Die Verwendung von drohenden visuellen Stimuli zur Bewertung der Maus Vision

Zusammenfassung

Um die Sicht der Maus zu untersuchen, haben wir einen sich abzeichnenden Test durchgeführt. Mäuse wurden in einer großen quadratischen Arena mit einem Monitor an der Decke aufgestellt. Der sich abzeichnende visuelle Reiz rief konsequent Gefrier-oder Flugreaktionen bei den Mäusen hervor.

Zusammenfassung

Das visuelle System im zentralen Nervensystem verarbeitet diverse visuelle Signale. Obwohl die Gesamtstruktur von der Netzhaut über den seitlichen geniculaten Kern bis zum visuellen Kortex charakterisiert wurde, ist das System komplex. Zelluläre und molekulare Studien wurden durchgeführt, um die Mechanismen zu beleuchten, die der visuellen Verarbeitung zugrunde liegen, und damit auch Krankheitsmechanismen. Diese Studien können zur Entwicklung künstlicher visueller Systeme beitragen. Um die Ergebnisse dieser Studien zu validieren, ist eine Verhaltensvision notwendig. Hier zeigen wir, dass das sich abzeichnende Stimulationsexperiment ein zuverlässiger Maus-Vision-Test ist, der eine relativ einfache Einrichtung erfordert. Das sich abzeichnende Experiment wurde in einem großen Gehege mit einem Unterstand in einer Ecke und einem Computermonitor an der Decke durchgeführt. Eine CCD-Kamera, die neben dem Computermonitor positioniert war, diente dazu, das Mausverhalten zu beobachten. Eine Maus wurde für 10 Minuten in das Gehege gelegt und durfte sich an die Umgebung angleichen und die Umgebung erkunden. Dann projizierte der Monitor einen programmabgeleiteten, sich abzeichnenden Reiz 10-mal. Die Maus reagierte auf die Reize entweder durch Einfrieren oder durch die Flucht in das Versteck. Das Verhalten der Maus vor und nach den sich abzeichnenden Reizen wurde aufgezeichnet und das Video mit Motion Tracking Software analysiert. Die Geschwindigkeit der Mausbewegung hat sich nach den sich abzeichnenden Reizen deutlich verändert. Bei blinden Mäusen wurde dagegen keine Reaktion beobachtet. Unsere Ergebnisse zeigen, dass das einfache, sich abzeichnende Experiment ein zuverlässiger Test für die Maussicht ist.

Einleitung

Das visuelle System beginnt an der Netzhaut, wo visuelle Signale von Photorezeptoren erfasst, in bipolare Zellen (2^.Ordnung Neuronen) geleitet werden, und schließlich an Ganglienzellen (3^rd. Ordnung Neuronen) übergeben. Netzhaut 2^nd-und 3^rd-ordnen Neuronen werden angenommen, um mehrere neuronale Wege zu bilden, die bestimmte Aspekte der visuellen Signalgebung wie Farbe, Bewegung oder Form vermitteln. Diese vielfältigen visuellen Merkmale werden auf den seitlichen geniculaten Kern und den visuellen Kortex übertragen. Im Gegensatz dazu werden visuelle Signale, die zur Augenbewegung führen, an den überlegenen Colliculus gesendet. Klassischerweise wurden zwei retinokortische Wege identifiziert: Die magnozellulären und die parvamentulären Wege. Diese Wege kodieren bewegliche bzw. stationäre Objekte und ihre Existenz verkörpert das Grundkonzept der parallelen Verarbeitung^{1,2, 3, 4,5, 6}. Platz Vor kurzem wurden mehr als 15 Arten von bipolaren Zellen^7,8,9,10^,11 und Ganglienzellen 12^{, 13,14 ,15,16} wurden in der Netzhaut vieler Arten gemeldet, darunter auch der Primaten Netzhaut. Diese Zellen unterscheiden sich nicht nur durch morphologische Aspekte, sondern auch durch den Ausdruck von verschiedenen Markern und Genen 8^,10^{, 17,18,}was darauf hindeutet, dass verschiedene Merkmale von Die visuellen Signale werden parallel verarbeitet, was komplizierter ist als ursprünglich angenommen.

Zelluläre und molekulare Technologien haben dazu beigetragen, dass wir die visuelle Verarbeitung und mögliche Krankheitsmechanismen verstehen, die sich aus aberwitziger visueller Verarbeitung ergeben können. Ein solches Verständnis kann zur Entwicklung künstlicher Augen beitragen. Obwohl zelluläre Untersuchungen und Analysen fundiertes Wissen auf zellulärer Ebene bieten, würde eine Kombination aus Verhaltensexperimenten und zellulären Experimenten unser aktuelles Verständnis von minutenlangen visuellen Prozessen deutlich erweitern. So hat Yoshida et al^{. 19} herausgefunden, dass Starburst-Amacrine-Zellen die Schlüsselneuronen für die Bewegungserkennung in der Maus-Netzhaut sind. Im Anschluss an zelluläre Experimente führten sie das optokinetische Nystagmus (OKN) Verhaltensexperiment durch, um zu zeigen, dass mutierte Mäuse, bei denen starburse Amacrine-Zellen dysfunktional waren, nicht auf bewegte Objekte reagierten und damit ihre zelluläre Bestätigung für ihre zelluläre Untersuchungen. Darüber hinaus führte Pearson et al^{. 20} eine Photorezeptor-Transplantation in der Maus-Netzhaut durch, um das Sehvermögen bei erkrankten Mäusen wiederherzustellen. Sie führten nicht nur zelluläre Experimente durch, sondern vermessenten auch das Mäuseverhalten durch den Einsatz von Otomotoren-Antwortaufnahmen und Wasserlabyrinth-Aufgaben, so dass Pearson et al. zu überprüfen war, ob transplantierte Photorezeptoren das Sehvermögen in der ehemals blinden Mäuse. Zusammengenommen sind Verhaltensexperimente starke Werkzeuge, um die Sicht der Maus zu beurteilen.

Für die Messung der Maussicht stehen mehrere Methoden zur Verfügung. Diese Methoden haben Vorteile und Grenzen. In vivo gibt ERG Auskunft darüber, ob die Maus-Netzhaut, insbesondere Photorezeptoren und auf bipolaren Zellen, angemessen auf Lichtreize reagiert. ERG kann entweder unter scotopic oder photopischen Bedingungen 21^,22getestet werden. ERG benötigt jedoch eine Anästhesie, die die Ausgangsmessung²³beeinflussen kann. Der optokinetische Reflex (OKR) oder die optomotorische Reaktion (OMR) ist eine robuste Methode, um Kontrastempfindlichkeit und räumliche Auflösung zu beurteilen, beides funktionale Komponenten der Maussicht. OKR benötigt jedoch eine Operation, um ein Fixierungsgerät am Mausschädel^{24 anzubringen}. OMR erfordert weder eine Operation noch ein Maustraining; Es erfordert jedoch eine Ausbildung, damit ein Experimentator subtile Mauskopfbewegungen subjektiv erkennt, als Reaktion auf ein bewegliches Gitter in einer optischen Trommel^25,26. Schülerreflexe misst die Verengung der Schüler als Reaktion auf die Lichtreize, die keine Anästhesie erfordern und objektive und robuste Reaktionen zeigen . Obwohl der Pupillenreflex die Netzhautlichtreaktion in vivo simuliert, wird der Reflex vor allem durch die intrinsisch lichtempfindlichen Netzhautganglionzellen ( ipRGCs) 27 vermittelt. Da ipRGCs eine kleine Minderheit von RGCs darstellen und nicht als konventionelle bildbildende Ganglienzellen dienen, liefert diese Messung keine Informationen über die Mehrheit der Ganglienzellen.

Das sich abzeichnende Lichtexperiment galt bisher nicht als wichtiger Test zur Messung der Maussicht. Es handelt sich aber auch um einen robusten und zuverlässigen Sehtest über verschiedene Arten, wie zum Beispiel Maus^28,29, Zebrafisch³⁰, Heuschrecken 31^,32und menschliche^{33, 34, 35}. Wichtig ist, dass das sich abzeichnende Experiment^einevon nur wenigen Methoden ist, um den bildbildenden Weg zu testen-es ist kein Reflexpfad-, da die visuellen und die limbischen Systeme im zentralen Nervensystem an diesem Kreislauf beteiligt sind 36^{, 37,38}. Wir haben ein sich abzeichnendes visuelles Stimulussystem etabliert und seine Fähigkeit unter Beweis gestellt, die Bewegungserkennung in der Maus zu entlocken, die wir als Proxy verwenden, um die Unversehrtheit des visuellen Maussystems zu beurteilen.

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Protokoll

Alle Experimente und die Tierpflege wurden in Übereinstimmung mit dem Protokoll durchgeführt, das von den Institutionellen Tierschutzkomitees der Wayne State University genehmigt wurde (Protokoll Nr. 17-11-0399).

1. Vorbereitung auf das Experiment

1. Bauen Sie ein rechteckiges, offenes Deckelgehäuse, um die Maus während der sich abzeichnenden visuellen Reize Präsentation unterzubringen. Wir haben ein 40 cm x 50 cm x 33 cm großes Gehäuse mit Aluminiumrahmen und PVC-Paneelen (Abbildung1A, B) konstruiert. Legen Sie ein Blatt Papier auf den gesamten Boden des Gehäuses, um eine einfache Reinigung zwischen den Versuchen zu gewährleisten. Fügen Sie einen undurchsichtigen Unterstand in einer Ecke des Gehäuses mit einem Eingang zur Mitte der Arena für einen einfachen Eingang und Ausgang.
2. Richten Sie eine Kamera mit einem Weitwinkelobjektiv ein, um das Verhalten der Maus zu erfassen. Sichern Sie die Kamera an einem Tischständer neben dem Gehäuse. Für die beste Videoaufnahme verwenden Sie eine Kamera-Bildfrequenz von 60 FPS oder höher.
3. Richten Sie einen Computermonitor oben auf dem Gehäuse ein. Da der Monitor von außen nicht zu sehen war, wurde ein zweiter Monitor vorbereitet, der die auf dem Primärmonitor gezeigten Bilder dupliziert.
4. Bereiten Sie ein sich abzeichnendes Muster für die Projektion vor. Eine Möglichkeit, dies zu tun, ist, die PsychToolbox3 innerhalb der MatLab-Software zu verwenden, um für einen sich ausdehnenden schwarzen Kreis zu programmieren (Abbildung1C). Setzen Sie den Reiz in einem visuellen Winkel von 2 ° beginnen und erweitern Sie auf 50 ° über 250 ms; Diese Parameter bestimmen die Reizgeschwindigkeit (siehe Abbildung 1D für die visuelle Winkelberechnung). Stellen Sie den Code so ein, dass er den Reiz 10-mal mit einem Intervall von 1 s wiederholt.
   Hinweis: Der Stimulus begann jede Wiederholung unmittelbar nach Beendigung der vorherigen Präsentation. Weitere Informationen zur Konjunkturpräsentation finden Sie in Abschnitt 3.
5. Wählen Sie Mäuse, die für die sich abzeichnenden Reize interessant sind. Verwenden Sie hier 32 gesäuäugte Mäuse mit einem C57-Hintergrund, männlich und weiblich, 4 bis 14 Wochen alt. Verwenden Sie auch 3 blinde Mäuse (schwere Katarakte in beiden Augen), um zu beurteilen, ob die Reaktion auf drohende Reize wirklich ein visuell gelenktes Verhalten war. Diese blinden Mäuse hatten keinen Pupillenlichtreflex und keine Otomotorreaktion.

2. Mausakklimatisierung

1. Legen Sie eine Maus in das Gehege und lassen Sie sie frei ihre Umgebung erkunden. Wenn möglich, versuchen Sie, Stress während der Tierübertragung zu minimieren, indem Sie die Rückseite Ihrer freien Hand als Rastplatz für die Maus verwenden, anstatt sie ohne Unterstützung hängen zu lassen. Die Maus sollte das gesamte Gehege sicher finden und das Versteck entdecken. Lassen Sie ein paar Essenspellets in der Ecke gegenüber der Schutzhütte, um die Maus zu ermutigen, außerhalb der Schutzhütte zu bleiben.
2. Lassen Sie die Maus überall von 7 bis 15 min29,39. Wir haben 10 Minuten Akklimatisierung vor dem Reiz erlaubt. Darüber hinaus kann 10 Minuten Akklimatisierung einen Tag vor dem Experiment die Mäuse erleichtern.

3. Drohende visuelle Reize Projektion

1. Bevor Sie die Maus in die Arena einfügen, stellen Sie sicher, dass der Stimulus-Code bereit ist, zu laufen, um so wenig Lichtänderungen wie möglich zu erleichtern, während die Maus im Gehäuse ist. Sobald die Software bereit ist, zu laufen, legen Sie sanft die Maus in das Gehäuse.
2. 10 Sekunden vor der Stimulation starten Sie die Videoaufnahme.
3. Starten Sie die sich abzeichnenden visuellen Reize, wenn die Maus weg vom Tierheim ist und sich frei in der offenen Arena bewegt. Warten Sie 10 Sekunden nach der letzten Stimulus-Präsentation, um die Aufnahme zu beenden.
   1. Beginnen Sie die Reizpräsentation, wenn die Maus in der Ecke am weitesten von der Schutzhütte entfernt ist. Wenn Mäuse jedoch nicht gewillt sind, die ferne Ecke zu erkunden, präsentieren Sie den Reiz, wenn die Maus in einer anderen Ecke der Arena ist. Das scheint bei der tierischen Verhaltensreaktion keinen Unterschied zu machen.
4. Übertragen Sie die Maus zurück in ihren ursprünglichen Käfig. Reinigen Sie das Gehege für die nächste Maus, indem Sie die Wände und Zuflucht mit 70% Ethanol besprühen und abwischen. Ersetzen Sie die Papierbodenschläuchen, wenn sie verschmutzt werden, und legen Sie die Schutzhütte an den gleichen Ausgangspunkt um, wenn sie während der Tierübertragung und der Gehäßreinigung verlegt werden.

4. Videoanalyse

1. Speichern Sie den Videoclip für jede Maus im .avi-Format ohne Dateikomprimierung, um keinen Datenverlust bei der Übertragung auf die Analysesoftware zu gewährleisten.
   Hinweis: Mangelnde Komprimierung führt zu einer größeren Dateigröße; Verwenden Sie daher externe Festplatte für die Speicherung.
2. Verwenden Sie Analysesoftware, um die Bewegung des Tieres in der Arena vor, während und nach der Präsentation des Stimulus zu verfolgen. Verwenden Sie kommerziell erhältliche Software (siehe Materialtabelle) mit manueller Tracking-Fähigkeit, um die Position des Mauskopfes in jedem Videorahmen zu verfolgen, der X und Y-Koordination aller 1/60 ms generiert hat. )⁴⁰ und EthoVision (Noldus).
3. Berechnen Sie die Geschwindigkeit und die Entfernung der Maus von der Schutzhütte. Wenn das Bild der Arena durch den Videowinkel verzerrt ist, korrigieren Sie die X-und Y-Koordination vor der Berechnung (Abbildung2).
4. Vergleichen Sie die Parameter vor und nach dem Beginn des sich abzeichnenden Stimulus, um festzustellen, wie die Maus auf die Reize reagierte, sei es durch Einfrieren,Flucht oder keine Änderung des Verhaltens 29. Definieren Sie das Einfrieren als Episoden, bei denen die Geschwindigkeit weniger als 20 mm/s für 0,5 s oder länger betrug. Definieren Sie den Flug als Episoden, bei denen die Geschwindigkeit auf 400 mm oder größer stieg und endete mit der Maus in der Schutzhütte. Definitionen für das Einfrieren und Fliegen wurden auf den Definitionen von Franceschi et al.^{29 festgelegt.}

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Ergebnisse

Eine Maus mit gesunden Augen wurde in das Gehege gelegt und durfte sich für 10 Minuten akklimatisieren. Die Arena mit dem Monitor an der Decke wurde unter mesopischen Lichtverhältnissen (7 x 10⁵ photons/μm²/s) gehalten. Während der Akklimatisierung erkundete die Maus den Raum und fand die undurchsichtige Kuppel als Zufluchtsort. Als sich die Maus von der Schutzhütte entfernte, begann die Videoaufnahme, gefolgt von der Initiierung des visuellen Reizes. Als Reaktion auf den sich abzeichnenden Rei...

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Diskussion

Mit dem sich abzeichnenden visuellen Reizsystem mehrheitlich (97%) Gesunde Augenmäuse zeigten Fluchtreaktion. Einer von 29 Mäusen zeigte keine offensichtliche Fluchtreaktion. Die Maus ging jedoch in Richtung der Kuppel und blieb in ihrer Nähe, bis die sich abzeichnende verschwand, was darauf hindeutet, dass die Maus zumindest vorsichtig war, als die sich abzeichnenden Reize auftraten. Daher lösten die sich abzeichnenden Reize bei gesunden Mäusen immer wieder angeborene Angstreaktionen aus. Auf der anderen Seite zeig...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10.1" monitor (2° display)	Elecrow	Elecrow 10.1 Inch Raspberry Pi 1920x1080p Resolution Display
14" Business Class Laptop 5490	Dell	84 / rcrc961481-4860836
20" x 50" Absorbant Liners	Fisher Scientific	AL2050	works well to protect floor of arena, could use any type of liner
21.5" monitor (1° display)	Acer	Acer R221Q bid 21.5-inch IPS Full HD Display
CCD Camera	Lumenera Corporation	Infiniyy3S-1UR	excellent for behavioral studies due to high fps rate (60 fps)
Enclosure (alminum frames and PVC panels)	80/20 Inc.	4x cat.#9010, 4x cat.#9005, 1x cat.#9000, 5x cat.#65-2616	excellent, used quick build tab to find PVC, joints, and frame
Ethanol	Fisher Scientific	22-032-601
Excel Spreadsheet Software	Microsoft Office		user friendly and widespread knowledge of Microsoft Office software
Freearm	Amazon		used to mount camera to the table, could use any mountable extendable arm
ImagePro Premiere 3D	Media Cybernetics	version 9.3	good program, could use some updating with the automated tracking feature
Matlab software (Psychotoolbox 3)	MathWorks	Matlab R2018b 64-bit (9.5.0.944444)	excellent software to generate pattern stimuli of any conditions
SteamPix sorftware	Norpix	StreamPix 7 64-bit Single Camera	works well, a few problems with frame dropping but good customer service
WD My Book External Hard Drive	Western Digital	WDBBGB0080HBK hard drive 8 TB USB 3.0	necessary if using .avi files with no compression codec due to large size of files
Wide angle lens	Navitar	NMV-5M23	excellent and necessary to capture entire arena