In Vesiculo Synthese von Peptid Membran Vorläufer für autonomeve Vesikelwachstum

Zusammenfassung

Hier werden Protokolle zur Herstellung von peptidbasierten kleinen unilamellalaren Vesikeln vorgestellt, die wachstumsfähig sind. Um die Vesiculo-Produktion des Membranpeptids zu erleichtern, sind diese Vesikel mit einem Transkriptions-Translation-System und dem Peptid-kodierenden Plasmid ausgestattet.

Zusammenfassung

Die Abteilisierung biochemischer Reaktionen ist ein zentraler Aspekt synthetischer Zellen. Zu diesem Zweck dienen Peptid-basierte Reaktionsfächer als attraktive Alternative zu Liposomen oder fettsäurebasierten Vesikeln. Äußerlich oder innerhalb der Vesikel können Peptide leicht exprimiert werden und vereinfachen die Synthese von Membranvorläufern. Hier ist ein Protokoll zur Herstellung von Vesikeln mit Durchmessern von 200 nm auf Basis der amphiphilen Elastin-ähnlichen Polypeptide (ELP) unter Verwendung von Dehydrierung-Rehydratation aus Glasperlen vorgesehen. Ebenfalls vorgestellt werden Protokolle zur bakteriellen ELP-Expression und -Reinigung über inverseS Temperaturzyklierung sowie deren kovalente Funktionalisierung mit Fluoreszenzfarbstoffen. Darüber hinaus beschreibt dieser Bericht ein Protokoll, das die Transkription von RNA-Aptamer dBroccoli in ELP-Vesikeln als weniger komplexes Beispiel für eine biochemische Reaktion ermöglicht. Schließlich wird ein Protokoll zur Verfügung gestellt, das die Vesiculo-Expression von fluoreszierenden Proteinen und dem Membranpeptid ermöglicht, während die Synthese des letzteren zu einem Vesikelwachstum führt.

Einleitung

Die Schaffung von synthetischen lebenden zellulären Systemen wird in der Regel aus zwei verschiedenen Richtungen angegangen. Bei der Top-Down-Methode wird das Genom eines Bakteriums auf seine wesentlichen Bestandteile reduziert, was letztlich zu einer minimalen Zelle führt. Im Bottom-up-Ansatz werden künstliche Zellen de novo aus molekularen Komponenten oder zellulären Subsystemen zusammengesetzt, die funktional in ein konsistentes zellähnliches System integriert werden müssen.

Im de novo-Ansatz wird die Kompartimentierung der notwendigen biochemischen Komponenten in der Regel mit Membranen aus Phospholipiden oder Fettsäuren^1,2,3,4erreicht. Denn "moderne" Zellmembranen bestehen hauptsächlich aus Phospholipiden, während Fettsäuren als plausible Kandidaten präbiotischer Membrangehäuse^5,6gelten. Zur Bildung neuer Membranen oder zur Erleichterung des Membranwachstums müssen amphiphile Bausteine von außen⁷ oder idealerweise durch die Produktion innerhalb eines membranösen Fachs mit den entsprechenden anabolen Verfahren 4 ^,8.

Während die Lipidsynthese ein relativ komplexer Stoffwechselprozess ist, können Peptide recht leicht mit zellfreien Genexpressionsreaktionen^9,10produziert werden. Daher stellen Peptidmembranen, die durch amphiphile Peptide gebildet werden, eine interessante Alternative zu Lipidmembranen als Gehäuse für künstliche Zellmimiks dar, die¹¹wachsen können.

Amphiphile Elastin-ähnliche Diblock-Copolymere (ELPs) sind eine attraktive Klasse von Peptiden, die als Baustein für solche Membranen dienen können¹². Das grundlegende Aminosäuresequenzmotiv von ELPs ist (GaGVP)_n, wobei "a" eine beliebige Aminosäure außer Prolin und "n" die Anzahl der Motivwiederholungen^{13,14,15,16,17} . ELPs wurden mit einem hydrophoben Block erstellt, der hauptsächlich Phenylalanin für a enthält, und einem hydrophilen Block, der hauptsächlich aus Glutaminsäure^{besteht 11}. Je nach A- und Lösungsparametern wie pH- und Salzkonzentration weisen ELPs einen sogenannten inversen Temperaturübergang bei Temperatur T_tauf, bei dem die Peptide einen vollständig reversiblen Phasenübergang von einem hydrophilen zu hydroben zustand. Die Synthese der Peptide kann einfach in Vesikelmit dem Bakterienzellextrakt "TX-TL" implementiert werden^{11,18,19,20,21}, alle notwendigen Komponenten für gekoppelte Transkriptions- und Übersetzungsreaktionen.

Das TX-TL-System wurde zusammengekapselt, wobei die DNA-Vorlage die ELPs in ELP-Vesikel kodiert, wobei die Dehydrierung-Rehydratation von Glasperlen als feste Stütze verwendet wird. Die Bildung von Vesikel n.A. erfolgt durch Rehydrierung der getrockneten Peptide von der Perlenoberfläche¹¹. Es können andere Methoden²² zur Vesikelbildung eingesetzt werden, die möglicherweise eine geringere Polydispersität und größere Vesikelgrößen aufweisen (z. B. Elektrobildung, Emulsionsphasentransfer oder mikrofluidische Verfahren). Zur Prüfung der Lebensfähigkeit der Verkapselungsmethode kann alternativ die Transkription des fluorogenen Aptamers dBroccoli²³ verwendet werden¹¹, was weniger komplex ist als die Genexpression mit dem TX-TL-System.

Durch die Expression der Membranbausteine in vesiculo und deren anschließende Einbindungin die Membran beginnen die Vesikel 11 zu wachsen. Die Membranintegration der ELPs kann durch einen FRET-Assay nachgewiesen werden. Zu diesem Zweck werden die ELPs, die für die Bildung der ursprünglichen Vesikelpopulation verwendet werden, mit fluoreszierenden Farbstoffen in gleichen Teilen konjugiert, die ein FRET-Paar bilden. Bei Expression von nicht gekennzeichneten ELPs in vesiculo und deren Einbau in die Membran werden die beschrifteten ELPs in der Membran verdünnt und damit das FRET-Signal um¹¹abgenommen. Als vielseitige und gängige Methode zur Konjugation wird kupferkatalysierte Azid-Alkyn-Zyklusverwendet verwendet. Mit der Verwendung eines stabilisierenden Liganden wie Tris (Benzyltriazolylmethyl)-amin kann die Reaktion in einer wässrigen Lösung bei einem physiologischen pH-Wert ohne Hydrolyse von Reaktanten¹¹durchgeführt werden, die für Konjugationsreaktionen geeignet ist. Peptide.

Das folgende Protokoll enthält eine detaillierte Beschreibung der Vorbereitung für wachsende ELP-basierte Peptidosomen. Die Expression der Peptide und vesikelbildung mit der Glasperlenmethode werden beschrieben. Darüber hinaus wird beschrieben, wie die Transkription des fluorogenen dBroccoli Aptamers und die Transkriptions-Translation-Reaktion für die Proteinexpression innerhalb der ELP-Vesikel implementiert werden kann. Schließlich ist ein Verfahren für die Konjugation von Elp mit Fluorophoren vorgesehen, das verwendet werden kann, um das Vesikelwachstum durch einen FRET-Assay¹¹nachzuweisen.

Protokoll

1. Expression von Elastin-ähnlichen Polypeptiden

1. Tag 1: Vorbereitung einer Starterkultur und Vorräte für Peptidexpression
   1. Vorbereiten und Autoklavausdruckskulturkolben (4 x 2,5 l) und 3 L LB-Medium. Für 1 L LB Medium 25 g LB-Pulver zu 1 L Reinstwasser hinzufügen.
   2. Bereiten Sie eine Starterkultur mit 100 ml LB-Medium, 50 l sterilgefilterter (0,22-m-Filter)-Chloramphenicol-Lösung (25 mg/ml in EtOH) und 50 l sterilgefiltertem (0,22-mm-Filter) Carbenicillin-Lösung (100 mg/ml in 50 % EtOH und 50 % Reinstwasser) vor.
   3. Fügen Sie einen kleinen Streifen aus einem vorgefertigten Bakterienbestand hinzu, der den E. coli-Stamm BL21(DE3)pLysS mit dem pET20b(+)-Expressionsvektor kodiert, der die Polypeptidsequenz MGHGVGVP((GEGVP)₄(GVGVP))₄((GFGVP)₄(GVGVP))₃ (GFGVP)₄GWP (abgekürzt EF) zu einer vorgewärmten 100 ml Starterkultur und inkubieren bei 37 °C für 16 h mit 250 U/min in einem Schüttelinkubator (E. coli-Stämme und Vektoren sind auf Anfrage erhältlich).
   4. Die Ausdruckskulturkolben und die LB-Medien über Nacht bei 37 °C vorwärmen, so dass sie für den nächsten Tag vorbereitet werden.
2. Tag 2: Proteinexpression
   1. Fügen Sie 750 ml LB-Medium zu jedem Expressionskulturkolben, 375 l sterilgefilterten (0,22 m Filter) Chloramphenicol-Bestand (25 mg/ml in EtOH) und 375 l sterilgefilterten (0,22 -m-Filter) Carbenicillin-Bestand (100 mg/ml in 50% EtOH und 50% Ultrareinstwasser) hinzu.
   2. Nach dem Rühren, um die Antibiotika zu verteilen, nehmen Sie 2 ml des Mediums als Referenzprobe für die optische Dichtemessung bei 600 nm (OD₆₀₀).
   3. 7,5 ml der Startkultur zum Ausdruckskolben hinzufügen und 1 h bei 37 °C mit 250 U/min brüten.
   4. Nach diesem Schritt wird die OD₆₀₀ jedes Kolbens alle 20 min überprüft.
   5. Wenn die optische Dichte etwa 0,8 erreicht, reduzieren Sie die Temperatur auf 16 °C und induzieren Sie die Peptidexpression, indem Sie 750 l von 1 M steril-gefiltertem Isopropylthiogalactosid (IPTG) in reinem Wasser in jeden Expressionskolben einbauen.
   6. Inkubieren Sie den Expressionskolben mit den induzierten Bakterien bei 16 °C für 16 h mit 250 U/min.
3. Tag 3: Extraktion des exprimierten Polypeptids
   1. Den Zentrifugationskolben vorwiegen, um die Bestimmung der Masse des Zellpellets nach der Ernte zu ermöglichen.
   2. Ernten Sie alle Bakterien aus den Expressionskolben durch Zentrifugation für 20 min mit einer vorgekühlten Zentrifuge bei 4.000 x g und 4 °C.
   3. Gießen Sie den Überstand aus und blots die Zentrifugenflaschen auf ein steriles Papiertuch.
   4. Wiegen Sie die Zentrifugationskolben und berechnen Sie die Zellpelletmasse.
   5. Setzen Sie die Zellen, die von 750 ml der ursprünglichen Zellkultur nach unten pelletiert werden, in 15 ml phosphatgepufferter Saline (PBS, pH 7,4) durch Pipettieren und Zentrifuge bei 4.000 x g für 20 min bei 4 °C. Gießen Sie den Überstand aus und blots die Zentrifugenflaschen auf ein steriles Papiertuch.
   6. Das Zellpellet für den Lyseschritt in 2 ml Puffer pro 1 Gramm Zellpellet mit PBS (pH 7.4) mit Lysozym (1 mg/ml), 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 1 mM Benzamidin und 0,5 U DNase I, aufsetzen.
   7. Beschallen Sie die Zellen für die weitere Lyse auf Eis mit einem Beschallungsgerät bei 8 W für 9 min mit abwechselnd10 s Beschallung und 20 s Pausenschritten, gefolgt von einer 9-min Pause, in der die Probe auf Eis gekühlt werden sollte. Wiederholen Sie den 9 min Beschallungsschritt noch einmal.
   8. Fügen Sie 2 ml 10% (w/v) Polyethyleneimin (PEI) pro 1 L der ursprünglichen Zellkultur für Nukleinsäurefällung hinzu.
   9. Die Probe in 2 ml Zentrifugenröhrchen verteilen und bei 60 °C 10 min inkubieren, gefolgt von einer Inkubation für 10 min bei 4 °C.
   10. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 16.000 x g für 10 min bei 4 °C und sammeln Sie den Überstand, der das ELP enthält.
4. Proteinreinigung durch inverses Temperaturradfahren:
   1. Stellen Sie den Überstand auf einen pH-Wert von 2 ein, um den hydrophilen Teil des Peptids auf hydrophobe zu schalten und eine Aggregation zu induzieren. Zur Einstellung des pH-Wertes werden Phosphorsäure und Natriumhydroxid verwendet. pH-Streifen reichen aus, um den pH-Wert zu bestimmen.
   2. Um die Ausbeute der Reinigung der Probe zu verbessern, erhitzen Sie die Probe auf 60 °C und fügen Sie Natriumchlorid bis zu 2 M hinzu.
   3. Anschließend zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur (RT).
   4. Entsorgen Sie den Überstand und lösen Sie das Pellet in PBS wieder auf (aber nur die Hälfte des Anfangsvolumens wird im Vergleich zum vorherigen Schritt verwendet).
   5. Stellen Sie den pH-Wert mit Phosphorsäure und Natriumhydroxid auf 7 ein. pH-Streifen sind ausreichend genau, um den pH-Wert zu bestimmen.
   6. Zentrifugieren Sie die Probe anschließend bei 16.000 x g für 10 min bei 4 °C.
   7. Sammeln Sie den Überstand und wiederholen Sie die Schritte 1.4.1–1.4.6 bis 3x insgesamt, mit der Ausnahme, dass in der letzten Wiederholung von Schritt 1.4.4 nur Wasser anstelle von PBS hinzugefügt wird.
   8. Messen Sie die Konzentration der Peptide mit einem Absorptionsspektrometer. Verwenden Sie einen Aussterbekoeffizienten von 5500/M/cm bei 280 nm.
   9. Stellen Sie die Konzentration des ELP auf 700 m ein.

2. Vesikelproduktion mit der Glasperlen-Methode

1. Konzentrieren Sie die ELP-Lösung mit einem Zentrifugalvakuumkonzentrator auf 1,1 mM.
2. Mischen Sie 200 l der konzentrierten ELP-Lösung mit 1.250 l eines 2:1 Chloroform/Methanol-Gemischs, gefolgt von Wirbeln.
3. 1,5 g kugelförmige Glasperlen (212–300 m groß) zu einem runden Bodenkolben von 10 ml hinzufügen.
4. Fügen Sie die Lösung mit ELP und dem Chloroform/Methanol-Gemisch in den runden Bodenkolben und mischen Sie sie durch sanftes Schütteln.
5. Schließen Sie den Kolben an einen Rotationsverdampfer an. Stellen Sie die Drehzahl auf 150 Umdrehungen pro Minute ein und regulieren Sie den Druck auf -0,2 x 10⁵ Pa (-200 mbar) ca. 4 min, bis die Flüssigkeit bei Raumtemperatur verdampft ist.
6. Legen Sie den runden Bodenkolben mindestens 1 h in einen Trockenrestor, um sicherzustellen, dass die verbleibenden Chloroformen und Methanolverdampfen verdampfen. Um den Verlust der Glasperlen zu vermeiden, sollte lose befestigte Aluminiumfolie um die runde Bodenkolbenöffnung gewickelt werden.
7. Für ein einzelnes Experiment 100 mg der Peptid bedeckten Glasperlen mit 60 l der Quelllösung, wie PBS, mischen. Inkubieren Sie diese Probe bei 25 °C für 5 min.
8. Zentrifugieren Sie die Probe schnell mit einer Tischzentrifuge, um die Glasperlen zu sedimentieren.
9. Verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu sammeln, der die Vesikel enthält.

3. Transkription von RNA Aptamer dBroccoli In den Vesikeln

1. Reinigen Sie den Labortisch mit Tüchern, die die RNase-Dekontaminationslösung enthalten, um eine RNase-freie Arbeitsumgebung zu schaffen.
2. Mischen Sie die ssDNA (5 M) bestehend aus der T7-Promotor- und dBroccoli-Sequenz (GAGACGGTCGGGTCCTCTCTGAGACGGTCGGGTCCAGATATTCGTGTCTCTCTCGAGTAGAGTGTGTGGGGGCTC) sowie dem nicht kodierenden Strang (5 RNAPol-Reaktionspuffer [40 mM Tris-HCl (pH = 7,9), 6 mM MgCl₂, 1 mM Dithiothreitol (DTT) und 2 mM Spermidin], um die DNA-Vorlage für die Transkriptionsreaktion vorzubereiten.
3. Inkubieren Sie die Lösung bei 90 °C für 5 min, gefolgt von einem langsamen Temperaturabfall auf 20 °C für 30 min.
4. Bereiten Sie eine 1 mM (5Z)-5-(3,5-Difluor-4-hydroxybenzyliden)-2,3-dimethyl-3,5-dihydro-4H-imidazol-4-on (DFHBI) Lösung vor, indem Sie 1,26 mg DFHBI in 5 ml DMSO auflösen.
5. Vorbereitung der Transkriptionsreaktion durch Mischen des RNAPol-Reaktionspuffers [40 mM Tris-HCl (pH = 7,9), 6 mM MgCl₂, 1 mM Dithiothreitol (DTT) und 2 mM Spermidin] mit 125 mM KCl, 15 mM MgCl₂, 4 mM rNTP, 10 mM DFHBI, 200 nM DNA-Vorlage, 0,5 U/L Inhibitor murin und Wasser.
6. Unmittelbar vor Beginn der Reaktion 4 U/L T7-Polymerase hinzufügen.
7. Verwenden Sie diesen Reaktionsmix als Quelllösung in Schritt 2.7 und inkubieren Sie bei 37 °C für die Dauer des Experiments, die in der Regel 1 h beträgt.

4. Transkriptions-Übersetzung (TX-TL) Reaktion

HINWEIS: Für die Transkriptions-Translation-Reaktion wird ein roher Zellextrakt sowie Reaktionspuffer und DNA benötigt. Der Rohzellextrakt wird wie in Sun et al.¹⁸beschrieben hergestellt. Für eine TX-TL-Reaktion verwenden Sie Folgendes: 33% (v/v) des Rohextrakts E. coli, 42% (v/v) Reaktionspuffer und 25% (v/v) phenol-chloroform gereinigte DNA plus Additive. Die Endkonzentrationen betragen ca. 9 mg/ml Protein, 50 mM HEPES (pH = 8), 1,5 mM ATP, 1,5 mM GTP, 0,9 mM CTP, 0,9 mM UTP, 0,2 mg/ml tRNA, 26 mM Coenzym A, 0,33 mM NAD, 0,75 mM cAMP, 68 mM Folinsäure, 1 mM , 30 mM PEP, 1 mM DTT, 2% PEG-8000, 13,3 mM Maltose, 1 U T7 RNA Polymerase und 50 nM Plasmid-DNA in Reinstwasser.

1. Phenol-Chlorform-Reinigung der DNA-Schablone
   1. Bereiten Sie sechs Nachtkulturen mit 5 ml Medium und 5 l steril-gefilterter (0,22 m Filter) Carbenicillin-Lösung (100 mg/ml in 50% EtOH und 50% Reinstwasser) vor.
   2. Fügen Sie einen kleinen Streifen aus einem vorgefertigten Bakterienbestand, der DH5-E. coli mit dem pET20b(+)-Expressionsvektor enthält, zu jeder vorgewärmten 5 ml Nachtkultur hinzu und brüten bei 37 °C für 16 h mit 250 U/min. Je nachdem, welches Peptid (EF) oder Protein (YPet oder mVenus) exprimiert werden soll, wird ein spezifisches Kodierungsplasmid verwendet.
   3. Extrahieren Sie das Plasmid mit einem Mini-Prep-Kit, wie in der Bedienungsanleitung beschrieben oder durch Befolgung des Protokolls von Zhang et al.²⁴.
   4. Bereiten Sie 100 l der vorgereinigten Plasmid-DNA vor (die Konzentration kann zwischen 200–600 ng/l liegen) und mischen Sie sie mit 100 l Roti-Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (pH = 7,5–8,0) in einem Mikrozentrifugenrohr, um eine bessere Phasentrennung zu ermöglichen.
   5. Umkehren Sie das Rohr vorsichtig bis zu 6x und Zentrifuge für 5 min bei 16.000 x g bei RT.
   6. Fügen Sie der oberen Phase des Rohres 200 l Chloroform hinzu und invertieren Sie das Rohr bis zu 6x.
   7. Zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 x g für 5 min bei RT.
   8. Pfeifen Sie den Überstand auf ein separates Rohr und fügen Sie 10 l von 3 M Natriumacetat für die Ethanolfällung hinzu.
   9. 1 ml -80 °C kaltes Ethanol hinzufügen und die Probe bei -80 °C für 1 h lagern.
   10. Zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 x g für 15 min bei 4 °C.
   11. Den Überstand dekantieren und 1 ml -20 °C kaltes 70% (v/v) Ethanol hinzufügen.
   12. Zentrifuge bei 16.000 x g für 5 min bei 4 °C.
   13. Entfernen Sie die Flüssigkeit durch Pipettieren. Achten Sie darauf, das DNA-Pellet nicht zu stören.
   14. Lagern Sie die Probe ca. 15 min bei RT, um das verbleibende Ethanol zu verdampfen.
   15. Fügen Sie der Probe Reinstwasser hinzu, um die Probenkonzentration auf ca. 300 nM einzustellen, die durch Absorption bei 260 nm gemessen wird.
2. Vorbereitung der TX-TL-Reaktion
   1. Den vorbereiteten Rohzellextrakt und den Reaktionspuffer auf Eis auftauen.
   2. Für einen 60-L-Reaktionsmix die Plasmid-DNA (phenol-chloroform gereinigt) auf 37,5 l des Reaktionspuffers [50 mM HEPES (pH = 8), 1,5 mM ATP, 1,5 mM GTP, 0,9 mM CTP, 0,9 mM UTP, 0,2 mg/ml tRNA, 26 mM Coenzym A, 0,33 mM NAD , 0,75 mM cAMP, 68 mM Folinsäure, 1 mM Spermidin, 30 mM PEP, 1 mM DTT, 2% PEG-8000 und 13,3 mM Maltose), gefolgt von der Zugabe von 28,7 l Rohzellextrakt. Auf ein endreines Volumen mit Reinstwasser auf 58,8 l füllen.
   3. Unmittelbar vor Beginn der Reaktion 1,2 l der T7-RNA-Polymerase-Lösung hinzufügen und die Probe durch Pipettieren nach oben und unten mischen.
   4. Verwenden Sie diesen Reaktionsmix als Quelllösung in Schritt 2.7 und inkubieren Sie bei 29 °C für die Dauer des Experiments, die in der Regel 4–8 h beträgt.

5. Konjugation von Elastin-ähnlichen Polypeptiden mit Fluorophoren über Kupfer katalysierteS Aszid-Alkyn-Huisgen-Cycloaddition

1. Bereiten Sie eine 20 mM NHS-Azid-Linker -Lösung (Azidobutylsäure N-Hydroxysuccinimid-Ester) in DMSO vor.
2. Mischen Sie 250 l der ELP-Lösung (600 m) mit PBS (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 1,42 g/L Na₂HPO₄, 0,27 g/L K₂HPO₄, pH = 7,2) und NHS-Azid (1,2 mM) und inkubieren sie für 12 h bei RT.
3. Die Probe in eine 10 kDa Dialysekassette legen und bei 4 °C für 12 h in 1 L Reinstwasser lagern, um die Salze und das Rest-NHS-Azid zu entfernen.
4. Mischen Sie das aktivierte ELP (500 m) mit dem alkynkonjugierten Farbstoff (500 m), Cy5-Alkyn oder Cy3-Alkyn.
5. Mischen Sie diese Probe mit 1 mM TBTA (tris(benzyltriazolylylmethyl)amin), 10 mM TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphinhydrochlorid) und 10 mM CuSO₄ und inkubieren bei 4 °C für 12 h.
6. Die Probe in eine 10 kDa Dialysekassette geben und bei 4 °C für 12 h in 1 L Reinstwasser lagern, um die Salze und Restfarbstoffe zu entfernen.
7. Diese farbmodifizierten ELPs werden in einer 1:1-Mischung aus den Cy3-gekennzeichneten ELPs und den Cy5-gekennzeichneten ELPs analog zu den Peptiden im zweiten Teil verwendet.

Ergebnisse

Vesikelproduktion
Abbildung 1 zeigt Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) Bilder von Vesikeln, die mit verschiedenen Schwellungslösungen hergestellt wurden, und die Glasperlenmethode (siehe auch Vogele et al.¹¹). Für die Probe in Abbildung 1Awurde nur PBS als Quelllösung verwendet, um die Bildung von Vesikeln zu beweisen und ihre Größe zu bestimmen. Wenn TX-TL als Quelllösung verwendet wurde (

Diskussion

Filmrehydratation ist ein gängiges Verfahren zur Herstellung von kleinen unilamellalaren Vesikeln. Die Hauptursache des Versagens ist die falsche Handhabung der im Verfahren verwendeten Materialien.

Zunächst werden die ELPs von E. coli-Zellen produziert. Die Ausbeute nach der ELP-Reinigung kann je nachdem, wie sorgfältig das Protokoll während seiner entscheidenden Schritte durchgeführt wird, erheblich variieren. ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2xYT	MP biomedicals	3012-032
3-PGA	Sigma-Aldrich	P8877
5PRIME Phase Lock GelTM tube	VWR	733-2478
alkine-conjugated Cy3	Sigma-Aldrich	777331
alkine-conjugated Cy5	Sigma-Aldrich	777358
ATP	Sigma-Aldrich	A8937
Benzamidin	Carl Roth	CN38.2
BL21 Rosetta 2 E. coli strain	Novagen	71402
Bradford BSA Protein Assay Kit	Bio-rad	500-0201
cAMP	Sigma-Aldrich	A9501
Carbenicillin	Carl Roth	6344.2
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C1919
Chloramphenicol	Carl Roth	3886.3
Chloroform	Carl Roth	4432.1
CoA	Sigma-Aldrich	C4282
CTP	USB	14121
CuSO4	Carl Roth	P024.1
DFHBI	Lucerna Technologies	410
DMSO	Carl Roth	A994.1
DNase I	NEB	M0303S
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
Ethanol	Carl Roth	9065.2
Folinic acid	Sigma-Aldrich	F7878
Glass beads, acid-washed	Sigma-Aldrich	G1277
GTP	USB	16800
HEPES	Sigma-Aldrich	H6147
IPTG (β-isopropyl thiogalactoside )	Sigma-Aldrich	I6758
KCl	Carl Roth	P017.1
K-glutamate	Sigma-Aldrich	G1149
LB Broth	Carl Roth	X968.2
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876
Methanol	Carl Roth	82.2
MgCl2	Carl Roth	KK36.3
Mg-glutamate	Sigma-Aldrich	49605
Micro Bio-Spin Chromatography Columns	Bio-Rad	732-6204
NAD	Sigma-Aldrich	N6522
NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester)	Baseclick	BCL-033-5
PEG-8000	Carl Roth	263.2
pH stripes	Carl Roth	549.2
Phenylmethylsulfonyl fluoride	Carl Roth	6367.2
Phosphate-buffered saline	VWR	76180-684
Phosphoric acid	Sigma-Aldrich	W290017
Polyethyleneimine	Sigma-Aldrich	408727
Potassium phosphate dibasic solution	Sigma-Aldrich	P8584
Potassium phosphate monobasic solution	Sigma-Aldrich	P8709
Qiagen Miniprep Kit	Qiagen	27106
RNAPol reaction buffer	NEB	B9012
RNase inhibitor murine	NEB	M0314S
RNaseZap Wipes	ThermoFisher	AM9788
rNTP	NEB	N0466S
Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol	Carlroth	A156.1
RTS Amino Acid Sampler	5 Prime	2401530
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)	Thermo-Scientific	66382
Sodium chloride	Carl Roth	9265.1
Sodium hydroxide	Carl Roth	8655.1
Spermidine	Sigma-Aldrich	85558
Sterile-filtered (0.22 µm filter)	Carl Roth	XH76.1
T7 polymerase	NEB	M0251S
TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine)	Sigma-Aldrich	678937
TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride)	Sigma-Aldrich	C4706
Tris base	Fischer	BP1521
tRNA (from E. coli)	Roche Applied Science	MRE600
UTP	USB	23160