Isolation und Decellularization eine ganze Schweine Pankreas

Zusammenfassung

Gewebe-Engineering der gesamten Bauchspeicheldrüse ist eine Herausforderung, weil die exokrinen und endokrine Funktionen. Wir zeigen eine Methode für die Zerlegung einer intakten Schweinen der Bauchspeicheldrüse und der Prozess der erfolgreichen Decellularization von Perfusion von Waschmitteln Triton x-100, Natrium Deoxycholate und Deoxyribonuclease.

Zusammenfassung

Gewebe-Engineering der gesamten Bauchspeicheldrüse kann aktuelle Behandlungsmethoden für Diabetes Mellitus verbessern. Das Endziel ist Gewebe Ingenieur Pankreas von einer allogenen oder xenogene Quelle mit menschlichen Zellen. Eine Demonstration der Methoden für die effiziente Dissektion, Decellularization und Recellularization von Schweinen Bauchspeicheldrüse könnte Bereich profitieren. Ähnlich wie menschliche Bauchspeicheldrüsen porcinen Bauchspeicheldrüsen haben eine spezielle anatomische Anordnung mit drei Lappen (Milz, Zwölffingerdarm, und Verbindung) abgerundet durch den Zwölffingerdarm und Dünndarm. Der Zwölffingerdarm Lappen der Bauchspeicheldrüse verbindet sich mit den Zwölffingerdarm durch mehrere kleine Blutgefäße. Gewebe-Engineering der Bauchspeicheldrüse ist exokrine und endokrine naturgemäß kompliziert. In diesem Beitrag zeigen wir ein detailliertes Protokoll zu zerlegen die ganze Schweine Pankreas und decellularize es mit Reinigungsmitteln und sparen Sie dabei seine Struktur und einige Komponenten der extrazellulären Matrix. Um komplette Perfusion zu erreichen, wird die Aorta als Einlauf und die Pfortader als Outlet gewählt. Andere Blutgefäße (leberarterie, Milz Vene, Milz Arterie, mesenterialen Arterie und Vene Baum) und der Gallengang sind ligiert. Um die Bildung von Thromben zu verhindern, das Schwein ist heparinisierten und unmittelbar nach Dissektion, die Orgel ist mit kalten Heparin gespült. Um die Wirkung der exokrinen Enzyme hemmen, ist die Bauchspeicheldrüse Decellularization bei 4 ° c eingestellt. Die Decellularization erfolgt durch Perfusion der Triton x-100, Natrium Deoxycholate und Deoxyribonuclease, mit einer intermittierenden und letzte umfangreiche waschen. Mit einem erfolgreichen Decellularization die Bauchspeicheldrüse erscheint weiß, und eine histologische Auswertung mit Hämatoxylin und Eosin zeigt keine Kerne mit einer erhaltenen extrazelluläre Matrix-Struktur. Somit kann die vorgeschlagene Methode erfolgreich zu sezieren und decellularize ganze Schweine Pankreas verwendet werden.

Einleitung

Diabetes Mellitus ist gekennzeichnet durch das Vorhandensein von erhöhte Konzentration von Glukose im Blut. Es wird als eine wichtige gesundheitspolitische Herausforderung in den meisten Ländern¹erkannt. Hohe Konzentrationen von Glukose im Blut beeinflussen die Blutgefäße und Nervensystem, was zu Schäden an den Augen, das Herz und die Nieren und Extremität Ischämie. Traditionelle Methoden der Behandlung gehören Injektionen von exogenen Insulins, Drogen und Änderungen des Lebensstils. Abgesehen von einer Heilung für die Krankheit in einigen Fällen, nicht verfügbare Behandlungen das Insulin auf therapeutische Ebenen, wodurch Hyperglykämie zu pflegen. Obwohl die Transplantation von Inseln oder ganze Bauchspeicheldrüse Krankheit beseitigt, ist es nicht allgemein durch einen Mangel an geeigneten Spenderorganen und wegen der Risiken und Schwierigkeiten von Immunsuppression und Kapselung²getan.

Aktuelle Verbesserungen im Bereich des Tissue engineering und regenerativer Medizin besitzen die Fähigkeit zur Bereitstellung einer Lösung für diese Probleme. Mit der Technik des Decellularization das Zellmaterial von einem menschlichen oder tierischen Spender entfernt werden, während die Proteine wichtig extrazelluläre Matrix (ECM), Wachstumsfaktoren, und Signalmoleküle sind in das Gerüst erhalten. Solche Gerüste können möglicherweise ohne die Notwendigkeit einer Immunsuppression, die Orgel nach Recellularization mit dem des Empfängers nicht immunogen Stammzellen^3,4Wiederherstellung verpflanzt werden. Tissue-engineering Organe aus allogene und xenogene Quellen können in klinische Transplantation verwendet werden, wie die großen extrazellulären matrixproteine unter Arten konserviert sind und nicht nach Transplantation⁵abgelehnt werden könnte.

Decellularization ist eine gut erforschte Methode, die die optimale Nutzung der physikalischen Kräfte, chemischen Reinigungsmitteln und Enzyme in einem physiologischen Rahmen, Zellen und Kernmaterial aus einem Gewebe oder Organ zu entfernen. Recellularization ist ein Verfahren der Aussaat Zellen wieder in die azellulären Orgel. Es ist eine intellektuell schwierige Verfahren erfordern eine große Anzahl von Zellen, eine optimale Zelle-säen-Strategie und ein bioreaktorsystem für die Kultur des Organs an physiologisch akzeptablen Bedingungen wie Temperatur, Druck und Gase⁶.

Die Bauchspeicheldrüse kann eine anspruchsvolle Gewebe für das Tissue Engineering wegen der exokrinen und endokrinen Kapazitäten gelten. Die exokrine Gewebe sondert verschiedene Verdauungsenzyme, während der endokrine Teil Hormone, einschließlich Insulin absondert. Die Decellularization der intakte Bauchspeicheldrüsen von Maus^7,8, menschliche⁹und Schwein¹⁰ hat bereits berichtet worden, mit Hilfe von Enzymen (Trypsin, Deoxyribonuclease [DNase]) und nicht-ionische (Triton x-100) und Ionischen Detergentien ( Natrium Deoxycholate [DEZA] und Sodium Dodecyl Sulfat [SDB]). Jedoch nach den veröffentlichten Protokollen kämpfen wir mit einem erfolgreichen Dissektion und komplette Perfusion und Decellularization unter Beibehaltung einer ECM-Struktur. Wir vermuteten, dass die verwendeten Reinigungsmittel während der Decellularization Lyse der Zellen, verursachen dadurch Freisetzung von Verdauungsenzymen in der Orgel. Die freigesetzten Enzymen werden eine irreversible Schäden an das ECM-Gerüst und ineffizient für Decellularization und Recellularization zu machen. Eine Design der Methode, die effektiv Bauchspeicheldrüse decellularizes während die Aktion von Verdauungs-Enzymen hemmen kann das Problem lösen. Wir entschieden uns für die Strategie der Peloso Et Al., der Decellularization der Bauchspeicheldrüse bei kalten Temperaturen, obwohl sie nicht auf, warum Kälte verwendet⁹melden. Zur gleichen Zeit haben wir eine Dissektion Strategie mit Modifikationen von Taylor Et Al. durch die Wahl der Aorta als einer Perfusion Bucht über die Zöliakie Stamm (CT) und der überlegenen mesenterialen Arterie (SMA)¹¹entwickelt.

In einem kürzlich erschienenen Artikel¹²zeigen wir eine Methode zur effektiven Isolierung und Decellularization von Schweinen Bauchspeicheldrüse unter Beibehaltung einiger ECM-Komponenten. In diesem Papier wir zeigen eine detaillierte Beschreibung wie man eine ganze Schweine Pankreas, Milz, Zwölffingerdarm enthält sezieren und Verbindung Lappen, und präsentieren eine schrittweise Protokoll für erfolgreiche Decellularization.

Protokoll

Die Zerlegung von Schweinen Bauchspeicheldrüse und das Decellularization-Verfahren, die hier vorgestellten folgen die ethischen Richtlinien von der Universität Göteborg.

1. Vorbereitung des Decellularization Aufbaus

1. Mit 3 x 5 mm Silikonschläuche, Waschmittel Einlass-Container an der Peristalic-Pumpe in Reihe anschließen und dann an der Bauchspeicheldrüse in der Orgel über die Degasser Kammer (siehe Abbildung 1). Schließen Sie einen männlichen Luer an das freie Ende des Schlauches in Orgel Kammer.
2. Verwenden eine andere 3 x 5 mm Silikonschlauch, die Orgel Kammer an der Waschmittel Outlet Container über die peristaltischen Pumpe PERFUNDIERTEN Waschmittel sammeln anschließen.
3. Eine unbeschriftete 2-ml-Pipette an den freien Enden der Röhren in Waschmittel Einlass Container und Reinigungsmittel Outlet Cointainer anschließen.
4. Halten Sie das ganze Set-up bei 4 ° C.

Abbildung 1: Vorbereitung des Aufbaus Perfusion. Mit einer 3 x 5 mm Silikonschlauch, wie in das Set-up gezeigt, in Reihe Anschließen des Waschmittel Einlass-Containers der peristaltischen Pumpe, die Degasser und der Orgel-Kammer. Die schwarzen Pfeile zeigen die Flussrichtung von Waschmittel Einlass Container Orgel Kammer. Verwenden Sie für das Waschmittel Outlet eine andere 3 x 5 mm Silikonschlauch und Waschmittel Outlet-Container der Orgel Kammer über die peristaltischen Pumpe an. Die roten Pfeile zeigen die Flussrichtung von Orgel Kammer Waschmittel Outlet-Container. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

2. Vorbereitung des Decellularization Lösungen

1. Lösung 1 (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung [PBS]): 1 Liter Reinstwasser 8 g Natriumchlorid (137 mM), 0,2 g Kaliumchlorid (2,7 mM) und 1,44 g (10 mM) Natriumphosphat 0,24 g (1,8 mM) Kalium Phosphat hinzu und rühren, bis aufgelöst. Anpassen des pH-Werts 7,4 mit Salzsäure (HCl). Insgesamt ist 3,2 L dieser Lösung erforderlich.
2. Lösung 2 (PBS + Heparin): bis 1 L Lösung 1, 3,4 mL Heparin (17 Internationale Einheiten [ie] /mL) zugeben. Bereiten Sie diese Lösung frisch zu und halten Sie ihn auf Eis, bis es kalt wird. Insgesamt ist 1,2 L dieser Lösung erforderlich.
3. Lösung 3 (Reinstwasser, Natriumazid + binatrium Ethylenediaminetetraacetic Säure [EDTA]): bis 1 L von Reinstwasser, fügen Sie 1,86 g EDTA (5 mM) und 200 mg von Natriumazid (0,02 %). Rühren Sie, bis die Salze gelöst sind. Kühlen Sie die Lösung auf 4 ° C vor dem Gebrauch. Insgesamt ist 22 L dieser Lösung erforderlich.
4. Lösung 4 (PBS + Natriumazid + EDTA): bis 1 L Lösung 1, fügen Sie 200 mg (0,02 %) Natriumazid und 1,86 g EDTA (5 mM). Rühren Sie, bis die Salze gelöst sind. Kühlen Sie die Lösung auf 4 ° C vor dem Gebrauch. Insgesamt ist 1 L dieser Lösung erforderlich.
5. Lösung 5 (Reinstwasser + Natriumazid): bis 1 L von Reinstwasser, fügen Sie 200 mg von Natriumazid (0,02 %). Rühren Sie, bis die Salze gelöst sind. Kühlen Sie die Lösung auf 4 ° C vor dem Gebrauch. Insgesamt ist 260 L dieser Lösung erforderlich.
   Anmerkung: EDTA bildet einen Niederschlag mit der DEZA und Lösung 5 ausgeschlossen wurde, da es zum unmittelbaren waschen vor und nach der DEZA-Behandlung verwendet werden.
6. Lösung 6 (DEZA + Triton x-100): 940 mL Reinstwasser, fügen Sie 40 g (4 % hinzu) DEZA, 60 mL (6 %) Triton x-100, 200 mg (0,02 %) Natriumazid und 69,6 mg (0,4 mM) Phenylmethylsulfonyl Fluorid (PMSF). Rühren Sie, bis aufgelöst. Kühlen Sie die Lösung auf 4 ° C vor dem Gebrauch. Fügen Sie PMSF vor Gebrauch. Insgesamt ist 9,6 L dieser Lösung erforderlich.
7. Lösung 7 (DNase): Fügen Sie 10.000 Kunitz Einheiten der DNase-ich in 250 mL (40 Kunitz Einheiten/mL) Dulbecco PBS mit CaCl₂ und MgCl₂. Frisch zubereiten und sofort nutzen. Wärmen Sie die Lösung auf 37 ° C vor dem Gebrauch.
8. Lösung 8 (PBS + Natrium Bleiazid): bis 1 L Lösung 1, fügen Sie 200 mg von Natriumazid (0,02 %). Rühren Sie, bis die Salze gelöst sind. Kühlen Sie die Lösung auf 4 ° C vor dem Gebrauch. Insgesamt ist 1 L dieser Lösung erforderlich.

(3) Dissektion des porcinen Pankreas

Hinweis: In dieser Studie wurden Schweine Bauchspeicheldrüsen von seziert eingeschläfert, weibliche Schweine heparinisierten (400 IE/kg) mit einem Gewicht von 45 kg von einem Bauernhof.

1. Platzieren Sie das Schwein auf dem Seziertisch in der Rückenlage.
2. Machen Sie einen Mittellinie Schnitt aus dem xiphoidal-Prozess mit dem Schamknochen (ca. 40 cm) mit einem Skalpell, Freilegung aller Bauchorgane.
3. Suchen Sie die Milz, Zwölffingerdarm, und Verbindung Lappen.
4. Suchen Sie das Niveau der großen Zwölffingerdarm Papille und verbinden Sie den Zwölffingerdarm mündlich von dieser Seite mit zwei separaten Nähte.
5. Verbinden der minderwertigen Speiseröhre mit zwei getrennten Nähten und schneiden zwischen den Ligaturen mit einer Schere den Magen herausnehmen.
6. Trennen Sie das Bindegewebe aus dem Dickdarm, Dünndarm zu erreichen.
7. Trennen Sie das Bindegewebe des Dickdarms, die der Milz Lappen der Bauchspeicheldrüse misst.
8. Entfernen Sie den Doppelpunkt aus dem Dünndarm nach Ligation der Arterien.
9. Die minderwertigen mesenterialen Vene und der minderwertigen mesenterialen Arterie Baum finden und verbinden mit einer Naht, wo sie kaudal des Pankreas erscheinen.
10. Verbinden der Milz Arterie und Vene zusammen mit einer Naht, in der Nähe der Milz, in den Hilum und distal Schneiden mit der Schere, die Milz zu entfernen.
11. Folgen Sie den Zwölffingerdarm, bis der Zwölffingerdarm und Verbindung Lappen gelöscht werden und den Zwölffingerdarm am Ende mit zwei separaten Nähte verbinden.
12. Sezieren Sie die Pfortader zu, verbinden Sie es mit einer Naht zu verhindern Lecks Blut aus der Leber und proximal auf Ligatur geschnitten. Die Pfortader dient als Ventil während der Decellularization.
13. Sezieren Sie und verbinden Sie den Gallengang und hepatischen Arterie mit zwei Nähten. Nach distal auf Nähte geschnitten.
14. Finden Sie die Aorta unter die renale Vene zu und in kranialer Richtung von Muskel- und Bindegewebe zu sezieren Sie, bis es die Bauchspeicheldrüsen Bereich erreicht.
15. Die Bauchspeicheldrüse vorsichtig umdrehen und sezieren der Aorta, wobei die SMA und der CT intakt, und die Aorta CT überlegen und minderwertig zu SMA mit einer Schere schneiden.
16. Schneiden Sie die restlichen umgebende Gewebe mit einer Schere und herausnehmen Sie die Bauchspeicheldrüse.
17. Mit einer 50-mL-Spritze mit 4-mm-arteriotomie Kanüle verbunden, die Orgel durch die Aorta mit Lösung 2 Spülen, bis es das gesamte Organ perfuses oder das gesamte Organ kalt wird.

4. Vorbereitung der porcinen Bauchspeicheldrüse Decellularization

1. Halten Sie die Bauchspeicheldrüse bei 4 ° C oder auf dem Eis während des Prozesses.
2. Schneiden Sie die Fäden mit einer Schere Zwölffingerdarm, Reinigen von Lebensmitteln durch Spülen 50-150 mL Reinstwasser mit einer 25-mL-Pipette, und verbinden Sie es wieder mit Nähten.
3. Verbinden Sie ein Ende der Aorta und alle Niederlassungen neben der SMA und CT mit Fäden auslaufen zu verhindern.
4. Legen Sie vom anderen Ende der Aorta eine arteriotomie 4-mm-Kanüle und verbinden Sie es mit Nähten.
5. Durchspülen der Bauchspeicheldrüse mit Lösung 3 für 1 h bei 20 mL/min mit Decellularization Aufbau.
   Hinweis: Vorausfüllen Sie die Schläuche der Pumpe mit Lösung 3 so, dass keine Luftblasen die Bauchspeicheldrüse eingeben. Suchen Sie nach Undichtigkeiten von allen Seiten der Orgel und verbinden Sie alle offenen Kreislauf Zweige mit Nahtmaterial, mit Ausnahme der Pfortader.
6. Einfrieren der Bauchspeicheldrüse bei-20 ° C in Lösung 4 bis zum Beginn der Decellularization.

5. Decellularization der Schweine Bauchspeicheldrüse

1. Auftauen der Bauchspeicheldrüse bei 4 ° C.
2. Führen Sie der peristaltischen Pumpe in den Decellularization Aufbau mit Lösung 3 bei 20 mL/min, bis keine Luftblasen in der Waschmittel Schlauch zu sehen sind.
3. Die Bauchspeicheldrüse Decellularization Container und anschließen Sie die Waschmittel Schlauch der Aorta der Bauchspeicheldrüse. Waschen Sie die Orgel von Perfusion mit Lösung 3 Übernachtung im 20 mL/min bei 4 ° C.
4. Gießen Sie die Lösung in der Orgel-Kammer gelassen.
5. Lösung 3 mit Lösung 5 ersetzen und Durchspülen der Bauchspeicheldrüse für 30 min bei 20 mL/min bei 4 ° C. Gießen Sie die Lösung in der Orgel-Kammer.
6. Lösung 6 hinzufügen und Durchspülen der Bauchspeicheldrüse für 8 h bei 20 mL/min bei 4 ° C. Gießen Sie die Lösung in der Orgel-Kammer.
7. Waschen Sie die Orgel von Perfusion mit Lösung 5 96 h bei 20 mL/min bei 4 ° C. Gießen Sie die Lösung in der Orgel-Kammer.
8. Vorbereiten der Bauchspeicheldrüsenkrebs DNase-Behandlung durch Rezirkulation 500 mL Dulbeccos PBS mit CaCl₂ und MgCl₂ für 30 min bei 37 ° C. Gießen Sie die Lösung in der Orgel-Kammer.
9. 250 mL Lösung 7 hinzugeben und Durchspülen der Bauchspeicheldrüse für 4 h bei 20 mL/min bei 37 ° C. Gießen Sie die Lösung in der Orgel-Kammer.
10. Waschen Sie die Orgel von Perfusion mit Lösung 5 120 h bei 20 mL/min bei 4 ° C.
11. Die Orgel in Lösung 8 bei 4 ° C für kurze Zeiträume oder bei-20 ° C über einen längeren Zeitraum aufbewahren.

6. Überprüfung der Decellularization

1. Mit Schere, schneiden Sie 3 - 10 mm Biopsien aus allen Lappen der Bauchspeicheldrüse und befestigen Sie sie in Formaldehyd für 48 h bei Raumtemperatur.
2. Waschen Sie die Stücke in Reinstwasser für 15 min in einem Gewebe-Prozessor nach Standardprotokollen zu verarbeiten Sie und in Paraffin einbetten.
3. Schneiden Sie 5 µm Abschnitte mit Mikrotom und Färben sie von Meyers Hämatoxylin und 0,2 % alkoholischer Eosin (HE) nach standard-Protokolle.
4. Zeigen Sie die Folien unter einem Lichtmikroskop, für den Verlust der Kerne zu überprüfen.
   Hinweis: Eine Stück von einem frischen Gewebe in gleicher Weise verarbeitet als ein Steuerelement lässt sich um auf das Vorhandensein von Kernen zu überprüfen.

Ergebnisse

Repräsentative porcinen Bauchspeicheldrüse Dissektion Bilder, die können helfen beim Auffinden und sezieren die minderwertigere mesenterialen Arterie und Vene, Baum, der Pfortader, der leberarterie, der Gallengang und der Aorta, die Verzweigung in CT und SMA, entnehmen Sie bitte Abbildung 2A, 2 bund 2 C (gelbe Pfeile), beziehungsweise. Abbildung 3A zeigt die grobe Morphologie des normalen Bauchspeicheldrüse, hellrosa und enthält Milz, Verbindungs- und Zwölffingerdarm Lappen. Nach Decellularization die rosa Farbe verloren und die decellularized Bauchspeicheldrüse sieht blass weiß in der Farbe. Die grobe Morphologie Abbildung Milz, ist Verbindungs- und Zwölffingerdarm Lappen der Bauchspeiseldrüse decellularized in Abbildung 3 bgezeigt. Abbildung 3 zeigt die Anwesenheit von vielen blauen Kernen in einem normalen Bauchspeicheldrüse durch Färbung mit er. In einem decellularized Bauchspeicheldrüse, der HE-Färbung zeigte einen Verlust von Kernen, da keine blaue Kerne zu sehen sind (Abbildung 3D).

Abbildung 2: Bilder von einem porcinen Bauchspeicheldrüse Dissektion. (A) Position des minderwertigen mesenterialen Arterie und Vene Baum (gelber Pfeil). (B) Unterbindung der Pfortader, der leberarterie und der Gallengang (gelber Pfeil). (C) Aorta Verzweigung in der Zöliakie Stamm und der überlegenen mesenterialen Arterie (gelber Pfeil). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: Brutto-Morphologie und Färbung der normalen und decellularized Bauchspeicheldrüsen. (A) Brutto Morphologie von einem normalen Pankreas. (B) Brutto Morphologie der Bauchspeiseldrüse decellularized. (C) er Färbung zeigt die Anwesenheit von blauen Kernen in einem normalen Pankreas. (D) er Färbung zeigt das Fehlen der blaue Kerne in einer decellularized Bauchspeicheldrüse. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Diskussion

Das vorgeschlagene Protokoll mit Durchblutung der DEZA und Triton x-100 bei 4 ° C, werden ganze Schweine Pankreas erfolgreich decellularize. Die Herausforderung bei dieser Technik ist die Zerlegung der intakten Bauchspeicheldrüse, enthält die drei Lappen ohne Beschädigung das Parenchym und seiner liefernden Schiffe sowie die Unterbindung der anderen vaskulären Zweige der Probe um die Orgel durchspülen ohne Leckage. Porcines Bauchspeicheldrüse hat eine unterschiedliche Anatomie im Vergleich zu der menschlichen Bauchspeicheldrüse. Es besteht aus drei Lappen und bleibt in engem Kontakt mit den Dünndarm durch teilweise um ihn herum. Wir seziert den Zwölffingerdarm zusammen mit der Bauchspeicheldrüse, wie mehrere kleiner Blutgefäße aus der Bauchspeicheldrüse von den Darm verbinden. Während des Studiums Optimierung hat stumpfe schneiden dieser Blutgefässe auslaufen und eine unvollständige Perfusion Lösungen gezeigt.

Da die Aorta mit der Bauchspeicheldrüse durch die Zöliakie und überlegenen mesenterialen Arterien verbunden ist, haben wir die Aorta als einer Einbuchtung, die Perfusion einfach zu halten, nur mit Hilfe einer Kanüle und daher ein Inlet. In unserer Erfahrung Unterbindung der Aorta oberhalb der CT und unterhalb der SMA sinkt der Präparation und verringert das Risiko der Beschädigung einer der beiden Schiffe. Neben einer heparinisierten Schwein bemerkten wir auch, dass eine Perfusion der kalten Heparin über die Aorta unmittelbar nach der Dissektion hilft bei der Durchblutung von Lösungen für den gesamten Orgel zu erreichen. Wir spekulieren, dass in diesem Fall durch die Verhinderung der Bildung von Blutgerinnseln in den Blutgefäßen. Die anfängliche Perfusion der Bauchspeicheldrüse mit Reinstwasser nach Dissektion wird Erythrozyten lysiert und die Blut-Reste in der Orgel, und verhindert die Bildung von Blutgerinnseln zu entfernen. Diese Zeit kann auch genutzt werden finden unligated kleine Äste von Venen und Arterien, wie Blutfluss über der Hintergrundebene leicht bemerkt werden kann.

Wir wählten das ganze Decellularization Verfahren bei kalten Temperaturen (4 ° C) zu halten, weil dadurch die Wirkung der exokrinen Enzyme behindert wird, die von den exokrinen Zellen der Bauchspeicheldrüse auslösen. Die exokrine Enzyme, wenn nicht gehemmt wird, können eine schädliche Wirkung auf die Zellen und das ECM verursachen, da sie Zellmembranen und Proteine^{12 verdauen können}. Einfrieren und Auftauen effektiv die Zellen platzen können, enthalten wir einen Frost/Tau-Schritt zunächst noch bevor die Perfusion der Waschmittel^4,13. Die erste Wäsche nach dem Auftauen werden die Reste der Zelle platzt entfernen. Die Waschmittel Behandlung verwendeten wir ist eine Mischung von DEZA und Triton x-100 bei ungewöhnlich hohen Konzentrationen und mit einer hohen Durchblutung Geschwindigkeit. Wir entschieden uns für diesen Ansatz zu erreichen schneller Decellularization durch Entfernen der exokrinen Zellen, die das ECM zu beschädigen. Wir spekulieren, dass eine harte und schnelle Protokoll für Bauchspeicheldrüse Decellularization vorteilhaft ist, da weniger Zeit für Pankreas-Enzyme zur Interaktion mit der ECM, somit Erhaltung gute ECM-Komponenten zur Verfügung stehen. Um die ECM-Komponenten zu erhalten, haben wir auch Serin-Protease-Hemmer (PMSF) Waschmittel Lösungen, wie das die Aktivierung von Enzymen aus dem exokrinen Zellen¹⁴entlassen hemmt wird. Natriumazid wird alle Decellularization Lösungen hinzugefügt, da es wie eine bakteriostatische Agent wirkt, damit die Chance auf bakterielle Kontamination¹⁵Hemmung.

Die Bauchspeicheldrüse decellularized nach diesem Protokoll zeigte eine Erhaltung der ECM-Strukturen und die ECM Proteine Kollagen und Elastin. Jedoch wurde ein erheblicher Verlust von Glykosaminoglykanen decellularized Bauchspeicheldrüse bemerkt. Die Bauchspeicheldrüse decellularized auf diese Weise auch zeigte Versprechen für die Befestigung des fetalen Pankreas Stammzellen und der Ausdruck der exokrinen und endokrinen Marker in recellularized für 14 Tage¹²Stücke. Um eine Bauchspeicheldrüse intakt und funktionsfähig zu erzeugen, ist jedoch weitere Untersuchungen erforderlich, bei der Bewertung von richtigen Zelle Quellen, Zelltypen, Zelle seeding Strategien und Bioreaktor Kultur.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4mm DLP arteriotomy cannula	Medtronic	31104
2ml Unlabelled pipette	vWR	612-3720
Degasser	Biotech AB	0001-6484
DNase-I	Worthington	LS0020007
Dulbecco's PBS with CaCl2 and MgCl2	Sigma Aldrich	D8662
EDTA disodium salt dihydrate	AlfaAesar	A15161.OB
Heparin	Leo	387107
Luer Male with 1/8" ID Barb	Oina	LM-2PP-QC	For 3X5mm silicon tube
Peristaltic pump	Oina	SP-1X4
PMSF	Roche	10837091001	Unstable in aqueous solution. Should be added fresh before perfusion.
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P5405
Potassium hydrogen phosphate	Sigma Aldrich	P9791
SDC	Sigma Aldrich	30970
Silicon tube 3X5mm	VWR	2280706
Sodium Azide	Sigma Aldrich	71290
Sodium chloride	Sigma Aldrich	13423
Sodium hydrogen phosphate	Merck	71640-M
Suture	Vömel	14817
Syrringe 50mL	Becton Dickinson	300137
Triton-X-100	AlfaAesar	A16046.OF