stützt sich auf Mikrodissektion Techniken. Nephrectomies erfolgen auf lebenden Erwachsenen Mäusen, nach denen die Nieren übertragen werden an die Dissektion Mikroskop, wo die renale Kapsel entfernt und das Gewebe weiter zergliedert. KK 30½ G Nadeln als schneidenden Instrumenten verwendet werden und auch als Beihilfe bei der Dissektion führt, als die Nadel Durchmesser ist gleich dem Ziel Durchmesser der renalen Segmente. Die Segmente isoliert, in diesem Fall murinen, renale Lebensfähigkeit in Kultur pflegen und mit Gerüst-freie endothelial-Fibroblasten zellulären Konstrukte19integrieren. Diese Konstrukte haben früher, andere Organe, darunter ein Bio-künstliche Bauchspeicheldrüse20zu entwickeln.

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Protokoll

Alle tierischen chirurgischen Eingriffe, die unten beschriebenen stimmten die institutionellen Animal Care und verwenden Committee (IACUC) an der Medical University of South Carolina vor jedem Tier Operationen oder Einsatz von jedem Tiergewebe.

(1) murinen Nephrektomie

  1. Don ein Mundschutz und bouffant Kappe zur Minimierung des Risikos einer Kontamination. Sterilität bei der Einrichtung von der OP-Bereich zu erhalten.
    1. Legen Sie nicht gefenstert OP-Abdeckungen auf dem Operationstisch.
    2. Öffnen Sie die Packung autoklaviert Instrumente auf der sterilen Tüchern. Die Instrumente Nephrektomie gehören 3 kleine Hämostatika, feine Pinzette mit Zähnen, feine Pinzette ohne Zähne und gerade Iris-Schere.
    3. Legen Sie ein weiteres nicht gefenstert chirurgische drapieren, in der Mitte der OP-Tisch.
    4. Bereiten Sie 5 mL der Dulbeccos Phosphat gepuffert Kochsalzlösung (DPBS) mit Kalzium und Magnesium, ergänzt mit 1 % Penicillin/Streptomycin in einem 15 mL sterile konische Rohr vor. Legen Sie diese Lösung auf Eis neben dem OP-Tisch.
  2. Erhalten Sie eine 8-12 Wochen alte C57BL/6-Maus (männlich oder weiblich) aus der Tierhaltung-Komplex.
  3. Platzieren Sie den Mauszeiger in eine Narkose Induktion Kammer und mit 3,5 % inhaliert Isofluran induzieren. Legen Sie einen Nase Kegel auf der Maus, mit 2 % Isofluran für Wartung Anästhesie.
    1. Achten Sie auf ausreichende Tiefe der Narkose in regelmäßigen Abständen während der chirurgische Eingriff durch die Bewertung für Pedal Reflex (feste Zehe Prise).
  4. Entfernen Sie alle Haare aus der ventralen Torso mit Haarentfernungs-Creme. Spülen Sie diese Fläche mit destilliertem Wasser um sicherzustellen, dass alle Haare aus dem Bauch entfernt wurde.
  5. Übertragen Sie die Maus auf die sterile OP-Tisch in Rückenlage unter den Top nicht gefenstert Faltenwurf. Schneiden Sie einen 2 x 2 cm2 Fenster in der nur über die Maus Bauch drapieren.
  6. Gelten Sie Povidon-Jod gefolgt von 70 % Ethanol, der Bauch mit steriler Gaze oder Baumwolle Kugeln.
  7. Mit feinen Pinzette mit Zähnen und Iris-Schere, machen einen ca. 3-4 cm vertikalen Bauchhaut Schnitt parallel zur Mittellinie, 0,5 cm links der Mittellinie
    Hinweis: Wenn Sie versuchen, die rechte Niere zu entfernen, wird dies einen Einschnitt 0,5 cm rechts neben der Mittellinie.
    1. Fassen Sie das Peritoneum mit feinen Pinzette ohne Zähne und einzuschneiden mit Iris-Schere in die Bauchhöhle geben. Die superior und inferior seitlichen Ränder der Haut und Bauchfell Spannung seitlich zu platzieren und Belichtung verbessern zuweisen Sie Futterzange.
    2. Verschieben Sie den Darminhalt zart auf der rechten Seite des Bauches, die linke Niere verfügbar zu machen. Legen Sie behutsam Traktion auf der Niere, es aus dem Bauch zu erheben.
    3. Legen Sie eine Gefäßklemme über das Hilum der linken Niere. Verwenden Sie Iris-Schere, um den Harnleiter und Nieren Schiffe Transekt.
    4. Legen Sie die linke Niere in die 1 % Penicillin/Streptomycin DPBS Lösung auf Eis.
    5. Übertragen Sie das Röhrchen mit der Niere, der sterile Gewebekultur-Haube. Die Niere aus dem 15 mL konische Röhrchen auf einer 60 mm Petrischale (Abbildung 1) übertragen. Spülen mit zweimal 5 mL DPBS mit Calcium und Magnesium. Halten Sie die Niere in 5 mL DPBS in der 60-mm-Schale ausgesetzt.
      1. Bereiten Sie eine zusätzliche 60 mm Petrischale mit 5 mL DPBS während der Microdissection-Protokoll verwendet werden.
    6. Einschläfern Sie die Maus durch Thorakotomie und Entbluten nach der Beschaffung der Niere, nach einem genehmigten IACUC Tier Prüfplan.

(2) murinen Niere Mikrodissektion für renale Segment isoliert

  1. Sterilen Technik für diesen Teil des Protokolls, darunter sterile Handschuhe, Mundschutz, weiterverwenden und bouffant Kontaminationsrisiko zu minimieren.
    1. Ort steril drapiert auf der Stereo-Mikroskop-Plattform als auch hinsichtlich der Bereiche, die nur links und Recht des Mikroskops auf einem sterilen Bereich für Instrumente. Mikroskop Fokusknöpfe setzen Sie Kunststoff Klebefolien auf und sprühen Sie mit 70 % Ethanol. Schalten Sie den dual Schwanenhals-Strahler, die Bühne zu beleuchten.
    2. Offenen sterilisierte Instrumente (feine Pinzette ohne Skalpell Griff, #15 Skalpellklinge, zwei geraden Hämostatika, Zähne, zwei 30½ Messen hohl-Bohrung Nadeln) auf sterilen Tüchern. Platz #15 Klinge auf das Skalpell Griff nun und legen eine Gefäßklemme auf jeder Nadel-Adapter/Nabe Nadel Dissektion Instrumente zur späteren Verwendung zu erstellen, wie in Abbildung 1dargestellt.
  2. Verschieben Sie die 60 mm Petrischalen, eine mit der Niere in DPBS und die anderen nur DPBS aus der Gewebekultur Haube zum Bereich Mikroskop.
    1. Legen Sie die 60 mm Petrischale unter der Zielsetzung und entfernen Sie den Deckel um die Niere zu entlarven. Die Seite überlassen Sie des DPBS-haltigen Speise auf den sterilen Bereich für die spätere Verwendung.
    2. Verschieben Sie das Gericht, so dass nur die vordere oder hintere Oberfläche der Niere (d. h., die große Ebene Fläche der Niere, mit dem anderen Gesicht berühren den Boden der Schale) angezeigt wird. Zoomen Sie auf 3,2-4-X für diesen Teil des Verfahrens. Mit der nichtdominanten Hand verwenden Sie feine Pinzette ohne Zähne zu durchbohren und Heften Sie die Niere gegen das Gericht in der Nähe der minderwertigen und überlegenen Pole der Niere.
    3. Bewahren Sie die nicht-dominante Hand um die Niere zu fixieren. Verwenden Sie mit der dominanten Hand #15 Klinge, um die transluzente Kapsel Faserschicht aus die freiliegende Oberfläche zu entfernen. Rasieren Sie die oberflächlichste 0,5 mm von der sichtbaren Oberfläche der Niere, den Rest der Kapsel zu entfernen.
    4. #15 Messer, eine umgekehrte Pyramide des Gewebes aus dem Decapsulated Gebiet, etwa 2 mm3 in der Größe zu zergliedern. Abrufen der 60-mm-Schale mit nur DPBS und legen Sie die Pyramide des Gewebes in die saubere Schüssel. Entsorgen Sie den Rest der Niere.
    5. Vergrößerung auf 1,5-2,0 X für den Rest der Dissektion zu verringern. Mit zwei Gefäßklemme-Nadel-Instrumente als schneidenden Instrumenten, schneiden Sie das Gewebe-Fragment in immer kleinere Stücke bis die Gewebe-Segmente kleiner oder gleich dem Durchmesser der Nadel-Tipps sind. Eine renale Gewebe 2 mm3 in Größe produzieren mehr als 50 Segmente einmal komplett zerlegt.
    6. Wechseln Sie die 60-mm-Schale mit renal Segmente an der Gewebekultur Motorhaube Entfernen Sie DPBS mit 1000 µL Pipette. Fügen Sie 5 mL DMEM, mit 10 % fetalen Bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt.
    7. Kultur für 3 Tage bei 37 ° C in einem Inkubator oder Implantat zu zellulären Konstrukten sofort.

3. renale Segment Mobilfunk Konstrukt Fertigung

  1. Kultur normal menschlichen dermalen Fibroblasten (NHDF) und menschlichen Fettgewebe mikrovaskuläre Endothelzellen (HAMEC) für mehrere Wochen bis 7,2 x 105 Fibroblasten und 1,8 x 105 endothelial Zellen pro Konstrukt gewünscht zu erhalten. In der Gewebekultur Haube Saatgut das angemessene Verhältnis von Fibroblasten, Endothelzellen (4:1) in stabförmigen Vertiefungen in Agarose Formen bilden Gerüst-freie Pre-vaskulären endothelialen Fibroblasten Konstrukte (SPEC) wie oben beschrieben durch Czajka Et al. 19.
  2. Erhalten Sie eine sterilisierte Gefäßklemme, 30½ G-Nadel und einem sterilen Spatel mit flachen Ende.
    1. Die Mehrheit der Medien von der 60-mm-Platte mit renal Segmente, darauf achten, nicht zu Aspirieren und entfernen die renale Segmente zu entfernen.
    2. Statten Sie chirurgischen Lupen, Implantation von den Segmenten zu visualisieren.
    3. Reiben Sie das Ende des Spatels vorsichtig entlang der Unterseite der Schale 60 mm erhalten 10-15 Segmente, gleichmäßig entlang der äußersten Spitze des Spatels. Setzen Sie die Spitze des Spachtels so nah wie möglich an die Lippe des Brunnens wo die SPEC ausgesät wurde.
    4. Verwenden Sie einen Gefäßklemme-30½ G Nadel in der anderen Hand, um jedes einzelne Segment von der Spachtel Spitze an den Rand des Brunnens zu bewegen. Sanft bewegen jedes Segment nach unten in die gut mit der Nadelspitze bis leicht in den zuvor gesetzten Zellsuspension getaucht.
    5. Kultur renale Segment-SPEC in 2:1:1 Verhältnis von FGM-2/EGM-2/DMEM Medium (2,5 mL Volumen insgesamt). Ändern Sie Nährmedien alle 24 h für 3 Tage. Entfernen Sie die Konstrukte aus den Formen bei 72 h und beheben Sie oder Schockfrosten für die Verarbeitung.

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Ergebnisse

Das Protokoll beschrieben produziert ca. 50 renal Segmente pro pyramidale 2 mm3 Abschnitt des renalen Gewebes. Die renale Segmente, die verarbeitet und abgebildet haben röhrenförmige und glomeruläre Komponenten in unterschiedlichen Anteilen (siehe Abbildung 2). Die intakte Segmente waren ein Test unterzogen, um die Lebensfähigkeit der verschiedenen Segmente einmal alle 24 h für drei Tage zu bestimmen. Grün-fluoreszierende Calcein-AM ist mit i...

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Diskussion

Renal lebendes Gewebe zu konstruieren, die Konstrukte in Bezug auf die Art von Zellen und Biomaterialien genutzt und in vielen Fällen sehr unterschiedlich verwendeten Methoden sind veraltet oder nicht gut charakterisierten in der Literatur-7. Während viele Stammzellen Ansätze verwenden oder Rekapitulation Einzelkomponenten der renalen Architektur isoliert, ist die Aussicht auf eine künstlich Neuerstellung eines ganzen Organs mit über 26 verschiedenen differenzierte Zelltypen aus zellulären S...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

NIH institutionelle Postdoc Ausbildung Grant, NIH-HL-007260

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Non-fenestrated Sterile FieldBusse Hospital Disposables696
Fenestrated Sterile FieldBusse Hospital Disposables697
Halsted Mosquito Forceps 5 CurvedMiltexMil-7-4"Hemostat" in manuscript
Extra Fine Graefe Forceps, Curved with teethFine Science Tools11155-10Fine forceps with teeth
Extra Fine Graefe Forceps, Serrated (without teeth)Fine Science Tools11152-10Fine forceps without teeth
Fine Scissors - Tungsten CarbideFine Science Tools14568-09Iris Scissors
Betadine Surgical Scrub with Pump, Povidone-iodine 7.5%Purdue Products L.P.67618-151-17
Sterile Cotton Gauze Pad (4" x 4")Fisher Healthcare22-415-469
Dulbecco's Phosphate Buffered SolutionCorning21-030-CV
Penicillin/Streptomycin Solution, 100XCorning30-002-Cl
Isoflurane, USPManufacturer: Piramal, Distributor: McKesson2254845
Nair Hair RemoverNair22600-23307Hair Removal Cream in text
200 Proof EthanolDecon Laboratories2705Diluted to 70% Ethanol Solution
BioLite 60mm Tissue Culture DishThemo-Scientific130181
Press'n SealGlad12587-70441Applied to Stereoscope
SZX16 Stereo MicroscopeOlympusSZX16
Fiber Optic IlluminatorCole Parmer41720-20
Self-Supporting Dual-Light Pipe, 23" L GooseneckCole ParmerEW-41720-60
Scalpel Handle #3MiltexMil-4-7
Sterile Rib-Back Carbon Steel Blade, Blade Size 15Bard-Parker371115
31 1/2 Gauge NeedleThermoFisher Scientific14-826FBecton Dickinson 305106
Dulbecco's Modified Eagle's MediumCorning10-017-CV
Fetal Select 100% Bovine SerumAtlas BiologicalsFS-0500-AD
Normal Human Dermal FibroblastsLonzaCC-2511
Human Adipose Microvascular Endothelial CellsSciencell Research Laboratories7200
Surgical Loupes (2.5x)Orascoptic(N/A) Custom Order
FGM-2 (Fibroblast Basal Medium with FGM-2 SingleQuots Added)LonzaCC-3131, CC-4126
EGM-2 (Endothelial Basal Medium with EGM-2 SingleQuots Added)LonzaCC-3156, CC-4176
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit for Mammalian CellsThermoFisher ScientificL3224
Anti-Cytokeratin-18 AntibodyAbcamab668
Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 633ThermoFisher ScientificA-21052
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546ThermoFisher ScientificA-11010
Anti-Von Willebrand Factor AntibodyAbcamab6994
Albumin, Fluorescein isothiocyanate ConjugateSigma AldrichA9771-50MG
Hoescht 33342BD Pharmingen561908
Background BusterInnovex BiosciencesNB306

Referenzen

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