Bewertung des metabolischen Profils der primäre Leukämie-Zellen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Isolierung der leukämischen Zellen aus dem Knochenmark Leukämie Patienten und Analyse ihrer metabolischen Zustand. Bewertung des metabolischen Profils der primäre Leukämie-Zellen könnte dazu beitragen, um die Nachfrage von Primärzellen besser zu charakterisieren und könnte bis zu mehr personalisierte Medizin.

Zusammenfassung

Die metabolische Anforderung von Krebszellen kann überleben und die Wirksamkeit der Behandlung negativ beeinflussen. Heutzutage ist die pharmazeutische Ausrichtung der Stoffwechselwege in vielen Arten von Tumoren getestet. Charakterisierung von Krebs Zelle metabolische Setup ist also unumgänglich, um gezielt den richtigen Weg, um das Gesamtergebnis des Patienten zu verbessern. Leider in der Mehrzahl der Krebserkrankungen, die bösartigen Zellen sind ziemlich schwierig, in größerer Zahl zu erhalten und die Gewebeentnahme ist erforderlich. Leukämie ist eine Ausnahme, wo eine ausreichende Anzahl an leukämischen Zellen aus dem Knochenmark isoliert werden. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung der leukämischen Zellen aus dem Knochenmark Leukämie Patienten und anschließende Analyse ihrer metabolischen Zustand mit extrazellulären Flux-Analyzer. Leukämischen Zellen sind durch die Dichtegradienten isoliert, die ihre Lebensfähigkeit nicht beeinträchtigt. Anbau als nächstes hilft sie zu regenerieren, damit der metabolische Zustand gemessen ist der Zustand der Zellen unter optimalen Bedingungen. Dieses Protokoll ermöglicht konsistente, gut standardisierte Ergebnisse, die für die personalisierte Therapie genutzt werden könnten.

Einleitung

Die metabolischen Profils ist eines der Hauptmerkmale von Zellen und veränderten Bioenergetik gelten jetzt als eines der Markenzeichen von Krebs^1,2,3. Darüber hinaus könnten Veränderungen im Stoffwechsel-Setup bei der Behandlung von Krebs durch gezielte Transduktion Signalwege oder enzymatische Maschinerie der Krebs Zellen^4,5,6verwendet werden. Zu wissen, die metabolische Veranlagung von Krebszellen ist also ein Vorteil und kann helfen, die aktuelle Therapie zu verbessern.

Es gibt eine Fülle von bereits etablierten Methoden, die die Stoffwechselaktivität der Zellen in Kultur beurteilen können. Über Glykolyse, Glukoseaufnahme kann gemessen werden durch die radioaktive Markierung mit 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) oder extrazellulären Laktatwerte gemessen enzymatisch^7,8. Fettsäure-Oxidationsrate ist ein anderer metabolischer Parameter gemessen isotopisch beschriftete Palmitat^9,10. Sauerstoff-Verbrauch ist eine Methode zur Bestimmung der mitochondrialen Aktivität in den Zellen^11,12, zusammen mit der mitochondrialen Membran mögliche Bewertung^13,14, ATP/ADP (Adenosin am meisten benutzt 5 '-Triphosphat/Adenosin-5′-diphosphat) Verhältnis Messung¹⁵ oder insgesamt intrazellulären ATP Messung¹⁶. Signalwege, die bekanntermaßen Stoffwechselvorgänge regulieren konnte vom Protein Quantifizierungen festgestellt werden und kann das Verständnis der metabolischen Messungen^17,18,19verbessern.

Aber alle diese Methoden messen nur eine oder im besten Fall ein paar metabolische Parametern in einer Probe gleichzeitig. Wichtig ist, kann die gleichzeitige Messung der Sauerstoff-Verbrauch (OCR) und extrazelluläre Übersäuerung (ECAR) durch die extrazelluläre Flux-Analyse durch, z.B. Seepferdchen XFp Analyzer erreicht werden. OCR ist ein Indikator für die mitochondriale Atmung und ECAR ist vor allem das Ergebnis der Glykolyse (CO₂ -Produktion möglicherweise erhebt ECAR Zellen mit hohen Oxidative Phosphorylierung Tätigkeit können wir nicht ignorieren)²⁰. Bisher wurden verschiedene Zelltypen untersucht, mit diesen Analysatoren^21,22,23.

Hier beschreiben wir das Protokoll für die extrazelluläre Flussmittel Analyse der primären Blasten (Leukämiezellen abgeleitet aus den unreifen hämatopoetische Phase) von Leukämie-Patienten. Nach bestem Wissen und gewissen ist ein spezielles Protokoll für primäre Blasten noch nicht verfügbar.

Protokoll

Alle Proben stammen die Patienteneinverständnis der Eltern oder Erziehungsberechtigten der Kinder mit Zustimmung der Ethikkommission der Karlsuniversität in Prag, Tschechische Republik, die Studie keine. NV15-28848A.

1. Vorbereitung der Reagenzien

1. Bereiten Sie 500 mL PBS durch Auflösen von 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na₂HPO₄, 1,47 mM KH₂PO₄in DdH₂O. anpassen der pH-Wert 7,4 mit HCl. entkeimen durch Autoklavieren vor.
2. 100 mL RPMI Medium vorbereiten: RPMI-1640 Medium mit L-Alanyl-Glutamin ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), Penicillin (100 U/mL) und Streptomycin (100 μg/mL).
3. 50 mL 0,1 M Nahco3₃ in destilliertem Wasser vorzubereiten. Stellen Sie den pH-Wert auf 8.1, Filter (0,22 μm) zu sterilisieren und Lagerung bei 4 ° C.
   Hinweis: Für zwei 8-Brunnen extrazelluläre Flussmittel Analyzer Platten, bereiten Sie 250 μl 0.1 M Nahco3₃ pH 8.1 vor.
4. Bereiten Sie 1 mL 2 M D-Glucose in destilliertem Wasser. Filter (0,22 μm) zu sterilisieren und Lagerung bei-20 ° C.
5. Bereiten Sie 100 μl 1 mm Oligomycin A in Ethanol. Filter (0,22 μm) zu sterilisieren und Lagerung bei-20 ° C.
6. Bereiten Sie 250 μL 1 M 2-Deoxy-D-Glucose (2-DG) in minimalen DMEM (Dulbeccos geändert Eagle Medium). Auf 37 ° C warm und passen Sie den pH auf 7,4 (durchführen von pH-Messung bei 37 ° C). Filter (0,22 μm) zu sterilisieren und Lagerung bei-20 ° C.
7. Bereiten Sie 100 μl 1 mm FCCP (Carbonyl Zyanid-p-Trifluoromethoxyphenylhydrazone) in DMSO. Filter (0,22 μm) zu sterilisieren und Lagerung bei-20 ° C.
8. Bereiten Sie 100 μl 1 mm Rotenon in Ethanol. Filter (0,22 μm) zu sterilisieren und Lagerung bei-20 ° C.
9. Bereiten Sie 100 μL von 1 mg/mL Antimycin A in Ethanol. Filter (0,22 μm) zu sterilisieren und Lagerung bei-20 ° C.
10. Kurz vor dem Gebrauch bereiten Sie 10 mL der Glykolyse Stresstest Medium vor. Erwärmen Sie minimale DMEM auf 37 ° C im Wasserbad und passen Sie den pH auf 7,4 (durchführen von pH-Messung bei 37 ° C).
11. Bereiten Sie vor dem Gebrauch 10 mL Zelle Mito Stresstest Medium mit BSA. Minimale DMEM mit 2 mM L-Glutamin, 10 mM D-Glucose, 1 mM HEPES (pH-Wert 7,4), 1 mM Pyruvat und 0,1 % BSA (bovine Serum Albumin) ergänzen. Auf 37 ° C im Wasserbad erwärmen Sie und passen Sie den pH auf 7,4 (durchführen von pH-Messung bei 37 ° C).
12. Bereiten Sie vor dem Gebrauch 10 mL Zelle Mito Stresstest Medium ohne BSA. Minimale DMEM mit 2 mM L-Glutamin, 10 mM D-Glucose, 1 mM HEPES (pH 7,4) ergänzen und 1 mM Pyruvat. Erwärmen Sie Zelle Mito Stresstest Medium ohne BSA auf 37 ° C im Wasserbad und passen Sie den pH auf 7,4 (durchführen von pH-Messung bei 37 ° C).
    Hinweis: BSA auf der Zelle Mito Stresstest Medium hinzugefügt, da die Zellen besser auf FCCP zu reagieren, wenn das Medium mit BSA ergänzt wird (verschiedene Bedingungen getestet wurden). Zelle Mito Stresstest Medium ohne BSA dient zum Laden der Häfen, wie vom Hersteller nicht empfohlen wird mit BSA im Medium.

2. Isolierung von mononukleären Zellen aus dem Knochenmark

Hinweis: Im Idealfall sollte Messung der metabolischen Zustand des primären Leukämie-Zellen sofort nach Knochenmark Sammlung und Zelle Isolation starten. Dennoch konnte relevante Daten auch ermittelt werden, aus den Zellen isoliert nach Transport von anderen Hämatologie-in der Tschechischen Republik Zentren. Führen Sie alle Teilschritte in eine sterile Gewebekultur Kapuze.

1. PBS und das Dichte Gradienten Medium auf Zimmertemperatur aufwärmen.
2. Verdünnen der Knochenmarkprobe Leukämie-Patienten mit PBS, in einem Verhältnis von 1:1. Stellen Sie sicher, dass die Probe mindestens 80 % der leukämischen Blasten enthält.
3. Bestimmen Sie den Anteil der Blasten durch Durchflusszytometrie mit bestimmten CD-Markern für Immunophenotype Charakterisierung von Zelltypen. Nach gradient Dichtetrennung Nukleinsäure-positive Ereignisse mit einem nuklearen Farbstoff zu erkennen um die gesamte Zellzahl zu etablieren.
4. Bestimmen Sie anschließend mit speziellen CD-Markern für jede Art von Leukämie Leukämie-Zellen: B-ALL (CD19, CD45), T-ALL (CD3, CD4, CD8, CD5, CD7, CD99) und AML (CD45, CD33 und spezifische myeloischer Marker)²⁴. Teilen Sie die Zahl der Leukämiezellen für spezifische CD Marker positiv von allen nuklearen Zellen zu bestimmen, den Anteil der Leukämiezellen Blast.
   Hinweis: Das Knochenmark hat in die Röhrchen mit Antikoagulanzien gesammelt werden.
5. Sorgfältig Schicht 6 mL verdünnten Knochenmarkprobe über 6 mL des Dichte Gradienten Mediums in einem 15 mL konische Röhrchen. Zentrifugieren Sie bei 400 X g für 35 min bei 4 ° C in ein Schwingen-Eimer-Rotor ohne Bremse.
   Hinweis: Größere Volumen der Probe konnte in mehr Aliquote unterteilt werden oder 50 mL konische Rohr mit der größeren Dichte Gradienten Medium eingesetzt werden.
6. Übertragen Sie die Interphase-Schicht besteht aus mononukleären Zellen (Abbildung 1) mit einer Pasteurpipette, sorgfältig auf eine neue konische 50 mL-Tube mit 5 mL PBS werden. Zentrifugieren Sie bei 400 × g für 10 min bei 4 ° C in ein Schwingen-Eimer-Rotor.
   Hinweis: Übertragen Sie alle mononukleären Zellschichten in ein einzelnes 50 mL konische Röhrchen mit 5 mL PBS
7. Den Überstand abgesaugt und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 2 mL sterile PBS. Zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer.
   Hinweis: Die Zahl der Leukämiezellen in 1 mL von angesaugte Knochenmark unterscheidet sich erheblich zwischen Patienten²⁵.

3. Übernachtung Kultivierung von mononukleären Zellen

Hinweis: Führen Sie alle Teilschritte in einem sterilen Gewebekultur-Haube.

1. Bereiten Sie zwei T75 Fläschchen mit 20 mL RPMI. Fügen Sie zu jedem Kolben 30 x 10⁶ isoliert mononukleären Zellen hinzu. Inkubieren Sie die Zellen mit den Kolben aufstehen für 16 – 24 h um 5 % CO₂ und 37 ° c

4. Vorbereitung der Zellplatten Klebstoff beschichtet

1. Zwei 8-Brunnen extrazelluläre Flussmittel Analyzer Platten zu beschichten.
   Hinweis: Führen Sie die Beschichtung in einem sterilen Gewebekultur-Haube.
2. 2.2 μL der Zelle Klebstoff hinzufügen (Dichte: 2,54 mg/ml) zu 250 μl 0.1 M Nahco3₃, pH 8,1 und Pipette sofort 12,5 μl der Lösung in jede Vertiefung.
   Hinweis: Lager Klebelösungen Zelle kann unterscheiden sich in ihrer Dichte, die Lautstärke entsprechend Nahco3₃ hinzugefügt.
3. Lassen Sie die Platten sitzen in der Haube für ca. 20 min, dann Aspirieren des Zelle Klebstoffs und jeweils gut zweimal mit 200 μL steriles Wasser zu waschen. Lassen Sie es sich in der Haube bei geöffnetem Deckel bis Brunnen trocken sind.
4. Verwenden Sie die Platten direkt oder sparen Sie bis zu 1 Woche bei 4 ° C mit der Felge in Paraffin Film zur Vermeidung von Kondensation gewickelt. Sicherstellen Sie, dass die Platten auf bei Raumtemperatur (ca. 20 min) in der Haube erwärmt werden vor der Aussaat der Zellen.

5. die Hydratation der Sensorkassette

Hinweis: Hydrat zwei 8-Brunnen extrazelluläre Flussmittel Analyzer Patronen.

1. Trennen Sie das Dienstprogramm-Platte und der Sensorkassette. Legen Sie die Sensor-Steckmodul umgedreht auf dem Labortisch.
2. Füllen Sie jeweils auch der Dienstprogramm-Platte mit 200 μL Kalibrator. Füllen Sie jeder Graben um die Außenseite der Brunnen mit 400 μl der Kalibrator.
3. Das Dienstprogramm-Platte, die jetzt den Kalibrator enthält zurückzukehren Sie der Sensorkassette.
4. Legen Sie die Patrone Versammlung in eine befeuchtete, nicht-CO₂, 37 ° C Inkubator über Nacht.
5. Schalten Sie den extrazellulären Flux-Analyzer und lassen Sie es warm auf 37 ° C über Nacht.

(6) Aussaat Zellen in Zellplatten Klebstoff beschichtet

Hinweis: Für die Glykolyse Stresstest, verwenden Sie Glykolyse Stresstest Medium. Verwenden Sie für Zelle Mito Stresstest Zelle Mito Stresstest Medium mit BSA.

1. Samenzellen für die Glykolyse-Stress-Test und die Zelle Mito Stresstest in separaten Platten. Verwenden Sie für jeden Test Zellen aus einer Flasche mit Übernachtung Kultur.
2. Zentrifugieren Sie Zellen bei 200 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Zellen in 1 mL des entsprechenden Mediums Aufschwemmen und sie zählen.
3. Der letzte Band der 400 μl (Verwendung in anderer geeigneter Form) 4 x 10⁶ von lebenden Zellen hinzufügen.
4. Platte 50 μL der Zellsuspension in Brunnen B-G. Sicherstellen Sie, dass in einem gut 500.000 Zellen ausgesät werden.
   Anmerkung: Es ist wichtig, genau 500.000 Zellen pro Bohrloch Saatgut wie keine andere Normalisierung durchgeführt wird. Auf diese Weise können die Ergebnisse von anderen Patienten verglichen werden. Die optimale Anzahl von Wiederholungen ist sechs, wie hier beschrieben ist. Mit weniger Wiederholungen wird nicht empfohlen, da Primärzellen manchmal fälschlicherweise Verhalten konnten.
5. Fügen Sie 180 μL des entsprechenden Mediums in Vertiefungen A und H (diese Brunnen dienen als eine Hintergrundkorrektur).
6. Zentrifugieren Sie die Platte 400 X g für 5 min bei Raumtemperatur mit Bremse auf 1 gesetzt.
7. Brunnen B-G in zwei 8-Brunnen extrazelluläre Flussmittel Analyzer Platten fügen Sie 130 μL des entsprechenden Mediums langsam und vorsichtig hinzu. Bestätigen Sie visuell, dass die Zellen durch Betrachtung unter dem Mikroskop stabil auf den Boden der Näpfchen eingehalten werden.
8. Stellen Sie die Platte in eine feuchte, nicht-CO₂und 37 ° C Inkubator für 30 min.

7. laden die Sensor-Steckmodul

1. Bereiten Sie für den Stresstest Glykolyse 250 μL jeder der 100 mM Glukose, 20 μM Oligomycin A und 1 M 2-DG, alles in Glykolyse Stresstest Medium.
2. Die Zelle Mito-Stress-Test Vorbereitung 250 μL jeder von 20 μM Oligomycin A, 15 μM FCCP, 30 μM FCCP und einer Mischung von 10 μM Rotenon und 10 μg/ml Antimycin A, alle in Zelle Mito Stresstest Medium ohne BSA.
   Hinweis: Injektion von zwei Konzentrationen von FCCP in einem Assay wird empfohlen, da es nicht genug Patienten Material für die FCCP Titration. Dennoch sollten die Konzentrationen der Forscher ermittelt werden.
3. Laden Sie die Verbindungen in den entsprechenden Injektor Häfen der Patrone wie folgt (Tabelle 1):

8. Einrichten des Programms

1. Richten Sie für den Stresstest Glykolyse das Programm wie in Tabelle 2beschrieben.
2. Richten Sie für die Zelle Mito-Stress-Test das Programm wie in Tabelle 3beschrieben.
3. Starten Sie das Programm. Die Kalibrator Platte mit der Assay-Platte (Aufforderung) zu ersetzen.

9. Auswertung und Interpretation der Ergebnisse

1. In die Glykolyse Stresstest-Ergebnisse Subtrahieren des niedrigsten ECAR-Wertes nach 2-DG Injektion von anderen ECAR-Werten.
   Hinweis: Dieser niedrigsten Wert stellt die nicht-glykolytische Übersäuerung. In der Regel ist der niedrigste Wert von 4^th -Messung.
2. Berechnen Sie basale Versauerung, Glykolyse, maximale Glykolyse und glykolytische Reserve Parameter von glykolytische Funktion (Abbildung 2A). Nach Abzug des niedrigsten Wertes der ECAR, berechnen basale Versauerung als Mittel der ECAR aus den ersten drei Messpunkten (weglassen den ersten ECAR Wert, es unterscheidet sich wesentlich von den anderen beiden), Glykolyse als Mittel der ECAR aus drei Messung berechnen Punkte nach Glukose-Injektion und maximale Glykolyse zu berechnen, wie ein Mittelwert von ECAR aus drei Messungen nach Oligomycin eine Injektion weist. Berechnen Sie Glycolytic Reserve als maximale Glykolyse minus Glykolyse.
   Hinweis: Alternativ für maximale Glykolyse Berechnung verwenden Sie den höchsten ECAR-Wert aus den drei Punkten gemessen.
3. Subtrahieren Sie in die Zelle Mito Stresstest-Ergebnisse den niedrigsten Wert der OCR nach Rotenone/Antimycin A Injektion von anderen OCR-Werten.
4. Basalen Atmung, ATP-Produktion, maximale Atmung und Kapazitätsreserven Parameter von mitochondrialen Funktion (Abb. 2 b) zu berechnen. Nach Abzug des niedrigsten Wertes der OCR, basale Atmung als Mittel der OCR aus den ersten drei Messpunkten zu berechnen.
   Hinweis: Maximale Atmung ist der höchste Wert der OCR nach FCCP Injektion.
5. Subtrahieren Sie für die ATP-Produktion-Berechnung den Mittelwert der drei OCR Messpunkte nach Oligomycin A Injektion von basaler Atmung. Freie Kapazitäten als die maximale Atmung abzüglich der basalen Atmung zu berechnen.
   Hinweis: Berechnen Sie immer die maximale Atmung aus der OCR Wert, unabhängig von der verwendeten Konzentration FCCP.

Ergebnisse

Abbildung 3 zeigt die Kurven nach Glykolyse Stresstest und Zelle Mito Stresstest Messungen der leukämischen Blasten aus dem BCP-ALL (B-Zelle Vorläufer akute lymphoblastische Leukämie) und AML (akute myeloische Leukämie) Patienten. Die Berechnung der metabolischen Parametern aus diesen Messungen wird ebenfalls angezeigt. 500.000 Zellen pro Bohrloch wurden ausgesät und alle Messungen erfolgten in Hexaplicates.

Diskussion

Das oben beschriebene Protokoll ermöglicht die Messung der Stoffwechselaktivität von OCR und ECAR Werte in primären leukämischen Blasten abgeleitet von Patienten mit akute lymphoblastische Leukämie (ALL) bewertet oder akute myeloische Leukämie (AML). Der Vorteil der Messung mit einer extrazellulären Flux-Analyzer ist, dass es die Erkennung von metabolischen Profils in Echtzeit in lebenden Zellen ermöglicht. Jeder Schritt in das angegebene Protokoll konnte im wesentlichen je nach Zelltyp angepasst werden, was man ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Gibco, ThermoFisher Scientific	61870-010
Fetal Bovine Serum	Biosera	FB-1001/100
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco, ThermoFisher Scientific	15240-062
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761-500G
D-(+) Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-100G
Oligomycin A	Sigma-Aldrich	75351-5MG
2-Deoxy-D-glucose	Sigma-Aldrich	D8375-1G
FCCP	Sigma-Aldrich	C2920-10MG
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418-100ML
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875-1G
Antimycin A from Streptomyces sp.	Sigma-Aldrich	A8674-25MG
Seahorse XF Base Medium, 100 mL	Agilent Technologies	103193-100
L-glutamine solution, 200 mM	Sigma-Aldrich	G7513-100ML
HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6	Sigma-Aldrich	H0887-100ML
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280-25G
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A2153-10G
Ficoll-Paque Plus	Sigma-Aldrich	GE17-1440-02	Density gradient medium
Seahorse XFp FluxPak	Agilent Technologies	103022-100
Corning™ Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive	ThermoFisher Scientific	CB40240
Seahorse Analyzer XFp	Agilent Technologies	S7802A
Seahorse XFp Cell Culture Miniplate	Agilent Technologies	103025-100