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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
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  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Akuter Anfall Modelle sind wichtig für die Untersuchung der Mechanismen, die epileptiformen Veranstaltungen. Darüber hinaus bietet die Möglichkeit, epileptiformen Ereignisse auf Abruf erzeugen eine äußerst effiziente Methode um die genaue Abfolge der Ereignisse zugrunde liegen ihre Einleitung zu studieren. Hier beschreiben wir die akute 4-Aminopyridine kortikalen Beschlagnahme Modelle Maus und menschlichem Gewebe gegründet.

Zusammenfassung

Anfälle zu kontrollieren, bleibt eine Herausforderung für die Ärzteschaft. Um voranzukommen, brauchen die Forscher einen Weg, um ausgiebig studieren Beschlagnahme Dynamik und ihre zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen. Akuter Anfall Modelle sind bequem, bieten die Möglichkeit, elektrophysiologische Aufnahmen durchzuführen und können eine große Menge von elektrographischen Beschlagnahme-ähnliche (iktalen) Ereignisse generieren. Die vielversprechenden Ergebnisse aus akuten Anfall Modelle können dann zu chronischen Epilepsie Modelle und klinische Studien vorgeschoben werden. So werden studieren Anfälle bei akuten Modelle, die treu die elektrographischen und dynamischen Signaturen eines klinischen Anfalls replizieren für klinisch relevante Ergebnisse. Studieren iktale Veranstaltungen im akuten Anfall Modelle aus menschlichem Gewebe vorbereitet ist auch wichtig für die Herstellung von Erkenntnissen, die klinisch relevant sind. Der Schwerpunkt in diesem Papier ist auf der kortikalen 4-AP-Modell aufgrund seiner Vielseitigkeit in iktalen Ereignisse generieren, in Vivo und in Vitro Studien, sowie Maus und menschlichem Gewebe. Die Methoden in diesem Papier werden auch ein alternatives Verfahren zur Beschlagnahme Induktion mit dem Null-Mg2 + Modell zu beschreiben und bieten einen detaillierten Überblick über die Vorteile und Grenzen der epileptiformen-ähnliche Aktivität erzeugt in den verschiedenen akuten Beschlagnahme-Modelle. Darüber hinaus kann unter Ausnutzung der im Handel erhältlichen optogenetische Mausstämme, eine kurze (30 ms) Lichtpuls zum Auslösen eines iktalen identisch mit denen spontan auftretenden Ereignisses verwendet werden. 30-100 ms Puffs von Neurotransmittern (Gamma-Aminobuttersäure oder Glutamat) können ebenso genutzt werden, um das menschliche Gewebe iktalen Ereignisse ausgelöst, die den spontan auftretenden übereinstimmen. Die neu gewonnene Fähigkeit, die genaue Abfolge der Ereignisse zu beobachten, die Beschlagnahme Einleitung Dynamik zugrunde liegen und effizient bewerten mögliche Anti-Anfall Therapien bietet die Möglichkeit, iktale Ereignisse auf Abruf im akuten Anfall Modelle auslösen.

Einleitung

Akuten Anfall Modelle können erfolgreich reproduzieren elektrographischen Signaturen erinnert an iktalen Ereignisse beobachtet im Elektroenzephalogramm (EEG) von Personen, die einen Anfall zu erleben. Forscher verwenden diese iktalen-ähnliche Ereignisse (im folgenden als "iktale Events" bezeichnet) als Surrogate für die Beschlagnahme Event1. Klinisch, dienen iktale Ereignisse als zuverlässige Proxy für Anfallsgeschehen da Anfälle eine neurologische Erkrankung handelt, die aus dem Gehirn stammen. In der Epilepsie-Überwachungseinheit verlassen Neurologen auf die Erkennung von iktalen Veranstaltungen zum epileptogenen Hirnregion bestätigen und isolieren es für Resektion2. In der Intensivstation überwachen Ärzte iktale Aktivität zu beurteilen, ob Anfallsaktivität in sedierten Patienten3fortbesteht. Anfälle zu kontrollieren, bleibt eine Herausforderung für die Ärzteschaft, da 30 % der Epilepsiepatienten Medikament resistent gegen die verfügbaren Medikamente4,5, und 10 % der medizinischen Fällen, in denen Arzneimittel-induzierte Anfälle sind reagiert nicht auf die standard-Behandlung-3. Dies stellt ein ernstes Problem für die Gesellschaft, wie 10 % der amerikanischen Bevölkerung um eine Beschlagnahme Ereignis in ihrem Leben erleben prospektiert und 3 ist % werden voraussichtlich Epilepsie6zu entwickeln.

Anfälle bei chronischer Epilepsie Modelle zu studieren ist teuer, aufwändig und oft Monate dauern, bis7vorzubereiten. Es ist auch schwierig, elektrophysiologische Aufnahmen in frei beweglichen Tieren durchzuführen. Klinische Studien am Menschen stehen ähnliche Probleme sowie zusätzliche Komplexität im Zusammenhang mit Zustimmung des Patienten, Variabilität der TeilnehmerInnen Hintergründe und die moralischen und ethischen Überlegungen beteiligt8. Akuten Anfall Modelle sind auf der anderen Seite günstig, weil sie relativ bequem zu bereiten, kosteneffiziente und erzeugen große Mengen an iktalen Veranstaltungen für Studie9sind. Darüber hinaus ist das Gewebe in einer stabilen Position fixiert, so sind die Bedingungen ideal für die Durchführung der elektrophysiologischen Aufnahmen notwendig Beschlagnahme Dynamik und der damit verbundenen zugrunde liegende Pathophysiologie zu erforschen. Akuter Anfall Modelle bleiben günstig über in Silico (Computer) Modelle, denn sie basieren auf biologisches Material bestehend aus das Gehirn konstituierenden neuronalen Netzwerk mit all seinen inhärenten Faktoren und synaptischen Verbindungen, die nicht erfasst werden können auch die detaillierte Computer Modelle10. Diese Eigenschaften machen akuten Anfall Modelle bereit, effizientes screening auf mögliche Anti-Anfall-Therapien und die vorläufigen Ergebnisse vor voran sie zur weiteren Untersuchung in chronischen Epilepsie Modelle und klinische Studien werden.

Akuten Anfall Modelle werden in der Regel aus der normalen Hirngewebe abgeleitet, die hyper-erregbare Bedingungen ausgesetzt war. Klinisch relevante iktale Veranstaltungen in gesunden Hirngewebe zu induzieren, ist es wichtig zu verstehen, dass das Gehirn optimal funktioniert in einem kritischen Zustand11 wo Erregung (E) und Hemmung (I) sind ausgewogene12. Eine Störung des E-ich Gleichgewicht zu den hyper-erregbare Beschlagnahme Zustand in dem iktalen Ereignisse überstürzen führen kann. Entsprechend dieser konzeptionellen Rahmen gibt es zwei wichtige Strategien zur iktale Veranstaltungen im Gehirnscheiben (in Vitro) oder im gesamten Gehirn (in Vivo) Vorbereitungen generieren: Hemmung ("Enthemmung") verringert oder erhöht Erregung ("nicht-Enthemmung"). Jedoch iktalen Ereignisse sind sehr geordnet und Ereignisse, die den Einfluss der GABAergen Interneuronen, die neuronale Aktivität13,14orchestrieren erfordern synchronisiert. Aus diesem Grund sind nicht Enthemmung Modelle die wirksamsten für generieren von iktalen Ereignissen in isolierten neuronale Netze, wie z. B. in einem in-vitro- Gehirn schneiden15, während in Vitro Enthemmung Modelle führen häufig zu Spick Aktivität erinnert mich an interiktale erinnernde Spick. Darüber hinaus kann eine momentane Synchronisierung Ereignis in dieser konzeptuellen Rahmen auch zuverlässig eine iktalen Veranstaltung16auslösen. In der Tat kann ein iktalen Ereignis ausgelöst werden, durch jede kleine Störung auf das neurale System17 angewendet, wenn es um einen kritischen Zustand Übergang ("Bifurkation") Punkt18ist. Traditionell wurden diese Störungen durch elektrische Stimulation induziert. Die jüngste Entwicklung der Optogenetik in den Neurowissenschaften, bietet jedoch nun eine elegantere Strategie zur kritischen Zustand Übergänge16induzieren.

In diesem Artikel beschriebenen Methoden veranschaulichen die iktale Ereignisse auf Abruf im akuten Anfall Modelle für in Vitro (Schritt 1 des Protokolls) und in Vivo Studien (Schritt 2 des Protokolls) zu generieren. Sie beinhalten die Wahl der Region des Gehirns, Beschlagnahme Induktionsmethode Studientyp und Arten; im Mittelpunkt werden jedoch auf die empfohlene Wahl eines akuten 4-AP kortikalen Beschlagnahme-Modells wegen seiner Vielseitigkeit in einer Vielzahl von Studientypen. Die akute in-vitro- 4-AP Anfall Modell basiert auf dem Standardprotokoll zur elektrophysiologischen Aufzeichnungen qualitativ hochwertige Gehirnscheiben Vorbereitung und bildgebende Studien19. Diese Protokolle wurden bereits zur in-vitro- koronalen Hirnschnitten von somatosensorischen motorischen Kortex von Mäusen16,Menschen und20 21zu machen. Änderungen in diesen Arten von Gehirnscheiben iktalen Ereignisse generiert wurden zuvor nachgewiesen,16 und die vollständigen Angaben im Protokoll unten beschrieben werden. Akuten in Vivo kortikalen Beschlagnahme 4-AP-Modell basiert auf dem Standardprotokoll darauf vorzubereiten, dass eine Kraniotomie bildgebende Studien22. Die Änderung ist, dass kein (Objektträger) Fenster nach der Kraniotomie installiert ist. Stattdessen sind proconvulsant Mittel (4-AP) topisch angewendet, der exponierten Kortex induzieren iktalen Ereignisse, während das Tier unter Vollnarkose ist. Unseres Wissens war unserer Gruppe der erste dieser akuten in Vivo kortikalen Beschlagnahme-Modell in Mäusen16,23zu entwickeln. Die akute in Vivo 4-AP kortikalen Beschlagnahme vorbereitete Modell von Erwachsenen Mäusen wurde entwickelt, um die in-vitro- Slice-Modell von juvenile Gewebe zu ergänzen. Die Replikation der Ergebnisse in den Erwachsenen in Vivo Beschlagnahme-Modell hilft, um die Ergebnisse von Slice-Modellen zu verallgemeinern, von inhärenten Bedenken hinsichtlich der unphysiologischen Bedingungen einer 2D Gehirn-Scheibe (im Vergleich zu einem 3-d ganz-Gehirn Struktur) und die physiologischen Unterschiede zwischen juvenilen und adulten Gewebes.

Die Methode der bedarfsgesteuerte iktalen Veranstaltung Einleitung wird demonstriert mit entweder Puffs von Neurotransmitter mit Picospritzer oder optogenetische Strategien. Nach bestem Wissen und gewissen ist unsere Fraktion der erste, der im menschlichen Gewebe mittels Neurotransmitter über einen Picospritzer16iktalen Ereignisse auslösen. Optogenetische Strategien ist die C57BL/6 Mäusen Belastung der konventionellen Belastung für transgene Ausdruck verwendet. Die Expression des Channelrhodopsin-2 (ChR2) in GABAergen Interneuronen oder glutamatergen Pyramidenzellen bieten die optionale Möglichkeit, iktale Ereignisse bei Bedarf kurze Lichtpulse erzeugen. Geeignete optogenetische Mäuse Stämme gehören die im Handel erhältliche C57BL/6-Variante, die ChR2 in beiden Interneuronen, mit der Maus vesikuläre GABA-Transporter promotor (VGAT)24oder Pyramidenzellen, mit der Maus-Thymus-Zell-Antigen 1 drückt Promotor (Thy1)25. Diese handelsüblichen VGAT-ChR2 und Thy1-ChR2 Mäuse bieten die Möglichkeit, GABAergen Neuronen oder glutamatergen Neuronen in der Großhirnrinde mit blau bzw. aktivieren (470 nm) Licht. Die Fähigkeit, iktale Events auf Abruf im akuten Anfall Modelle generieren kann neuartige Möglichkeiten zur Beschlagnahme Einleitung Dynamik zu studieren und effizient bewerten mögliche Anti-Anfall Therapien anbieten.

Protokoll

Alle Forschung an Patienten wurde unter ein Protokoll genehmigt durch University Health Network Research Ethik Board in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt. Verfahren, bei denen Tiere wurden im Einklang mit den Leitlinien des Canadian Council on Animal Care und von Krembil Research Institute Animal Care Committee genehmigt.

1. Protokoll I: akut In Vitro Modell der Beschlagnahme

  1. Vorbereitung der Dissektion Lösungen und künstliche Liquor cerebrospinalis
    1. Carbogenate Reinstwasser (das Wasser gefiltert mit einem Widerstand von 18,2 MΩ·cm) mit Carbogen (95 % O25 % CO2) für 5 min mit Luft Stein Blase Diffusoren (Belüfter für Aquarien).
      Hinweis: Air Steinen können mit Carbogen Tank Regler über standard Silikonschlauch verbunden sein. Wenn Luft Steinen nicht verfügbar sind, Siegel schließen Ende der Silikonschlauch und stecken kleine Löcher in der Dichtung Carbogen Gas zu brodeln, und Carbogenate die Lösung zu ermöglichen.
    2. Bereiten Sie eine Dissektion Lösung durch Auflösen der solute von Tabelle 1 in Reinstwasser. Eine Lösung, die Carbogenated für mindestens 5 min, es lösen zu helfen wurde fügen Sie CaCl2 hinzu .
      Hinweis: Alternativ fügen Sie CaCl2 zuerst hinzu, so dass es leicht in eine ungesättigte Lösung auflösen kann. Die Lösung in flüssiger Form, sollte sein 300-320 mOsm/L und haben einen pH-Wert von 7,4 nach mit Carbogen gesättigt.
      1. Chill die Dissektion Lösung für 0 - 4 ° C. Lassen Sie die Lösung im Kühlschrank über Nacht oder legen Sie die Lösung in den Gefrierschrank für 1 h und kontinuierlich überwachen Sie die Temperatur zu.
        Hinweis: Die Dissektion Lösung kann für bis zu 3 Nächte aufbewahrt werden; danach entsorgen.
      2. Carbogenate die Dissektion Lösung für 5 bis 10 min vor Gebrauch.
        Hinweis: Im Idealfall die Lösung erscheint entweder als Matsch oder werden um vor dem Gebrauch slush Übergang.
    3. Bereiten Sie Nagetier künstliche Liquor cerebrospinalis (ACFS) durch Auflösen der gelösten Stoffen aus Tabelle 2 (oder Tabelle 3 für menschliche ACFS), Reinstwasser. Carbogenate ist die ACFS Lösung während es in einem Wasserbad bis zum Gebrauch auf 35 ° C erhitzt. Eine Lösung, die Carbogenated für mindestens 5 min, es lösen zu helfen wurde fügen Sie CaCl2 hinzu .
      Hinweis: Alternativ fügen Sie CaCl2 zuerst damit es leichter in eine ungesättigte Lösung auflösen kann hinzu. Die Lösung, in flüssiger Form, sollte sein 290-320 mOsm/L und haben einen pH-Wert von 7,4 nach gesättigt mit Carbogen. Lösungen sollten in 1, 2 oder 4 L Volumen abhängig von der Dauer der Experimente vorgenommen werden. 4 L für einen ganzen Tag (8 h) Experimente zu machen. Der ACFS sollten werden frisch zubereitet jeden Tag; Lagern Sie es nicht länger als 1 d.
  2. Maus-Dissektion, Hirngewebe zu sammeln
    Hinweis: Fahren Sie mit dem nächsten Schritt (Schritt 1.3) darauf Gehirnscheiben mit der Vibratome für menschliches Gewebe. Der Neurochirurg mit Verfahren beschriebenen26,27sollte die würfelförmige Blöcke (1 cm3) des Gehirngewebes eingeholt werden.
    1. Sammeln Sie alle Werkzeuge und Materialien, die für tierische Sezierungen. Richten Sie den Arbeitsbereich zur Vorbereitung der tierischer Sezierungen.
      1. Überprüfen Sie den Tank Carbogen (95 %O2/5%CO2), um sicherzustellen, dass sie nicht leer ist. Ersetzen Sie die Gasflasche vor Experimenten, ist weniger als 500 Psi Druck bleiben.
      2. Kalibrieren der Vibratome (schwingenden Klinge Gewebe Slicer) gemäß Bedienungsanleitung des Herstellers. Passen Sie die Vibratome festlegen auf eine schneiden Amplitude von 1 mm und einer Schnittgeschwindigkeit von 0,12 mm/s haben.
        Hinweis: Die optimalen Einstellungen können für jede einzelne schwingende Gewebe Stabmesser abweichen; jedoch im Allgemeinen die Amplitude sollte hoch sein und die Schnittgeschwindigkeit sollte niedrig sein.
      3. ACFS Gehirn Slice Inkubation Kammer (d.h. der Gehirn-Scheibe-Keeper) einfüllen und mit Carbogen bubble. Legen Sie die Inkubation Kammer in einem Wasserbad bei 35 ° c eingestellt
        Hinweis: Verwenden Sie Nagetier ACFS für Nager Gehirnscheiben und menschlichen ACFS für menschliche Gehirnscheiben.
    2. Erhalten Sie eine juvenile Maus beiderlei Geschlechts im Alter von 13 d (p13) bis 21 d (p21, wo p0 das Datum der Geburt ist).
    3. Betäuben Sie die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Natrium-Pentobarbital (55 mg/kg Körpergewicht). Sobald die Maus tief betäubt ist, wie durch das Fehlen der Zehe Prise Reflex angegeben, verwenden Sie sofort einen Tierarzt genehmigt Guillotine, um die Maus in einer schnellen Bewegung zu enthaupten.
      Hinweis: Bereiten Sie die Natrium-Pentobarbital-Injektion nach dem Verfahren von institutionellen Richtlinien empfohlen.
    4. Halten Sie die Maus Nase zu stabilisieren den abgeschlagenen Kopf und sanft zu einer Mittellinie Schnitt ab zwischen der Maus Augen und über die gesamte Länge der Kopfhaut, den Schädel verfügbar zu machen. Sicherstellen Sie, dass der Schädel durch den Anpressdruck der Rasierer nicht komprimiert ist. Verwenden Sie die Ecke des Messers Schneide um schneiden Präzision zu erhöhen.
    5. Auseinander klappen die Maus Kopfhaut mit Fingern, um den Schädel verfügbar zu machen. Verwenden Sie dann die frische Ecke der Rand des Rasiermessers, um einen Schnitt entlang der Mittellinie des Schädels zu machen; Achten Sie besonders auf jeglichen Kontakt mit der Großhirnrinde zu vermeiden.
    6. Legen Sie Splitter Pinzette in die Maus Augenhöhlen zu stabilisieren den abgeschlagenen Kopf und legen Sie sie in eine Petrischale gefüllt mit kaltem (0 - 4 ° C) Dissektion Lösung. Sicherstellen Sie, dass der Kopf vollständig in die Dissektion Lösung untergetaucht ist.
    7. Verwenden Sie eine zweite Reihe von Splitter Pinzette vorsichtig ziehen Sie die Maus Kopfhaut, entfernen das Nasenbein durch schälen, und entfernen Sie die Rückseite (kaudalen Seite) des Schädels.
      Hinweis: Die Nase Knochen von jungen Mäusen ist sehr weich und leicht gebrochen.
    8. Mit einem Spatel Mikro um den Sehnerven Trigeminal Nerven und Rückenmark zu schneiden. Verwenden Sie dann den Mikro Spatel sanft das Gehirn aus dem Schädel trennen. Lassen Sie das Gehirn vollständig untergetaucht in der Petrischale mit Dissektion Lösung gefüllt.
  3. Vorbereitung der kortikalen Scheiben aus somatosensorischen motorischen Kortex
    1. Füllen Sie die Vibratome Puffer Tablett mit ~ 150 mL kalten (0 - 4° C) Dissektion Lösung.
      Hinweis: Bewahren Sie optional das Puffer-Tablett in den Gefrierschrank bis in das slicing Verfahren weiterhin eine niedrige Temperatur benötigt.
    2. Kleben Sie das Hirngewebe von Maus oder Mensch auf die Vibratome Bühne (Inhaber/Probentablett) mit Sekundenkleber Klebstoff. Geschnitten Sie für Mäuse einen kleinen kaudalen Teil des Gehirns (d.h. das Kleinhirn ab), so dass es leicht flach auf der Probenhalter (so dass die rostral Seite des Gehirns vor der Decke) geklebt werden kann.
      Hinweis: Alternativ, horizontale Maus Gehirnscheiben zubereitet werden durch Verkleben der dorsalen Seite des Gehirns auf die Probenhalter (die ventrale Seite des Gehirns sollte die Decke zeigen)28.
    3. Sanft lege Probenhalter (mit Hirngewebe) in das Fach ein Puffer. Sicherstellen Sie, dass die dorsale Teil des Gehirns der Vibratome Klinge gegenübersteht.
      Hinweis: Es ist entscheidend für die Höhe der Zeit zu minimieren, die das Gehirn der Luft ausgesetzt ist.
  4. Gehirn Gewebe schneiden und Sammlung
    1. Schneiden Sie das Gehirn in 450 μm dicke Scheiben mit der Vibratome in die dorsale, ventrale Richtung. Stellen Sie sicher, dass das Gehirn vollständig verankert, das Probentablett beim Schneiden bleibt.
      1. Machen Sie den ersten Schnitt in das Gehirn der Maus, den Riechkolben zu entfernen. Dann kürzen Sie nachfolgende, bis die somatosensorische Motor Bereich beobachtet wird (befindet sich etwa auf halbem Weg zwischen den Riechkolben und Bregma).
        Hinweis: Optional, schneiden Sie das Gehirn in dünnere Scheiben schneiden (200 μm) bis Corpus Callosum erscheint in der koronale Ansicht des Gehirns, gibt an, dass der somatosensorischen Motor Bereich enger ist.
    2. Verwenden Sie eine weite Bohrung Transferpipette koronale Scheiben (450 μm) zu sammeln, die enthalten Bereich somatosensorischen Motor und Tauchen sie in eine Petrischale mit Kälte (0 - 4 ° C) Dissektion Lösung.
    3. Verwenden Sie eine neue Rasierklinge und überschüssiges Gewebe von den Scheiben abschneiden. Für koronalen Scheiben von Mäusen durchführen einer quer Schnitt direkt unterhalb der neokortikalen Kommissur (d.h., Corpus Callosum). Schneiden Sie nicht in einer Sägen Bewegung; einfach üben Sie Druck auf die Klinge in das Gewebe und mit einer Detaillierung Pinsel sanft das Gewebe zu trennen. Achten Sie darauf, die Bewegung des koronalen Slice zu minimieren.
    4. Verwendung einer weite Bohrung Transferpipette den dorsalen Teil der koronalen Scheiben übertragen, die den Neocortex (Schicht 1-6) zu einer zweiten Petrischale enthalten mit warmen (35 ° C) ACFS für einen Moment gefüllt (~ 1 s). Übertragen Sie anschließend sofort die Scheiben auf einer Inkubation Kammer mit warmen (35 ° C) Carbogenated ACFS.
      Hinweis: Für den Transfer in die Petrischale mit ACFS soll die Übertragung der Dissektion Lösung zur Inkubation Kammer zu minimieren, während der Übertragung Gehirnscheiben mit der Wide-Bohrung-Pipette. Nutzen Sie der Inkubation Kammer mehrere Brunnen zu verschiedenen Gehirnscheiben organisiert.
    5. Verwerfen Sie den Rest des Gehirns und des Schlachtkörpers nach den institutionellen Richtlinien.
  5. Inkubation und Wartung
    1. Lassen Sie die Gehirnscheiben leicht unter Wasser in der Kammer Inkubation bei 35 ° C für 30 Minuten. Dann nehmen Sie Inkubation Kammer aus dem Wasserbad und lassen Sie es auf Raumtemperatur (20-25 ° C) zurück. Warten Sie 1 h für den Gehirnscheiben zu erholen bevor Sie elektrophysiologische Aufnahmen durchführen.
      Hinweis: Sicherstellen Sie, dass keine Luftblasen, die unter den Gehirnscheiben in der Inkubation Kammer zu sammeln. Luftblasen sind Luftschnittstellen, die Gewebeschäden verursachen. Die Maus Gehirnscheiben pflegbar für 6-8 h, während menschliche Gehirngewebe für bis zu 24 h in einer gut-Carbogenated Inkubation Kammer mit den entsprechenden ACFS gespeichert werden kann.
  6. Elektrophysiologische Aufnahmen der oberflächlichen kortikale Schicht
    Hinweis: Iktalen Ereignisse werden in der extrazellulären lokalen potentiellen (LFP) Feldaufnahmen aus Gehirnscheiben beobachtet. Die LFP des Gehirns Slice kann beobachtet und aufgezeichnet mit einer Schnittstelle Typ Kammer29 oder einem untergetauchten Multi-Elektroden-Array (MEA) System16. Das Verfahren wurde bisher beschriebenen16 und weitere Details werden unten beschrieben.
    1. Verwenden Sie eine weite Bohrung Transferpipette oder Detaillierung Pinsel um zu bewegen eine Gehirn-Scheibe auf etwas größeren vorgeschnittenen Linsenpapier stattfindet mit einer zahnärztlichen Pinzette. Übertragen Sie das Objektiv-Papier (das Gehirn-Scheibe auf ruht) zur Aufnahme Kammer und befestigen Sie es mit einer Harfe-Bildschirm.
    2. Laufen Warm (35 ° C), Carbogenated ACFS Perfusat durch die Aufnahme Kammer über die Gehirn-Scheibe mit einer Rate von 3 mL/min (~ 1 Tropfen/s). Ein digitales Thermometer zu verwenden, um sicherzustellen, dass die Aufnahme Kammer 33-36° C.
    3. Ziehen Sie Glaselektroden mit einer Impedanz von 1-3 MΩ aus Borosilikat-Glasröhren (mit einem äußeren Durchmesser von 1,5 mm) mit einem Abzieher. Abgleich der Glaselektroden mit ACFS (~ 10 µL) mit einer Spritze Hamilton. Sofort die Elektrode zu verwerfen, wenn die Spitze beschädigt ist.
      Hinweis: Bleach Silberdraht (5 min) und lassen nur einen minimalen Teil (d.h. die Spitze) von Silberdraht, in der ACFS Rücken gefüllt Glaselektroden, Lärm und treiben während der Aufnahmen zu minimieren eingetaucht werden. Entfernen Sie alle überschüssigen ACFS aus der Glaselektrode mit einer Hamilton-Spritze bei Bedarf.
    4. Verwendung ein 20 X Stereo-Mikroskop genau Guide der Aufnahme Glaselektrode in den oberflächlichen kortikale Schicht (2/3) mit manuelle Manipulatoren. Datensatz/Ansicht die elektrische Aktivität des Gehirns Slice auf einem Computer mit standard-Software.
      Hinweis: Tragfähige (qualitativ hochwertigen) Gehirnscheiben werden eine robuste evozierten Potentiale als Reaktion auf die angewandte elektrische Reize (100 µs, 30-300 μA) oder Lichtimpulse (30 ms, 10 mW/mm2) für optogenetische Gewebe aufweisen.
  7. Induktion der Beschlagnahme-ähnliche Aktivitäten
    1. Perfundieren Sie ACFS mit 100 µM 4-Aminopyrimidine (4-AP) über das Gehirn-Scheibe. 80 mg 4-AP in 8,5 mL Wasser eine Stammlösung von 100 mM 4-ca. 100 mL ACFS ein ACFS Perfusat mit 100 µM zu erreichen 100 µL der Stammlösung 100 mM 4-AP hinzufügen 4-AP zu lösen.
      Hinweis: Alternativ können Sie Null-Mg2 + ACFS (Tabelle 4), eine modifizierte ACFS Lösung, enthält keine zusätzlichen Mg2 +, Technologieprodukte der Gehirn-Scheibe. Verwenden Sie für menschliches Gewebe eine Kombination von 100 µM 4-AP in Null-Mg2 + menschliche ACFS (Tabelle 5), um optimale Ergebnisse zu erzielen. Die durchschnittliche Zeit für iktalen Ereignisse angezeigt ist 15 min; Allerdings dauert es bis zu 40 min für einige Gehirnscheiben.
  8. Anforderungs-Anfall-Generation: eine optogenetische Strategie für optogenetische Mäuse
    1. Wenden Sie einen kurzen (30 ms) Puls blau (470 nm) Licht (mit einer mindestens 1 mW/mm2 Ausgangsintensität) zu einer iktalen-Ereignis ausgelöst. Verwenden Sie einen manuelle Manipulator, um eine 1.000 µm Kern Durchmesser Lichtleitfaser (0,39 NA) direkt über dem Aufnahme-Region zu positionieren.
      Hinweis: Stellen Sie die Rate der Foto-Stimulation entsprechend der gewünschte Rate des iktalen Ereignisses (d.h., 1 Puls alle 50 s). Allerdings kann nicht die Rate übermäßig von der intrinsischen Rate übertrieben werden, an dem iktalen Ereignisse eintreten.
  9. Anforderungs-Anfall-Generation: eine nicht-optogenetische-Strategie für menschliches Gewebe
    1. Positionieren Sie die Gehirn-Scheibe so, dass die oberflächlichen Schichten vorgelagerte sind, und die tiefen Schichten stromabwärts zu den Fluss der Perfusat durch die Aufnahme-Kammer sind.
    2. Ziehen Sie eine Glaselektrode (vom gleichen Typ wie für den LFP-Aufnahmen) und berühre sanft ihre Spitze mit einer heiklen Aufgabe Wischer erstelle ich eine kleine Öffnung. Abgleich der Elektrode mit ~ 25 µL 100 mm GABA (aufgelöst in Wasser) und an der Picospritzer befestigen. Alternativ Hinterfüllung der Elektrode mit 200 µM Glutamat (in Wasser aufgelöst).
      Hinweis: Um das Volumen wird aus dem Picospritzer (~ 50 µL) aufgeblasen zu schätzen, gelten Sie einen Test-Zug auf einer Kunststoffplatte (vorzugsweise gerasterten). Wenden Sie dann einen Tropfen des bekannten Volumes (d.h., 10 µL, 20 µL, 50 µL oder 100 µL) mit einer Pipette für einen Vergleich mit dem Test-Zug.
    3. Bewerben Sie Puffs von Neurotransmitter (GABA oder Glutamat) des menschlichen Gewebes mit einer Picospritzer (10-20 Psi für 30-100 ms) ein iktalen-Ereignis ausgelöst. Wenden Sie einen einzigen Zug von 100 mM GABA auf der tiefen Schicht (5) des Hirngewebes iktalen Ereignisse in der oberflächlichen Schicht zu generieren (2/3). Alternativ wenden Sie einen einzigen Zug von 200 µM Glutamat direkt auf die oberflächliche Schicht iktalen Ereignisse in der oberflächlichen Schicht zu generieren.
      Hinweis: Stellen Sie die Rate der Picospritzer Zug entsprechend der gewünschte Rate des iktalen Ereignisses (d.h., 1 Puls alle 50 s). Allerdings kann nicht die Rate übermäßig von der intrinsischen Rate übertrieben werden, an dem iktalen Ereignisse eintreten.

2. Protokoll II: Akute In Vivo Beschlagnahme Modell

  1. Chirurgische Vorbereitung und Operation
    1. Erhalten einer erwachsenen Maus (p35 - p60) beiderlei Geschlechts.
    2. Betäuben Sie tief Maus mit Ketamin (95 mg/kg) und Xylazin (5 mg/kg). Führen Sie die Zehe-Prise-reflex-Test um sicherzustellen, dass die Maus sediert ist. Alternativ verwenden Sie Isofluran (4 % für Induktion, 1,5-2 % für Chirurgie), um die Maus zu betäuben.
      Hinweis: Die Wahl von Anästhetika kann die Beschlagnahme Aktivität30,31auswirken.
    3. Montieren Sie die Maus in einer stereotaktischen Rahmen durch die Sicherung den Kopf mit Ohr-Bars. Legen Sie eine beheizte Pad unter der Maus für die Dauer der Operation.
    4. Rasieren Sie die Maus-Kopf mit einem Nagetier Trimmer auf um die Kopfhaut zu entlarven. Injizieren Sie 0,3 mL Lidocain mit einem 25 5/8 Zoll Nadel in das Periost, starke Blutungen oder Schmerzen zu vermeiden. Die Maus Augen, damit sie nicht austrocknen während des Experiments zuweisen Sie Augensalbe.
    5. Kneifen Sie und heben Sie das Zentrum von der Maus Kopfhaut zu beurteilen, ob seine Reflexe verschwunden sind. Anschließend führen Sie eine horizontale geschnitten, um die Bregma, Lambda-Region des Schädels aussetzen. Kratzen Sie sanft die gesamte exponierten Bereich des Schädels mit einem Wattestäbchen auf eine trockene Oberfläche zu erstellen.
    6. Führen Sie eine Kraniotomie von 4 mm Durchmesser an Koordinaten 2,0 mm Lateromedial und-2,00 mm Rostrocaudal somatosensorischen Cortex verfügbar machen. Markieren Sie die Stelle mit einem Kreis (4 mm Durchmesser) mit einem permanent-Marker. Bohrer im Kreis herum mit einem pneumatischen Zahnbohrer bis die verbleibenden Schicht des Knochens Kraniotomie weicht leicht nach unten gedrückt. Beantragen Sie Kochsalzlösung auf die Schicht des Knochens vor Entfernen der Kraniotomie mit Splitter-Pinzette. Anschließend warmen Kochsalzlösung auf die exponierten Bereich anwenden.
  2. Aufnahmemethoden und chemische Induktion von Anfällen
    1. Ziehen Sie Glaselektroden mit einer Impedanz von 1-3 MΩ aus Borosilikat-Glasröhren (mit einem äußeren Durchmesser von 1,5 mm) mit einem Abzieher. Backfill Spritze die Glaselektroden mit ~ 10 µL ACFS oder Kochsalzlösung mit einer Hamilton. Sofort die Elektrode zu verwerfen, wenn die Spitze beschädigt ist.
      Hinweis: Bleach Silberdraht (5 min) und lassen nur einen minimalen Teil (d.h. die Spitze) von Silberdraht, in der ACFS Rücken gefüllt Glaselektroden, Lärm und treiben während der Aufnahmen zu minimieren eingetaucht werden. Entfernen Sie alle überschüssigen ACFS aus der Glaselektrode mit einer Hamilton-Spritze bei Bedarf.
    2. Verwenden Sie einen manuelle Manipulator um der Glaselektrode in den oberflächlichen kortikalen führen Schicht (2/3) im Bereich somatosensorischen-Motor. Datensatz/Ansicht die elektrische Aktivität des Gehirns Slice auf einem Computer mit standard-Software.
      Hinweis: Layer 2/3 ist ca. 0,3 mm tief von der Oberfläche32.
    3. Aktuell gelten Sie ~0.5 mL 1,5 mM 4-AP Kochsalzlösung auf die exponierten Kortex der Maus mit einer Spritze, bis sie vollständig die Kraniotomie bedeckt. 14 mg 4-AP in 100 mL isotonische Kochsalzlösung eine Stammlösung von 1,5 mM 4-AP Kochsalzlösung zu lösen.
      Hinweis: Bereiten Sie die 4-AP-Kochsalzlösung bevor das Experiment beginnt. Iktale Veranstaltungen erscheinen im Durchschnitt 15-30 min nach topischer Anwendung.
  3. Bedarfsweckung von Anfällen bei optogenetische Mäusen
    1. Wenden Sie einen kurzen (30 ms) Puls blau (470 nm) Licht (mit einer mindestens 10 mW/mm2 Ausgangsintensität) zu einer iktalen-Ereignis ausgelöst. Verwenden Sie einen manuelle Manipulator, um eine 1.000 µm Kern Durchmesser Lichtleitfaser (0,39 NA) direkt über dem Aufnahme-Region zu positionieren.
      Hinweis: Stellen Sie die Rate der Foto-Stimulation entsprechend der gewünschte Rate des iktalen Ereignisses (d.h., 1 Puls alle 300 s). Allerdings kann nicht die Rate übermäßig von der intrinsischen Rate übertrieben werden, an dem iktalen Ereignisse eintreten.

Ergebnisse

Die Anwendung von 100 µM 4-AP, gute Qualität (unbeschädigt) 450 µm Größe kortikalen Gehirnscheiben aus eine juvenile VGAT-ChR2 zuverlässig induzierte wiederkehrende iktalen Mausereignisse (> 5 s) innerhalb von 15 min (Abbildung 1Ai). Die Anwendung von 100 µM 4-AP auf Scheiben von schlechter Qualität führte zu platzen Ereignisse oder Spick Aktivität (Abbildung 1Aii). Durchschnittlich 40 % der Scheiben von jeder seziert ...

Diskussion

Die Gehirnscheiben werden mit ein proconvulsant Medikament oder eine veränderte ACFS Perfusat die neuronale Erregbarkeit erhöhen und fördern einen Niederschlag von iktalen Veranstaltungen (elektrographischen Beschlagnahme-ähnliche) behandelt. Für Mäuse sollte die bevorzugte koronalen Scheiben des Bereichs somatosensorischen Motor cingulären Kortex, Bereich 2 (CG), nicht aber die Retrosplenial (RS); Diese anatomischen Markierungen helfen, das Spektrum der koronalen Scheiben zu identifizieren, die am besten zur Indu...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der Canadian Institutes of Health Research (119603, Peter L. Carlen und Taufik A. Valiante MOP), dem Ontario Brain Institute (zu Taufik A. Valiante) und der Mightex Student Research Grant (nach Michael Chang) unterstützt. Wir möchte Liam Long für seine Hilfe bei Dreharbeiten zu das video Manuskript danken. Wir würden gerne Paria Baharikhoob, Abeeshan Selvabaskaran und Shadini Dematagoda für ihre Unterstützung bei der Erstellung der Abbildungen und Tabellen in dieser Handschrift zu erkennen. Abbildungen 1A, 3A, 4Aund 6A sind alle ursprünglichen Figuren aus Daten in Chang Et Al. veröffentlicht 16.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Sodium pentobarbitalN/AN/APurchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
1 mm syringeN/AN/APurchased through UT Med Store
25G 5/8” sterile needleN/AN/APurchased through UT Med Store
Single edge razor blade (2x)N/AN/APurchased through UT Med Store
Instant adhesive glueN/AN/APurchased through UT Med Store
Lens paperN/AN/APurchased through UT Med Store
Glass petri dish (2x)N/AN/APurchased through UT Med Store
Splinter forceps (2x)N/AN/APurchased through UT Med Store
PVC handle micro spatulaN/AN/APurchased through UT Med Store
Micro spoon with flat endN/AN/APurchased through UT Med Store
Detailing brush 5/0N/AN/APurcahsed from a boutique art store
Wide bore transfer pipetteN/AN/APurchased through UT Med Store
Dental TweezerN/AN/APurchased through UT Med Store
Thermometer (digital)N/AN/APurchased on Amazon.ca
Check carbogen tank (95%O2/5%CO2) N/AN/APurchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
VibratomeLeicaN/APurchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
brain slice incubation chamber (a.k.a. brain slice keeper) Scientific Systems Design IncN/A
Sodium Chloride (NaCl)N/AN/APurchased through UT Med Store
Sodium BicarbonateN/AN/APurchased through UT Med Store
DextroseN/AN/APurchased through UT Med Store
Potassium Chloride (KCl)N/AN/APurchased through UT Med Store
Magnesium Sulfate (MgSO4 H2O)N/AN/APurchased through UT Med Store
Sodium phosphate monobasic monohydrate (HNaPO4·H2O)N/AN/APurchased through UT Med Store
Calcium Chloride (CaCl2·2H2O)N/AN/APurchased through UT Med Store
SucroseN/AN/APurchased through UT Med Store

Referenzen

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