Bewertung des Darmkrebsrisikos und der Prävalenz durch Stuhl-DNA-Integritätsnachweis

Zusammenfassung

Das vorgestellte diagnostische FL-DNA-Kit ist eine zeitsparende und benutzerfreundliche Methode, um die zuverlässige Wahrscheinlichkeit des Vorhandenseins von Darmkrebsläsionen zu bestimmen.

Zusammenfassung

Heute kann Stuhl-DNA mit mehreren Methoden isoliert und analysiert werden. Die langen DNA-Fragmente im Stuhl können durch einen qPCR-Assay nachgewiesen werden, der eine zuverlässige Wahrscheinlichkeit für das Vorhandensein von präneoplastischen oder neoplastischen dickdarmen Läsionen bietet. Diese Methode, die fluoreszenzlange DNA (FL-DNA) genannt wird, ist ein schnelles, nicht-invasives Verfahren, das eine Verbesserung gegenüber dem primären Präventionssystem darstellt. Diese Methode basiert auf der Bewertung der Fäkal-DNA-Integrität durch quantitative Verstärkung spezifischer Ziele der genomischen DNA. Insbesondere die Auswertung von DNA-Fragmenten von mehr als 200 bp ermöglicht den Nachweis von Patienten mit kolorektalen Läsionen mit sehr hoher Spezifität. Dieses System und alle derzeit verfügbaren Stuhl-DNA-Tests stellen jedoch einige allgemeine Probleme dar, die angegangen werden müssen (z. B. die Häufigkeit, mit der Tests durchgeführt werden sollten, und eine optimale Anzahl von Stuhlproben, die zu jedem Zeitpunkt für jeden einzelnen Personen gesammelt werden). Der Hauptvorteil von FL-DNA ist jedoch die Möglichkeit, sie in Verbindung mit einem Test zu verwenden, der derzeit im CRC-Screening-Programm verwendet wird, dem immunchemischen fekten okkulten Bluttest (iFOBT). Tatsächlich können beide Tests an derselben Probe durchgeführt werden, wodurch die Kosten gesenkt und eine bessere Vorhersage des eventuellen Vorhandenseins von kolorektalen Läsionen erreicht werden kann.

Einleitung

Darmkrebs (CRC) leitet sich von einem mehrstufigen Prozess ab, bei dem sich gesundes Epithel langsam zu Adenomen oder Polypen entwickelt, die im Laufe der Zeit zu bösartigen Karzinomen übergehen^1,2. Trotz der hohen Inzidenzrate des SCR wurde in den letzten zehn Jahren ein rückläufiger Trend beim Anteil der Todesfälle beobachtet³. Tatsächlich haben frühdiagnostische Instrumente, die in Screening-Programmen eingesetzt werden, zur Früherkennung und Entfernung von präneoplastischen Adenomen oder Polypen⁴geführt. Aufgrund der unterschiedlichen technischen Grenzen ist jedoch keine dieser Methoden optimal. Um die Empfindlichkeit und Spezifität zu verbessern, wurden viele Stuhl-DNA-Tests allein oder in Kombination mit aktuellen Routinediagnostiktests^{vorgeschlagen 5,6}.

Typischerweise, gesunde Schleimhaut vergießt in den Fäkalstrom apoptotische Kolonozyten, während kranke Schleimhaut Peeling nicht-apoptotische Kolonozyten. Fragmente von 200 bp oder mehr in der Länge charakterisieren nicht-apoptotische DNA. Diese DNA wird lange DNA (L-DNA) genannt und ist zu einem nutzbaren Biomarker für die CRC-Frühdiagnose geworden. Die L-DNA kann aus Stuhlproben isoliert und mit qPCR mit einem in vitro diagnostischen FL-DNA Kit^{7,8,9,10,11,12}quantifiziert werden.

Der Test besteht aus zwei Assays zum Nachweis von FL-DNA-Fragmenten im Bereich von 138 bp bis 339 bp. Jeder Assay ermöglicht die Amplifikation von FL-DNA (FAM) sowie Spike-in-DNA (HEX). Um eine optimale Verstärkung aller Fragmente zu gewährleisten, wurde der Test in zwei Assays (genannt "A" und "B") unterteilt. Der A-Test erkennt zwei Regionen von Exon 14 des APC-Gens (NM_001127511) und ein Fragment von Exon 7 des TP53-Gens (NM_001276760). Der B-Test erkennt ein Fragment von Exon 14 des APC-Gens (NM_001127511) und zwei Regionen der Exons 5 und 8 des TP53-Gens (NM_001276760). Die Assays unterscheiden nicht zwischen den erkannten Regionen. Die Spike-in-DNA entspricht der Oncorhynchus Keta Lachs DNA und ermöglicht die Überprüfung, ob das Verfahren ordnungsgemäß durchgeführt wurde und überprüft das mögliche Vorhandensein von Inhibitoren, die zu falschen negativen Ergebnissen führen können. Die FL-DNA-Konzentration wird durch absolute Quantifizierung nach der Standardkurvenmethode ausgewertet und als ng/Reaktion ausgedrückt.

Die FL-DNA-Methode ist ein nicht-invasiver und kostengünstiger Stuhl-DNA-Test, der in Kombination mit dem immunchemischen fäkalen okkulten Bluttest (iFOBT) derzeit in CRC-Screening-Programmen verwendet wird und bessere Vorhersagen von CRC- und/oder Hochrisiko-Adenomaläsionen^{ermöglicht 12}.

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Protokoll

Die Patienten wurden zwischen 2013 und 2015 am Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) in Meldola (FC, Italien) rekrutiert. Die eingeschriebenen Patienten wurden in das Protokoll IRSTB002 aufgenommen, das von der Ethikkommission von IRST - IRCCS AVR genehmigt wurde (25/10/2012, ver. 1). Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Von allen Patienten wurde eine schriftliche Einwilligung eingeholt.

1. DNA-Extraktion aus dem Stuhl

1. Verwenden Sie ein Kit, um Stuhlproben vorzubereiten (siehe Materialtabelle). Wählen und behandeln Sie das Fäkalienmaterial, indem Sie die Extraktion gemäß den Anweisungen des Herstellers durchführen. Verstärken Sie die gereinigte DNA direkt oder speichern Sie sie bei -20 °C für die nachfolgende Analyse.

2. Herstellung von Positivkontrolle, Standards, Spike-in-DNA und klinischen Proben

1. Erstellung von Normen und Proben
   1. Um die positive Kontrolle, Standards, Spike-in-DNA und alle klinischen Proben vorzubereiten, zentrifugieren Sie ein Aliquot aus positiver Kontrolle, Standards und Spike-in-DNA, und setzen Sie dann jedes Reagenz durch Zugabe der richtigen Menge an bereitgestelltem Wasser wieder aus (siehe unten). Dann, vorsichtig Wirbel die positive Kontrolle, Standard, und Spike-in-DNA, dann Zentrifuge für 10 s. Um eine vollständige Resuspension der trockenen Reagenzien zu erreichen, lagern Sie die flüssigen Reagenzien vor Gebrauch 30 min bei Raumtemperatur (RT).
      1. Die positive Kontrolle ist menschliche DNA in einem trockenen Format. Setzen Sie jedes Aliquot mit 750 l Wasser auf.
      2. Die Spike-in-DNA ist Lachs (Oncorhynchus keta) DNA, die als exogene interne Kontrolle verwendet wird, um das mögliche Vorhandensein von Inhibitoren in DNA-Proben aus Stuhl extrahiert zu überprüfen. Setzen Sie jedes Aliquot mit 100 l Wasser auf.
   2. Um die Standardkurve vorzubereiten, produzieren Sie vier 1:5 Verdünnungen ausgehend von der Lagerlösung. Die Standardpunkte müssen 10 ng/Reaktion, 2 ng/Reaktion, 0,4 ng/Reaktion und 0,08 ng/Reaktion sein.
2. Vorbereitung der 1x Spike-in-DNA
   1. Bereiten Sie die Spike-in-DNA-Kontrolle direkt vor der Verwendung vor.
   2. Bereiten Sie die 1x Spike-in-DNA-Kontrolle vor, indem Sie 5 l FL-DNa-Spitze mit 20 l sterilem Wasser mischen. Die Anzahl der 1x Spike-in-DNA-Kontrollproben wird entsprechend der Anzahl der zu analysierenden Proben sowie der positiven Kontrolle erstellt.
3. Vorbereitung von Proben
   1. Mischen Sie 75 l der Proben (klinische Proben oder Positivkontrolle) mit 25 l 1x Spike-in-DNA, was zu einem Gesamtvolumen von 100 l führt.

3. Amplifikation und Bestimmung des FL-DNA-Wertes mit qPCR Easy PGX

HINWEIS: Vollständige Amplifikationsmischungen mit spezifischen Primern und Sonden, die auf die menschliche DNA und die interne Kontrolle abzielen, werden in einem lyophilisierten Format in 8 Well-Streifen für FL-DNA Mix A und FL-DNA Mix B bereitgestellt. Standards, positive und negative Kontrollen sowie Proben müssen mit beiden lyophilisierten Mischungen verstärkt werden. Klinische Proben dürfen nur mit beiden lyophilisierten Mischungen doppelt verstärkt werden.

1. Siehe Tabelle der Materialien für qPCR-Instrument und Bediensoftware.
   1. Öffnen Sie die Bediensoftware und richten Sie die Platte und das Wärmeprofil ein:
      1. Richten Sie die Platte wie in Tabelle 1dargestellt ein.
         1. Legen Sie den Brunnentyp für alle acht Positionen in Spalte 1 als Standardfest.
         2. Stellen Sie den Brunnentyp für die Brunnen A2 und B2 als NTCein.
         3. Legen Sie den Brunnentyp für C2 und D2 (die positiven Steuerelemente) als Unbekanntfest.
         4. Legen Sie den Brunnentyp für alle anderen Positionen als Unbekannt fest.
         5. Wählen Sie alle 96 Positionen aus, und fügen Sie die Dyes FAM und HEXhinzu. Klicken Sie auf Sync Plate.
      2. Stellen Sie das Wärmeprofil gemäß Tabelle 2ein.
   2. Zentrifugieren Sie die benötigte Anzahl von Streifen für 10 s, um den Inhalt auf den Boden des Rohres zu bringen.
   3. Entfernen Sie vorsichtig die Dichtungen von den Streifen, während Sie darauf achten, den Inhalt zu behalten, und fügen Sie zu den jeweiligen Streifen: Negativkontrolle: 20 L Wasser; Probe: 20 L DNA; Standardkurve: 20 l der Norm 1, 2, 3 oder 4; Positivkontrolle: 20 L positiv kontrollierbar.
   4. Schließen Sie alle Streifen mit den 8 Streifen flachen optischen Kappen und Wirbel für einige Sekunden sorgfältig.
   5. Zentrifugieren Sie die Streifen für 10 s und laden Sie sie in das Instrument. Starten Sie dann den Lauf.

4. Datenanalyse

HINWEIS: Die Datenanalyse kann je nach Software automatisch oder manuell durchgeführt werden (siehe Materialtabelle).

1. Wählen Sie am Ende des Laufs die Spalten A, C, E, G für "FAM: FL-DNA-A" und "HEX: IC"und die Spalten B, D, F, H für "FAM: FL-DNA-B" und "HEX: IC"aus.
2. Stellen Sie für die Standardmengen Ausgangsmengefolgendes auf: 10 ng/Reaktion für A1- und B1-Bohrungen, 2 ng/Reaktion für C1 und D1, 0,4 ng/Reaktion für E1 und F1 und 0,08 ng/Reaktion für G1 und H1.
3. Legen Sie Schwellenwertfluoreszenzwerte für FAM-Kanäle (FL-DNA A und FL-DNA B) und HEX (IC) auf 150 fest.
4. KlickenSie im Feld Ergebnistabelleauf Spaltenoptionen | Alle auswählen | Ok, um die Ergebnisse in beiden Kanälen mit ihren jeweiligen Cq-Werten (-R) und -R-Lastwerten zu erhalten.
   HINWEIS: Diese Werte werden von der Real Time PCR-Instrumentensoftware bereitgestellt. Die letzte R entspricht dem fluoreszenzwert, der auf den letzten Amplifikationszyklus normalisiert wurde.
5. Klicken Sie im Feld Ergebnistabelle mit der rechten Maustaste auf die Tabelle, um das Kontextmenü zu öffnen, und klicken Sie auf An Excel senden, um die Rohdaten zu exportieren.
6. Überprüfen Sie die Werte der Standards, um die Eignung der Standardkurve zu überprüfen.
7. Überprüfen Sie für jeden FL-DNA-Mix die^R2-Spalte ["R2 (R)" und die Effizienz ["Effizienz (%)" Spaltenwerte. Wenn sie sich in einem akzeptablen Bereich befinden, ist es möglich, die Analyse entsprechend den Anweisungen des Herstellers fortzusetzen (Tabelle 3).
8. Wenn die Ergebnisse des FAM-Kanals nicht im erwarteten Bereich liegen, lassen Sie einen Punkt der Standardkurve weg, und analysieren Sie den Lauf erneut.
9. Bestimmen Sie die Werte der negativen und positiven Steuerelemente mit der folgenden Formel, wobei die "No Cq"-Werte als Null berücksichtigt werden:
   
   
10. Vergleichen Sie die erhaltenen Werte mit den in Tabelle 4genannten Werten.
11. Wenn sich die Reaktionssteuerungen im Bereich der erwarteten Werte befinden, fahren Sie mit der Analyse der Proben fort.
    ANMERKUNG: Stellen Sie sicher, dass die erhaltenen Cq-Werte aus einer realen Amplifikationsreaktion (sigmoidale Fluoreszenzkurve) und nicht aus einem Artefakt (lineare Fluoreszenzkurve) generiert werden.
12. Um die Eignung der Probe für jeden FL-DNA-Mix zu analysieren, vergleichen Sie die Cq-Werte des HEX-Kanals. Wenn der Wert 16 € beträgt, fahren Sie mit der Analyse der Proben fort. Wenn der Wert <16 ist oder kein Cq vorhanden ist, ist dies wahrscheinlich auf einen Dosierfehler des FL-DNA Spike zurückzuführen. Daher ist es nicht möglich, die Proben zu analysieren.
13. Berechnen Sie den Mittelwert der Cq-Werte im "HEX"-Kanal der Positivsteuerung mit der folgenden Formel:
    
14. Berechnen Sie den Mittelwert der Cq-Werte im "HEX"-Kanal der Stichprobenreplikationen mit der folgenden Formel:
    
15. Berechnen Sie die CqHEX-Werte nach der folgenden Formel:
    
16. Vergleichen Sie die CqHEX-Werte der Stichproben mit den in Tabelle 5.
17. Vergleichen Sie für jede Mischung (Mix A und Mix B) die Cq-Werte des FAM-Kanals mit den in Tabelle 6 gemeldeten Werten.
18. Um den FL-DNA-Wert jeder geeigneten Probe zu bestimmen, verwenden Sie die folgende Formel, wobei die "No Cq"-Werte als Null betrachtet werden:
    
    
    HINWEIS: Das Darmkrebsrisiko und die Prävalenz sind eine Funktion von iFOBT- und FL-DNA-Auswertungen gemäß den Von Rengucci et al.¹² (Tabelle 7) erhaltenen Fagan-Nomogramm-Ergebnissen.

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Ergebnisse

Der Workflow dieses Protokolls ist in Abbildung 1dargestellt. Der Workflow bietet zwei Steuerungsschritte und verschiedene Aktionen entsprechend diesen Schrittergebnissen. Erstens: Wenn eine Probe ungeeignete Kontrollen enthält, muss die Verstärkung wiederholt werden. Zweitens: Wenn die Verstärkung gehemmt wird, muss die Probe von Anfang an aufbereitet oder als nicht wertvoll eingestuft werden.

Abbildung 2 zeigt die Fluoreszenzkurven, die durch positive und...

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Diskussion

Frühere Studien haben gezeigt, dass die DNA-Integritätsanalyse von Hockern, die durch manuelle und halbautomatische Ansätze extrahiert wurden, ein alternatives Werkzeug zur Früherkennung von kolorektalen Läsionen darstellen kann^7,8,^9,,10,11,12. Molekulare, nichtinvasive Screening-Tests wurden im Laufe der Jahre für den ...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL and 2 mL polypropylene twist-lock tubes (DNase-, RNase-, DNA-, PCR inhibitor-free)			Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
Absolute Ethanol (quality of analytical degree)			Reagent required for DNA extraction
Benchtop centrifuge			Maximum speed of 20000 x g. Instrument required for DNA extraction
EasyPGX analysis software version 2.0.0	Diatech Pharmacogenetics	RT800-SW	Analysis software
EasyPGX centrifuge/vortex 8-well strips	Diatech Pharmacogenetics	RT803	Instrument recommended for the Real Time PCR assay
EasyPGX qPCR instrument 96	Diatech Pharmacogenetics	RT800-96	Instrument recommended for the Real Time PCR assay
EasyPGX ready FL-DNA	Diatech Pharmacogenetics	RT029	Kit required for the Real Time PCR assay
Micropipettes (volumes from 1 to 1.000 µL)			Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
Powder-free disposable gloves			Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
QIAamp Fast DNA Stool	Qiagen	51604	Kit recommended for the DNA extraction and purification from stool
Sterile filter tips DNase-, RNase-free (volumes from 1 to 1.000 µL)			Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
Thermal block e.g. EasyPGX dry block	Diatech Pharmacogenetics	RT801	Instrument required for DNA extraction
Vortex e.g. EasyPGX centrifuge/vortex 1.5 ml	Diatech Pharmacogenetics	RT802	Instrument required for DNA extraction