JoVE Logo
Autoren
Kontakt

Anmelden

Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um Insulin mit dem Ausdruck 3D murinen Pancreatoids von Pankreas Stammväter frei schwebenden e10.5 getrennt und die damit verbundenen Mesenchym zu generieren.

Zusammenfassung

Die Bauchspeicheldrüse ist ein komplexes Organ, bestehend aus vielen verschiedenen Zelltypen, die zusammen arbeiten, um Blut-Glukose-Homöostase und die Verdauung zu regulieren. Diese Zelltypen gehören Enzym-sezernierenden acinar Zellen, einem verzweigten ductal System für den Transport von Enzymen, die Darm- und Hormon-produzierende endokrine Zellen verantwortlich.

Endokrine Beta-Zellen sind die einzige Zelltyp im Körper, die produzieren Insulin um den Blutzuckerspiegel zu senken. Diabetes, eine Krankheit, gekennzeichnet durch einen Verlust oder Dysfunktion des Beta-Zellen, erreicht epidemische Ausmaße. Daher ist es unentbehrlich, Protokolle, um Beta-Zell-Entwicklung zu untersuchen, die zu screening-Zwecken verwendet werden können, die Droge und zellbasierte Therapie ableiten. Während die experimentelle Untersuchung der Maus Entwicklung unverzichtbar ist, sind in Vivo Studien mühsam und zeitaufwändig. Kultivierte Zellen bieten eine sehr komfortable Plattform für das Screening; Allerdings sind sie nicht in der Lage, die zellulären Vielfalt, architektonische Organisation und zellulären Interaktionen gefunden zu erhalten in-vivo. Daher ist es wichtig, die Entwicklung neuer Instrumente zur Untersuchung der Pankreas Organogenese und Physiologie.

Epitheliale Zellen der Bauchspeicheldrüse entwickeln in enger Zusammenarbeit mit Mesenchym vom Beginn der Organogenese, wie Zellen zu organisieren und in das komplexe, physiologisch zuständigen Erwachsenen Organ zu unterscheiden. Die Bauchspeicheldrüse Mesenchym bietet wichtige Signale für die endokrine Entwicklung, von die viele auch noch nicht, so schwierig, während der in-vitro- Kultur rekapitulieren verstanden sind. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Kultur dreidimensionale, zelluläre komplexe Maus Organellen, die Mesenchym, genannt Pancreatoids zu behalten. Die e10.5 murinen Pankreas Knospe seziert, dissoziiert und in ein Gerüst-freie Umgebung kultiviert. Dieser schwimmenden Zellen zusammensetzen selbst, mit Mesenchym umhüllt die Entwicklung Pancreatoid und eine robuste Reihe von endokrinen Beta-Zellen, die zusammen mit den acinar und die Kanal-Zellen entwickeln. Dieses System kann verwendet werden, um die Zelle Schicksal Entschlossenheit, Aufbauorganisation und Morphogenese, Zell-Zell-Interaktionen während der Organogenese, oder für die Droge, kleines Molekül oder genetisches Screening studieren.

Einleitung

Abgrenzung der Mechanismen für die normale Entwicklung und die Physiologie ist ausschlaggebend für die Ätiologie der Erkrankung zu verstehen und letztlich Behandlungsmethoden zu kultivieren. Während der Kultivierung und Differenzierung von Stammzellen schnelle und Hochdurchsatz-Analyse der Entwicklung ermöglicht, es ist begrenzt durch die vorhandenen Körper des Wissens über Mechanismen reguliert Zelle Schicksal und künstlich rekapituliert Entwicklung in einem relativ homogene, zweidimensionalen Zustand1,2. Nicht nur in Vivo Entwicklung beeinflusst von äußeren Einflüssen, mit verschiedenen Zelltypen in der Nische und Milieu bietet Parakrine Signale und organisatorische Unterstützung, Organogenese führen, sondern die Funktion dieser Zellen beruht auch auf ihre Umgebung für Führung3,4,5. Angesichts der Bedeutung von diesen externen Cues, die Grenzen der Differenzierung Protokolle und die mühsame Art der in Vivo Mausmodelle, Neuanlagen werden mussten grundlegende Entwicklungsprozesse und Physiologie experimentell zu untersuchen.

Die Entstehung von Protokollen, dreidimensionale, komplexe Organellen zu generieren bietet eine bequeme und kongruente System zur Untersuchung der Organogenese, Physiologie, Wirksamkeit von Medikamenten und sogar Pathogenese. Gründung murine Organellen für verschiedene Systeme wie der Magen6 und Darm7 unser Verständnis der Organogenese ausgedehnt haben, bietet ein Werkzeug, um Entwicklungsstörungen Komplexität mit weniger Einschränkungen als in Vivo Studie und in-vitro- Modelle. Durch diese Fortschritte bei der murinen organoide Bildung und dem Aufkommen der menschlichen pluripotenten Stammzellen Zellen, menschlichen Darm8, retinale9, renal10,11, und zerebralen12 Organellen hergestellt wurden, und dies Repertoire ist nur durch das vorhandene Wissen über die Mechanismen der Entwicklung begrenzt.

Von besonderem Interesse ist die Generation der pankreatischen Organellen, wie eine Vielzahl von Krankheiten verschiedener Pankreas Zelltypen, einschließlich acinar Zellen und Kanälen exokrinen Pankreasinsuffizienz13acinar Zellen in Pankreatitis14, Plagen und Beta-Zellen in der Diabetes-15. Erwerb von Wissen über die Entwicklung dieser verschiedenen Zelltypen konnte helfen beim Verständnis ihrer Pathologie und fungieren darüber hinaus als Plattform für personalisierte Drogentest oder Transplantation. Zuvor, Greggio Et Al. entwickelt eine Methode zum Erstellen von murinen Pankreas Organellen, die in Vivo Morphogenese rekapitulieren und entwickeln organisierte, dreidimensionale, komplexe Strukturen bestehend aus allen wichtigen Pankreas Epithelzelle 16,17-Typen. Dies ist ein großer Schritt nach vorne im Feld Pankreas, vor allem die Zellen in Vitro können biologische Untersuchungen von Beta-Zell-Entwicklung ermöglichen. Jedoch bildeten eine Knappheit von endokrinen Zellen in diesem Protokoll, es sei denn die Organellen in Gewebe transplantiert wurden, wo die Nische könnte interagieren und didaktische Hinweise17. Das Mesenchym bildet den größten Teil der Nische, Kuvertierung stark entwickelnde Epithel von frühen Stadien der Organogenese zu späteren Phasen einschließlich endokrine Delamination und Differenzierung3,4, 18. Das Zusammenspiel von dem Mesenchym mit der entwickelnden Bauchspeicheldrüse ist noch ein weiteres Beispiel für extrinsische Signalisierung und die Bedeutung der Aufrechterhaltung der in Vivo zellulären Komplexität Organogenese zu studieren.

Hier beschreiben wir, wie dreidimensionale Pankreas Organellen, genannt Pancreatoids, von dissoziierten e10.5 murinen Pankreas Stammväter generieren. Diese Pancreatoids behalten native Mesenchym, frei schwebenden Bedingungen selbst zusammensetzen und generieren alle wichtigen Pankreas Zelltypen, einschließlich eine robuste Reihe von endokrinen Betazellen19. Dieser Ansatz eignet sich am besten für die Analyse von endokrinen Entwicklung, da frühere Protokolle robuste endokriner Differenzierung fehlt. Allerdings ist unter Verwendung des Protokolls für Bauchspeicheldrüsenkrebs Organellen wie beschrieben durch Greggio Et Al. ist besser geeignet für die Analyse der pankreatischen epithelialen Verzweigungen und Morphogenese, als Verzweigung in Pancreatoids geringer.

Protokoll

Alle Tierversuche, die in dieser Methode beschriebenen stimmten die institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss des Baylor College of Medicine.

1. Vorbereitung der Maus embryonalen Tag 10.5 Pankreas Stammväter

Hinweis: Dieses Protokoll muss nicht erst in Schritt 2, unter sterilen Bedingungen einzuhalten, aber es eignet sich optimal zum Sterilisieren Dissektion Werkzeuge und sprühen Sie mit 70 % igem Ethanol vor dem Gebrauch.

  1. Um für die Dissektion einzurichten, füllen Sie einen Eiskübel und stellen Sie einen Behälter von Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) im Eis. Reinigen Sie zwei feine Spitzen Pinzette und Schere Dissektion mit 70 % Ethanol. Legen Sie in der Nähe der Dissektion, ein Behälter mit mindestens drei Borosilikat Kapillare Rohre, eine Mund-Pipette, ein Feuerzeug und 1.000 µL Pipettenspitzen gefiltert.
    1. Bereiten Sie mindestens 1 mL kalte Dispase 1,25 mg/mL verdünnt in sterilisierten Wasser und Platz in den zweiten Brunnen von einem 12-well-Platte auf dem Eis. Setzen Sie PBS in die erste, dritte und vierte Platte Brunnen der 12 gut. Platz 1 mL 0,05 % Trypsin in 1,5 mL tube auf Eis. Einen schütteln Inkubator 37 oc Vorwärmen
  2. Einschläfern Sie e10.5 timed-schwangeren Mäusen nach IACUC Richtlinien. Sprühen Sie den Bauch mit 70 % Ethanol, das Zwerchfell Puffernummern und Reinigen der Region vor einen v-förmigen Einschnitt in den Genitalbereich der Maus mit Schere und Pinzette.
    Hinweis: Darstellung eines vaginalen Steckers in dieses Protokoll zeigt Tag 0,5. Mit 5 - 6 Wochen alten Mäusen, wirkt eine Gewichtszunahme von mehr als 2 g als eine sekundäre Maßnahme der erfolgreichen Imprägnierung.
    1. Verbrauchsteuern Sie sorgfältig die Gebärmutter durch einen Schnitt zu machen, an die obersten seitlichen Abschnitte der Gebärmutter, zieht das Organ nach oben von der Maus, und nach dieser Einschnitt bis in den Genitalbereich vor auf der gegenüberliegenden Seite wiederholen. Legen Sie sie in einer 10 cm Petrischale mit kaltem PBS.
      Hinweis: Es ist möglich, Organellen aus e11.5 distanzierte Zellen zu erhalten, aber im Gegensatz zu den e10.5 Pancreatoids, diese Organellen noch nicht gekennzeichnet sind und somit nicht in der Lage weiterhin können, in alle drei großen Pankreas Linien zu unterscheiden.
  3. Platzieren Sie unter dem Mikroskop leicht Dissektion der Petrischale und öffnen Sie vorsichtig des uterinen Gewebes indem zwei Pinzetten zwischen jedem Embryo und peeling Gewebe Weg von dem Dottersack. Transferieren Sie die Embryonen durch das Greifen der Dottersack sanft mit Zange und in einer 10 cm Petrischale mit frischem, kaltem PBS. Legen Sie die Petrischale auf Eis.
    Hinweis: Es ist wichtig, heedfully zu entfernen Embryonen, vorzugsweise innerhalb der Dottersack beibehalten, wenn gewaltsame Entfernung der Nabelschnur, Rippen Gewebe des Embryos und die strukturelle Integrität ziehen kann.
  4. Legen Sie mehrere PBS Tropfen auf einer 10 cm Petrischale Deckel. Verwenden Sie diese Tröpfchen auf den Embryotransfer bei Dissektion extraembryonic Gewebe entfernt werden, um die Sichtbarkeit zu gewährleisten. Transfer eines Embryos zu einem Rückgang der PBS und entfernen Sie vorsichtig aus dem Dottersack mit Pinzette, während die restlichen Embryonen mit PBS-Puffer auf dem Eis (Abb. 1A) bleiben. Entfernen Sie den Kopf vor dem Verschieben des Embryos zu einem neuen PBS mit Pinzette leicht den Embryo, keine Beschädigung des Gewebes (Abbildung 1B) schöpfen.
    Hinweis: Das Gewebe müssen immer häufiger auf frischen PBS Tröpfchen übertragen werden, als hier, je nach Deckkraft der Flüssigkeit beschrieben.
    1. Entfernen Sie in einem neuen PBS-Tropfen die vordergliedmaße Knospen mit Pinzette (Abbildung 1B). Setzen Sie Zange in die Öffnung, wo Leib Knospe anwesend war und sanft reißen nur die meisten externe Gewebe anterior (Abbildung 1B). Embryo zu drehen und in Richtung posterior, Halt an die Megalosauridae Knospe zu wiederholen. An dieser Stelle sollte der Magen-Darm-Trakt sichtbar ist (Abbildung 1B).
    2. Die hintere Region des Magen-Darm-Trakt hat eine leichte Biegung (Abb. 1F). Zange hinter dieser Biegung in die Öffnung zwischen den Magen-Darm-Trakt und die Wirbelsäule Region der Körperwand einfügen. Lösen Sie den Magen-Darmtrakt, langsam nach oben arbeiten, bis die meisten frontzahngebiet erreicht ist (Abbildung 1B-E), wo die kardialen Region verbindet.
      OPTIONAL: Entfernen Sie das ursprüngliche Herz und die Leber Knospen aus den ventralen Regionen des Gastrointestinaltraktes, verlassen nur die kontinuierliche Darm Rohr. Die ersten paar Male dieses Protokoll erfolgt es könnte einfacher sein, das Herz und die Leber zu verlassen, wie ventrale Wahrzeichen bis der Morphologie des Magen-Darm-Trakt und der dorsalen Pankreas Knospe mehr sind vertraut (Abbildung 1C und D ).
    3. Übertragen Sie den Magen-Darm-Trakt auf das frische PBS Tröpfchen.
    4. Nehmen Sie Zange und Kneifen Sie sanft das Gewebe unterhalb der überstehenden Knospe und den Darm und heben Sie das äußere Gewebe aus (Abbildung 1-D-F).
      Hinweis: Die dorsale Pankreas Knospe befindet sich zwischen Magen und Darm (Abbildung 1C-G). Die Pankreatische Knospe unter sollte aussehen wie eine Runde, knorrigen Struktur (Abb. 1G).
    5. Zange zu platzieren, wo verbindet die Knospe zum Darm und Prise nach oben um die Knospe (Abbildung 1G) zu lösen. Waschen Sie einmal in einer neuen PBS-Blase vor der Übertragung der Knospe in den ersten Brunnen 12-well-Platte in kaltem PBS auf Eis. Wiederholen Sie, bis alle Knospen sind von Embryonen aufgenommen und in die erste Bohrung 12-well-Platte.
  5. Legen Sie die 12 gut Gericht unter dem Mikroskop leicht Dissektion. Die Anzahl der pankreatischen Knospen erfolgreich seziert, um später das Split-Verhältnis zu berechnen.
    1. Ort eine gefilterte 1.000 µL PIPETTENSPITZE in die Mund-Pipette mit einem Kapillarröhrchen angebracht. Flamme der Kapillare zu sterilisieren und erstellen eine Biegung in der Röhre für die Benutzerfreundlichkeit. Verwenden Sie die Kapillare Knospen auf die zweite gut mit kaltem Dispase-Lösung für 2 min zu übertragen, bevor er auf den dritten Brunnen mit sauberem PBS (Abbildung 1G).
      Hinweis: Beim Übertragen von Knospen aus Dispase, PBS, berühren Sie das Gewebe an der Spitze des kapillarröhrchens. Wenn das Gewebe an der Spitze der Röhre stecken, pipette rauf und runter oder schütteln in die saubere PBS-Lösung bis gelockert.
    2. Pipette Knospen rauf und runter, und auf der vierten Brunnen mit sauberem PBS übertragen. Schließlich verwenden die Kapillare Gerät Transfer Knospen an der 1,5 mL Tube mit 0,05 % Trypsin. Legen Sie das Rohr in den vorgewärmten 37 oC-Shaker und schütteln Sie bei 1.500 u/min für 4 Minuten.
    3. Wirbel für ca. 10 s sofort legen Sie dann den Schlauch in eine Zentrifuge und Spin für 5 min bei 200 g. entfernen alle aber etwa 50 µL der Lösung vorsichtig, nicht zentrifugiert Zellen (Abbildung 1G) stören.

2. Kultivierung dissoziierte Vorfahren um Pancreatoids zu bilden

Hinweis: Die folgenden sollte in einer sterilen Atmosphäre in einem standard Gewebekultur Haube, mit sterilen Standardverfahren durchgeführt werden.

  1. Fügen Sie für jede Knospe gesammelt 400 µL Organogenese Medien16,17 (Tabelle 1 hinzu) zu zentrifugiert Zellen. Pulse Wirbel dreimal und Platte 100 µL pro Bohrloch einer niedrigen Anlage 96 Platte gut, Aufteilung Knospen im Verhältnis 1:4 (Abbildung 1G).
  2. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop zu visualisieren Zellen frei schwebend (Abbildung 1H) getrennt. Legen Sie die Kulturschale in einem Inkubator 37 oC mit 5 % CO2 auf einer Wippe bei mittlerer Geschwindigkeit.
  3. Überwachen Sie den Fortschritt der Pancreatoids täglich. Ersetzen Sie mit 100 µL frische Medien alle 3 Tage sorgfältig pipettieren unter mikroskopischer Kontrolle in der Kapuze, wobei den Pancreatoid in den Brunnen zu entfernen. Alternativ können frische 100 µL der Medien einen neuen Brunnen und Pancreatoid mit übertragen hinzugefügt werden, dass das Borosilikatglas Kapillarrohr befestigt Mund Pipette und 1000 µL PIPETTENSPITZE gefiltert.

3. Verarbeitung Pancreatoids für Immunofluorescent Imaging

  1. Um Pancreatoids für immunofluorescent Bilder bearbeiten zu können, bereiten Sie zuerst 4 % Paraformaldehyd/PBS, pH7.4 (PFA) Lösung. Platz 50 µL 4 % PFA in Vertiefungen der 96 gut Platte.
    1. Mit dem Kapillarröhrchen Borosilikat und Mund Pipette mit der gefilterten PIPETTENSPITZE 1.000 µL, transfer Pancreatoids vom Nährmedium unter Medien so wenig wie möglich in den frischen Brunnen mit 4 % PFA. Legen Sie auf die Wippe bei Raumtemperatur 15 Minuten.
    2. Übertragen Sie Pancreatoids von 4 % PFA in einen Brunnen mit 100 µL frische PBS rock bei Raumtemperatur für 5-10 min. Wiederholung für eine Gesamtmenge von drei frische PBS wäscht.
      Hinweis: Das Protokoll kann hier mit Pancreatoids gespeichert in 100 µL PBS bei 4 oC für bis zu eine Woche pausiert werden.
  2. Für die Wholemount Bildgebung (empfohlen, wenn Antikörper geeignet, alternativer Ansatz in Abschnitt 3.3 sind. und Mikroskopie in 3.4.), übertragen von PBS in 50 µL 5 % Esel Serum mit 1 X PBS-Puffer mit 0,1 % nichtionische Reinigungsmittel (PBST) zu blockieren. Rock über Nacht bei 4 oC oder alternativ für 4 h bei Raumtemperatur.
    1. Pancreatoids zu übertragen, um einen neuen Brunnen mit primären Antikörper in 50 µL 5 % Esel Serum in 1 verdünnt X PBST. Optimal, Rock für 24 h bei 4 oC (mindestens 12 h aber bis zu 36 h).
      Hinweis: Antikörper aufgeführt in der Tabelle der Materialien gegen Chga (1: 100), DBA (1: 400), Vim (1: 400) und Pdx1 (1: 100) eignen sich für Wholemount Färbung; andere Antikörper können Optimierung erfordern.
    2. Übertragen Sie Pancreatoids zu einem Brunnen mit 100 µL frisches PBST waschen und rock für 30 min bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie diesen Schritt für eine Gesamtmenge von drei frisches PBST wäscht.
    3. Pancreatoids zu übertragen, um einen neuen Brunnen, sekundäre Antikörper in 50 µL 5 % Esel Serum in 1 verdünnt enthält X PBST. Schützen Sie die Platte vor Licht und in 4 oC, optimal 24 Stunden (mindestens 12 h aber bis zu 36 h) rocken.
      Hinweis: Alle Sekundärantikörper aufgeführt in der Tabelle der Werkstoffe und DAPI nuklearen gegenfärbung eignen sich für Wholemount Färbung.
    4. Pancreatoids zu übertragen, um einen neuen Brunnen mit 100 µL 1 x PBST und Rock bei Raumtemperatur für 30 min. Wiederholung für eine Gesamtmenge von drei Wäschen in 1 X PBST. In der dritten und letzten Wäsche hinzufügen 300 nM DAPI.
    5. Schließlich stecken Sie in 100 µL von reinen PBS und bei 4 oC lichtgeschützt für bis zu einer Woche vor Bildgebung durch konfokale Mikroskopie, obwohl beste Ergebnisse aus Bildgebung unmittelbar nach der Färbung kommen. Um zu verhindern, dass Bewegung der Pancreatoids während der Aufnahme aber Austrocknen zu verhindern, legen Sie jede Pancreatoid in ein Tröpfchen 20 µL PBS. Wenn Pancreatoids nicht noch bleiben, reduzieren Sie PBS-Lautstärke.
  3. Übertragen Sie für Gefrierschnitte Pancreatoids von PBS in 30 % Saccharoselösung über Nacht bei 4 oC.
    1. Einbetten von Medien in einer Blase unter dem Mikroskop Dissektion hinzufügen. Mit Pinzette unter mikroskopischer Kontrolle, Einweichen Sie Pancreatoids indem sanft durch das Einbetten von Medien mehrmals auf Rest Saccharose zu entfernen, bevor Sie auf eine Gewebe-Block mit gefrorenen Einbetten von Medien übertragen.
    2. Legen Sie das Gewebe Block auf Trockeneis bis gefroren und Abschnitt auf Kryostaten bei 8 µm.
      Hinweis: Abschnitte können bei-80 oC oder Immunostained sofort gespeichert werden.
    3. Lassen Sie Abschnitte von-80 oC auftauen bei Raumtemperatur ca. 5 Minuten trocknen. Zeichnen Sie eine hydrophobe Barriere mit dem hydrophoben PAP-Stift auf das Gewebe und den Block mit 5 % Esel Serum verdünnt in 1 X PBST für 30 min bei Raumtemperatur.
    4. Entfernen Sie Medien zu und ersetzen Sie sofort mit Primärantikörper verdünnt in 5 % Esel Serum verdünnt 1 X PBST Übernachtung im 4 oC.
    5. Die primäre Lösung entfernen und waschen Gewebe dreimal mit 1 X PBST für 10 Minuten. Im Anschluss daran fügen Sekundärantikörper Lösung verdünnt in 5 % Esel Serum verdünnt in 1 X PBST für 1 h bei Raumtemperatur und Folien vor Licht schützen.
    6. Die sekundäre Lösung entfernen und waschen Folien dreimal in 1 X PBST für 10 Minuten. In der letzten Wäsche hinzufügen 300 nM DAPI.
    7. Entfernen von Medien und Montage Medien und einem deckgläschen hinzufügen. Store gleitet lichtgeschützt in 4 oC bis bereit zum Bild.

4. Isolierung von RNA aus Pancreatoids für die Protokoll-Analyse

  1. Sammeln Sie Pancreatoids mit Borosilikat-Kapillare mit einer Mund-Pipette mit einem gefilterten 1.000 µL PIPETTENSPITZE für Sterilität und Ort in 500 µL Säure Guanidinium Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Lösung in einem 1,5 mL Röhrchen verbunden. Bei-80 oC lagern Sie oder gehen Sie sofort zur RNA-Isolierung.
  2. Tauen Sie für RNA-Isolierung Proben auf Eis auf, wenn nötig und 100 µL Chloroform. Vortex gut und Platz in 4 oC für 15 min. Vorkühlen eine Zentrifuge, 4 oC.
    1. Legen Sie Rohre in Zentrifuge und Spin für 20 min bei 12.000 g bei 4 oC.
    2. Entfernen Sie vorsichtig die Rohre, um die Trennung der Schichten nicht zu stören. Mit einer 200 µL Pipette, sammeln Sie die klare wässrige Lösung und setzen Sie eine neue 1,5 mL Tube, hinterlässt eine kleine Menge an Puffer aus den weißen Protein Layer und Rosa DNA-Layer. Berühren Sie nicht die Spitze der Pipette an nichts in diesem Prozess, und berühren Sie nicht die Wände der 1,5 mL Tube.
    3. Die neue Röhre mit der wässrigen Schicht und Vortex fügen Sie 500 µL 100 % Isopropanol hinzu. Lassen Sie sich bei Raumtemperatur für 20 min, länger auf dem Eis oder für maximale Niederschläge lassen über Nacht bei-20 oC.
    4. Zentrifugieren Sie bei 12.000 g für 15 min bei 4 oC, pellet-RNA. Entfernen Sie das Isopropanol ohne zu stören das Pellet.
      Hinweis: Da Pancreatoids klein sind, ist es wahrscheinlich das Pellet nicht angezeigt werden.
    5. Fügen Sie kalt, 75 % Ethanol und invertieren Sie das Rohr mehrmals. In der Zentrifuge und drehen Sie sich mit 9.000 x g für 10 min bei 4 oC. Remove Ethanol und Spin für 2 min bei 9.000 x g.
    6. Verwenden Sie 200 µL Pipette, um alle restlichen Ethanol in das Rohr zu entfernen, ohne Kontakt mit der Region, in dem, der das Pellet in befindet. Lassen Sie die Kappe auf dem Rohr für 5-10 min bei Raumtemperatur zur Verdunstung von restlichen Ethanol zu gewährleisten geöffnet.
    7. Aufschwemmen Sie Pellet durch Vortexen in 20 µL Nuklease-freies Wasser.
      Optional: Die RNA Wärmeregelung 65 oC für 3 min und sofort zurück aufs Eis. RNA kann bei-80 oC gelagert oder sofort für reverse Transkription und qPCR verwendet werden.

Ergebnisse

Sorgfältige Dissektion von mäuseembryonen am e10.5 aus dem uterinen Horn sollte unbeschädigte Embryonen mit PBS-Puffer für weitere Dissektion (Abb. 1A) ergeben. Der Magen-Darm-Trakt kann der Embryo (Abbildung 1B), schönem Unterscheidung der dorsalen Pankreas Knospe an der Kreuzung der Darm und Magen (Abbildung 1C-F) effizient entfernt werden. Di...

Diskussion

Produzieren Sie das Fortschreiten der Kultur zellmodelle ist entscheidend für richtig Modellentwicklung, klinisch relevante Zelltypen, Wirksamkeit von Medikamenten oder sogar Transplantation Patienten. Jedoch künstlich Rekapitulation Entwicklung in einer Petrischale ist eine Herausforderung, da sind wir noch weit davon entfernt, das Verständnis der Mechanismen der Organogenese und Physiologie in-vivo. So sind in-vitro- Zellen ineffizient erzeugt, nicht voll funktionsfähig, nicht für längere Zeit b...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir danken Jolanta Chmielowiec für hilfreiche Diskussion über das Protokoll und das Manuskript. Wir danken auch Benjamin Arenkiel für den Zugriff auf confocal Mikroskop. Diese Arbeit wurde unterstützt von der NIH (P30-DK079638, m.b.) und T32HL092332-13, Buchdrucker und m.b., der McNair Medical Foundation (m.b.) und der konfokalen Kern auf das BCM geistigen and Developmental Disabilities Research Center (NIH U54 HD083092 aus dem Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250
Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary PipettesSigma-AldrichA5177
BarnStead NanoPure Nuclease-free waterThermoFisherD119
Borosilicate Capillary TubesSutter InstrumentsGB1007515O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length
CaCl2Sigma-AldrichC5080
Cell-Repellent 96-Well MicroplateGreiner Bio-One650970U-bottom
Centrifuge 5424 REppendorf5401000013
ChloroformSigma-Aldrich233306
Chromogranin-A antibodyAbcamab15160
Compact, Modular Stereo Microscope M60Leica
Countess Automated Cell CounterInvitrogenC10310
Countess Cell Counter SlidesInvitrogenC10312
CryoStar NX70ThermoFisher957000L
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG7528
DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride)Roche10 236 276 001Powder
DBA antibodyVector LabRL-1032
Dispase II, PowderGibco17105041
DMEM/F-12, HEPESGibco11330032
Dnase IInvitrogen18068-015
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools11251-100.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip
EGF (Epidermal growth factor)Sigma-AldrichE9644
Ethanol, 200 ProofDecon Laboratories2716
Forma Steri Cycle CO2 IncubatorsThermoFisher370
Fluoromount-GSouthern BiotechOB10001
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosaSigma-AldrichH3149-10KU
INSM1 AntibodySanta Cruz BioTechnologysc-271408Polyclonal Mouse IgG
IsopropanolFishera4164
Isothesia Isoflurane, USPHenry Schein11695-6776-2
Insulin AntibodyDakoA056401Polyclonal Guinea Pig
KAPA SYBR FAST UniversalKAPA BiosystemsKK4618
KClKaryoMax10575090
KnockOut Serum ReplacementInvitrogen10828028
Leica TCS SPE High-Resolution Spectral ConfocalLeica
MgCl2Sigma-Aldrich442615
Mouse C-Peptide ELISAALPCO80-CPTMS-E01
Mouse Ultrasensitive Insulin ELISAALPCO80-INSMSU-E01
MX35 Microtome BladesThermoFisher3052835
NaClSigma-AldrichS7653
NaHCO3Sigma-AldrichS3817
NaH2PO4Sigma-Aldrich
Normal Donkey SerumJackson Immuno Research017-000-121
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
PBS 1XCorning21-040-CV
Pdx1 antibodyDSHBF6A11Monoclonal Mouse MIgG1
Peel-A-Way Disposable Embedding MoldsVWR15160-157
Penicillin-Streptomycin SolutionCorningMT30002CI
PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate)Sigma-AldrichP1585
Protein LoBind Microcentrifuge TubesEppendorf224310811.5mL Capacity
Recombinant Human FGF-10 ProteinR&D Systems345-FG
Recombinant Human FGF-AcidicPeprotech100-17A
Recombinant Human R-Spondin I ProteinR&D Systems4546-RS
BenchRocker 2DBenchmarkBR2000
Sucrose 500gSigma-AldrichS0389
SuperFrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
Super Pap PenElectron Microscopy Sciences71310
Thermomixer REppendorf05-412-401
Tissue Tek O.C.T. CompoundSakura4583
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
TRIzol ReagentInvitrogen15596018
TrypLE ExpressInvitrogen12604039(1x), no Phenol Red
Trypan Blue StainInvitrogen15250061For cell counting slides
Trypsin-EDTA (0.05%)Corning25-052-CI
Trypsin-EDTA (0.25%)Gibco25200072Phenol Red
Ultra-Low Attachment 24-Well PlateCorning3473
Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-WellCorning4520
Vimentin AntibodyEMD MilliporeAB5733Polyclonal Chicken IgY
Vortex GenieBioExpresS-7350-1
Y-27632 DihydrochlorideR&D Systems1254Also known as ROCK inhibitor
Zeiss 710 Confocal MicroscopeZeiss

Referenzen

  1. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  2. Akkerman, N., Defize, L. H. Dawn of the organoid era: 3D tissue and organ cultures revolutionize the study of development, disease, and regeneration. Bioessays. 39 (4), (2017).
  3. Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs. Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).
  4. Landsman, L., et al. Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development. PLoS Biology. 9 (9), 1001143 (2011).
  5. Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels. Science. 294 (5542), 564-567 (2001).
  6. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  8. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  9. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  10. Xia, Y., et al. The generation of kidney organoids by differentiation of human pluripotent cells to ureteric bud progenitor-like cells. Nature Protocols. 9 (11), 2693-2704 (2014).
  11. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  12. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  13. Loftus, S. K., et al. Acinar cell apoptosis in Serpini2-deficient mice models pancreatic insufficiency. PLoS Genetics. 1 (3), 38 (2005).
  14. Kleeff, J., et al. Chronic pancreatitis. Nat Rev Dis Primers. 3, 17060 (2017).
  15. Murtaugh, L. C., Melton, D. A. Genes, signals, and lineages in pancreas development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).
  16. Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors. Journal of Visualized Experiments. (89), 51725 (2014).
  17. Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140 (21), 4452-4462 (2013).
  18. Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme. Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).
  19. Scavuzzo, M. A., Yang, D., Borowiak, M. Organotypic pancreatoids with native mesenchyme develop Insulin producing endocrine cells. Scientific Reports. 7 (1), 10810 (2017).
  20. Murtaugh, L. C., Stanger, B. Z., Kwan, K. M., Melton, D. A. Notch signaling controls multiple steps of pancreatic differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (25), 14920-14925 (2003).
  21. Nelson, S. B., Schaffer, A. E., Sander, M. The transcription factors Nkx6.1 and Nkx6.2 possess equivalent activities in promoting beta-cell fate specification in Pdx1+ pancreatic progenitor cells. Development. 134 (13), 2491-2500 (2007).
  22. Seymour, P. A., et al. SOX9 is required for maintenance of the pancreatic progenitor cell pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (6), 1865-1870 (2007).
  23. Kawaguchi, Y., et al. The role of the transcriptional regulator Ptf1a in converting intestinal to pancreatic progenitors. Nature Genetics. 32 (1), 128-134 (2002).
  24. Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
  25. Holthofer, H., Schulte, B. A., Spicer, S. S. Expression of binding sites for Dolichos biflorus agglutinin at the apical aspect of collecting duct cells in rat kidney. Cell and Tissue Research. 249 (3), 481-485 (1987).
  26. Reichert, M., et al. Isolation, culture and genetic manipulation of mouse pancreatic ductal cells. Nature Protocols. 8 (7), 1354-1365 (2013).
  27. Winkler, H., Fischer-Colbrie, R. The chromogranins A and B: the first 25 years and future perspectives. Neuroscience. 49 (3), 497-528 (1992).
  28. Burcelin, R., Knauf, C., Cani, P. D. Pancreatic alpha-cell dysfunction in diabetes. Diabetes and Metabolism. 34, 49-55 (2008).
  29. Del Prato, S., Marchetti, P. Beta- and alpha-cell dysfunction in type 2 diabetes. Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 775-781 (2004).
  30. Piciucchi, M., et al. Exocrine pancreatic insufficiency in diabetic patients: prevalence, mechanisms, and treatment. International Journal of Endocrinology. 2015, 595649 (2015).
  31. Campbell-Thompson, M., Rodriguez-Calvo, T., Battaglia, M. Abnormalities of the Exocrine Pancreas in Type 1 Diabetes. Current Diabetes Reports. 15 (10), 79 (2015).
  32. Shivaprasad, C., Pulikkal, A. A., Kumar, K. M. Pancreatic exocrine insufficiency in type 1 and type 2 diabetics of Indian origin. Pancreatology. 15 (6), 616-619 (2015).

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Weitere Artikel entdecken

EntwicklungsbiologieAusgabe 136Bauchspeicheldr seOrganellenBeta ZellenEntwicklungMesenchymDifferenzierungDiabetes3D CulturePancreatoids

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Kontakt

BIBLIOTHEKS-EMPFEHLUNG

JoVE-Newsletter

Forschung

Lehre

Autoren

Bibliothekare

ÜBER JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten