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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Der erste Schritt beim Verständnis der biomolekül-anorganischen Festphaseninteraktion ist die Aufdeckung grundlegender physikalisch-chemischer Konstanten, die durch die Etablierung von Adsorptionsisothermen bewertet werden können. Die Adsorption aus der flüssigen Phase wird durch Kinetik, Oberflächenkapazität, pH-Wert und Wettbewerbsadsorption eingeschränkt, die alle vor der Einstellung eines Adsorptionsexperiments sorgfältig berücksichtigt werden sollten.

Zusammenfassung

Grundlagen anorganisch-organischer Wechselwirkungen sind bei der Entdeckung und Entwicklung neuartiger Bioschnittstellen, die für den Einsatz in Biotechnologie und Medizin geeignet sind, von entscheidender Bedeutung. Jüngste Studien deuten darauf hin, dass Proteine über begrenzte Adsorptionsstellen mit Oberflächen interagieren. Proteinfragmente wie Aminosäuren und Peptide können zur Interaktionsmodellierung zwischen komplexen biologischen Makromolekülen und anorganischen Oberflächen verwendet werden. In den letzten drei Jahrzehnten wurden viele valide und empfindliche Methoden entwickelt, um die physikalischen Grundlagen dieser Wechselwirkungen zu messen: isothermale Titrationskalorimetrie (ITC), Oberflächenplasmonresonanz (SPR), Quarzkristallmikrobalance (QCM), gesamte interne Reflexionsfluoreszenz (TIRF) und abgeschwächte Totalreflexionsspektroskopie (ATR).

Die einfachste und günstigste Technik zur Messung der Adsorption ist die Erschöpfungsmethode, bei der die Veränderung der Sorbatkonzentration (Erschöpfung) nach Kontakt mit lösungsdisperdistodispten Sorbens berechnet und als adsorbiert angenommen wird. Adsorptionsisothermen, die auf Erschöpfungsdaten basieren, liefern alle grundlegenden physikalisch-chemischen Daten. Die Adsorption von Lösungen erfordert jedoch längere Gleichgewichtszeiten aufgrund kinetischer Einschränkungen und Sorbens mit einer hohen spezifischen Oberfläche, so dass sie fast unanwendbar auf makroskopische feste Ebenenoberflächen ist. Darüber hinaus sollten Faktoren wie die Instabilität von Sols, Nanopartikelaggregate, Sorptorierkristallizität, Verteilung der Nanopartikelgröße, pH-Wert der Lösung und der Wettbewerb um Adsorption bei der Untersuchung der Adsorbierung von Peptiden berücksichtigt werden. Depletion Data isotherm Construction liefert umfassende physikalische Chemiedaten für buchstäblich jeden löslichen Sorbat und bleibt dennoch die zugänglichste Methode, da sie keine teuren Setups erfordert. Dieser Artikel beschreibt ein grundlegendes Protokoll für die experimentelle Untersuchung der Peptidadsorption auf anorganischem Oxid und behandelt alle kritischen Punkte, die den Prozess beeinflussen.

Einleitung

Seit 50 Jahren erregt die Wechselwirkung zwischen anorganischen Oberflächen und Peptiden aufgrund ihrer hohen Bedeutung in der Materialwissenschaft und Medizin große Aufmerksamkeit. Die biomedizinische Forschung konzentriert sich auf die Kompatibilität und Stabilität bioanorganischer Oberflächen, die direkte Auswirkungen auf die regenerative Medizin, Die Gewebetechnik1,2,3und die Implantation4,5,6,7haben. Moderne bioresponsive Geräte, wie Sensoren und Aktoren, basieren auf funktionellen Proteinen, die auf oxidhalbleitenden Oberflächen8,,9,10,11,12,13immobilisiert sind. Moderne Reinigungspraktiken für die Proteinproduktion beruhen oft auf biomolekularen Wechselwirkungseigenschaften bei der nachgeschalteten Reinigung und Trennung14.

Unter mehreren anorganischen Oxiden bleibt Titandioxid in Kombination mit biologisch relevanten Substraten15,16am häufigsten verwendet. Die Forschung im Bereich der TiO2-basiertenBioschnittstellen konzentrierte sich auf die Etablierung einer starken und spezifischen Bindung von Proteinen und Peptiden, ohne ihre biologischen und strukturellen Eigenschaften zu verändern. Letztlich ist das Hauptziel eine Schicht mit hoher Oberflächendichte von Biomolekülen mit hoher Stabilität und erhöhter Funktionalität, die die Erstellung von biotechnologischen und medizinischen Anwendungen auf Titanbasis voranbringen wird17.

Titan und seine Legierungen werden seit mindestens sechs Jahrzehnten ausgiebig als chirurgisches Implantatmaterial eingesetzt, da eine Oberfläche TiO2 Schicht mit einer Dicke von wenigen Nanometern korrosionsbeständig ist und eine hohe Biokompatibilität in vielen in vivo Anwendungen18,19,20aufweist. Titandioxid wird auch weithin als ein anorganisches Substrat in der Biomineralisierung produziert, wo Keimbildung und anorganisches Phasenwachstum begleitet von Proteinen und Peptiden Materialien mit vielversprechenden katalytischen und optischen Eigenschaften21,22,23,24liefern können.

Angesichts der hohen Relevanz der Wechselwirkung zwischen anorganischen Materialien und Biomolekülen im Allgemeinen und Protein-TiO2-Wechselwirkungen im Besonderen wurde viel forschung zur Manipulation und Kontrolle der Adsorption von Proteinen auf TiO2.2 Aufgrund dieser Studien wurden einige grundlegende Eigenschaften dieser Wechselwirkung aufgedeckt, wie Adsorptionskinetik, Oberflächenabdeckung und Biomolekülkonformation, was wesentliche Unterstützung für weitere Fortschritte in den Bioschnittstellen5,13.

Die Proteinkomplexität führt jedoch zu erheblichen Einschränkungen bei der vollständigen Bestimmung und dem Verständnis der Wechselwirkung eines Proteins auf molekularer Ebene mit anorganischen Oberflächen. Unter der Annahme, dass die Biomoleküle durch begrenzte Stellen mit den anorganischen Oberflächen interagieren, wurden einige Proteine mit bekannten Strukturen und Aminosäuresequenzen auf ihre Komponenten-Peptide und Aminosäuren reduziert, die separat untersucht werden. Einige dieser Peptide haben eine signifikante Aktivität gezeigt, so dass sie ein einzigartiges Thema von Adsorption Studien ohne die Notwendigkeit für vorherige Proteintrennung25,26,27,28,29,30.

Die quantitative Charakterisierung der Peptidadsorption auf TiO2 oder anderen anorganischen Oberflächen kann mit physikalischen Methoden erreicht werden, die in den letzten Jahrzehnten speziell für Biomoleküle angepasst wurden. Zu diesen Methoden gehören die isothermale Titrationskalorimetrie (ITC), die Oberflächen-Plasmonresonanz (SPR), die Quarzkristall-Mikrobalance (QCM), die gesamte interne Reflexionsfluoreszenz (TIRF) und die abgeschwächte Gesamtreflexionsspektroskopie (ATR), die alle den Nachweis der Adsorptionsstärke ermöglichen, indem sie wichtige thermodynamische Daten bereitstellen: Die Bindungskonstante, Gibbs freie Energie, Enthalpie und Entropie31.

Die Adsorption von Biomolekülen an das anorganische Material kann auf zwei Arten erfolgen: 1) ITC sowie die Erschöpfungsmethode verwenden Partikel, die in einer Lösungsbindung an feste makroskopische Oberflächen dispergiert sind; 2) SPR, QCM, TIRF und ATR verwenden makroskopische Oberflächen, die mit anorganischem Material modifiziert wurden, wie vergoldete Glas- oder Metallchips, Quarzkristalle, Zinksulfidkristalle und PMMA-Chips.

Die isothermale Titrationskalorimetrie (ITC) ist eine etikettenfreie physikalische Methode, die die bei der Titration von Lösungen oder heterogenen Mischungen erzeugte oder verbrauchte Wärme misst. Empfindliche kalorimetrische Zellen detektieren Wärmeeffekte von bis zu 100 Nanojoule, wodurch die Messung von Adsorptionswärme auf Nanopartikeloberflächen möglich wird. Thermisches Verhalten des Sorbats während der kontinuierlichen Addition- Titration, bietet ein vollständiges thermodynamisches Profil der Wechselwirkung, die Enthalpie, Bindungskonstante und Entropie bei einer gegebenen Temperatur32,33,34,35,36offenbart.

Die Oberflächen-Plasmonresonanzspektroskopie (SPR) ist eine oberflächenempfindliche optische Technik, die auf der Messung des Brechungsindexes der Medien in unmittelbarer Nähe zur untersuchten Oberfläche basiert. Es ist eine Echtzeit- und etikettenfreie Methode zur Überwachung reversibler Adsorption und adsorbierter Schichtdicke. Die Bindungskonstante kann aus den Assoziations- und Dissoziationsraten berechnet werden. Adsorptionsexperimente, die bei unterschiedlichen Temperaturen durchgeführt werden, können Informationen über die Temperaturabhängigkeit der Aktivierungsenergie und sequenziell andere thermodynamische Parameter37,38,39liefern.

Die Quarzkristall-Mikrobalance (QCM)-Methode misst die Veränderung der Schwingfrequenz piezoelektrischer Kristalle während der Adsorptions- und Desorptionsprozesse. Die Bindungskonstante kann aus dem Verhältnis der Adsorptions- und Desorptionsratenkonstanten ausgewertet werden. QCM wird für relative Massenmessungen verwendet und benötigt daher keine Kalibrierung25,27,40. QCM wird zur Adsorption aus Gas und Flüssigkeit verwendet. Die Flüssigtechnik ermöglicht es, QCM als Analysewerkzeug zur Beschreibung der Ablagerung auf unterschiedlich veränderten Oberflächen zu verwenden41.

Die totale interne Reflexionsfluoreszenz (TIRF) ist eine empfindliche optische Grenzflächentechnik, die auf der Messung der Fluoreszenz von adsorbierten Fluorophoren basiert, die mit intern reflektierten evaneszenten Wellen angeregt werden. Das Verfahren ermöglicht den Nachweis von fluoreszierenden Molekülen, die die Oberfläche mit Dicken in der Größenordnung von Zehnern von Nanometern abdecken, weshalb es bei der Untersuchung der makromolekularen Adsorption auf verschiedenen Oberflächen42,43verwendet wird. Die In-situ-Überwachung der Fluoreszenzdynamik bei Adsorption und Desorption liefert die Adsorptionskinetik und damit thermodynamische Daten42,43.

Die gedämpfte Gesamtreflexion (ATR) wurde von Roddick-Lanzilotta verwendet, um Lysinadsorptionsisothermen auf Basis der Lysin-Spektralbänder bei 1.600 und 1.525 cm-1zu etablieren. Dies ist das erste Mal, dass die Bindungskonstante für ein Peptid auf TiO2 mit einer In-situ-Infrarotmethode44bestimmt wurde. Diese Technik war wirksam bei der Etablierung von Adsorptionsisothermen für Polylysinpeptide45 und saure Aminosäuren46.

Im Gegensatz zu den oben genannten Methoden, bei denen der Adsorptionsparameter vor Ort gemessen wird, wird in einem konventionellen Experiment die Menge der adsorbierten Biomoleküle durch die Konzentrationsänderung gemessen, nachdem die Oberfläche die Lösung kontaktiert hat. Da die Konzentration eines Sorbats in einer überwiegenden Mehrheit der Adsorptionsfälle zerfällt, wird diese Methode als Erschöpfungsmethode bezeichnet. Konzentrationsmessungen erfordern einen validierten analytischen Assay, der auf einer intrinsischen analytischen Eigenschaft des Sorbats oder auf der Etikettierung47,48,49,50 oder Derivatisierung51,52 davon basieren kann.

Adsorptionsexperimente mit QCM, SPR, TIRF oder ATR erfordern eine spezielle Oberflächenvorbereitung der Chips und Sensoren, die für Adsorptionsstudien verwendet werden. Vorbereitete Oberflächen sollten einmal verwendet werden und erfordern eine Änderung beim Schalten des Adsorbats, aufgrund der unvermeidlichen Hydratation der Oxidoberfläche oder einer möglichen Chemisorption eines Sorbats. Es kann jeweils nur eine Probe mit ITC, QCM, SPR, TIRF oder ATR ausgeführt werden, während man bei der Erschöpfungsmethode Dutzende von Proben ausführen kann, für die die Menge nur durch die Thermostatkapazität und die Sorptionsverfügbarkeit begrenzt ist. Dies ist besonders wichtig bei der Verarbeitung großer Probenchargen oder Bibliotheken bioaktiver Moleküle. Wichtig ist, dass die Erschöpfungsmethode keine teure Ausrüstung erfordert, sondern nur einen Thermostat.

Trotz ihrer offensichtlichen Vorteile erfordert die Erschöpfungsmethode jedoch komplexe Verfahrensmerkmale, die umständlich erscheinen mögen. Dieser Artikel stellt vor, wie eine umfassende physikalisch-chemische Studie der Dipeptidadsorption auf TiO2 mit der Erschöpfungsmethode durchführen und behandelt Probleme, die Forscher bei der Durchführung relevanter Experimente konfrontiert werden können.

Protokoll

1. Herstellung von Dipeptid-Stammlösungen und Verdünnungen

  1. Zubereitung von 16 mM Dipeptidlösung
    1. 0,183 g eines Dipeptids (Ile-His) (siehe Materialtabelle)in ein steriles polymeres Reagenzglas geben, mit doppeldestilliertem Wasser (DDW) auf 35 ml verdünnen und bei Raumtemperatur (RT) unter kräftigem Rühren auflösen.
      HINWEIS: Wenn sich das Dipeptid beim Rühren nicht in DDW auflöst, legen Sie die Dipeptidlösung in ein Ultraschallbad und beschallen Sie sie für einige Minuten.
    2. Bereiten Sie eine 50 mMNLösung von 2-(N-Morpholino)Ethanulfonsäure (MES) Puffer vor, indem Sie 0,533 g trockenes 2-(N-Morpholino)Ethansulfonsäure in 50 ml DDW im sterilen Reagenzglas auflösen.N Bereiten Sie eine 50 mM Natriumhydroxidlösung vor, indem Sie 200 mg Natriumhydroxid in 100 ml DDW auflösen.
    3. Stellen Sie den pH-Wert der vorgelösten Dipeptidlösung auf 7,4 ein, indem Sie (Mikrolitertitration) 50 mM MES oder 50 mM Natriumhydroxid zur 16 mM Dipeptidlösung sorgfältig hinzufügen, bei RT rühren und den pH-Wert mit einem pH-Meter überwachen. Nach dem Einstellen des pH-Werts die Lösung in einen Messzylinder gießen, das Reagenzglas ausspülen und den Messzylinder mit DDW auf 40 ml füllen, um eine Endkonzentration von 16 mM zu erreichen.
  2. Herstellung von Dipeptidverdünnungen aus 16 mM Stammlösung
    1. Bereiten Sie Peptidverdünnungen mit Konzentrationen zwischen 0,4 und 12,0 mM vor, indem Sie die 16 mM Dipeptidlösung mit DDW verdünnen. Um beispielsweise eine 8 mM Dipeptidlösung vorzubereiten, fügen Sie 7 ml DDW zu 10 ml der 16 mM Dipeptidlösung hinzu. Stellen Sie nach der Verdünnung den pH-Wert auf 7,4 ein, indem Sie 50 mM MES oder 50 mM NaOH Tropfen für Tropfen zur Dipeptidlösung hinzufügen (siehe Schritt 1.1.3). Nach dem Einstellen des pH-Werts die Lösung in einen Messzylinder gießen, das Reagenzglas ausspülen und den Messzylinder bis zu 20 ml mit DDW füllen, um die Dipeptidkonzentration 8 mM zu machen.
      HINWEIS: Andere Verdünnungen der 16 mM Dipeptid-Stammlösung mit Konzentrationen von 0,4, 0,8, 1,2, 1,6, 2,0, 3,0, 4,0, 8,0 und 12,0 mM werden gemäß Abbildung 1hergestellt. Die Einstellung der pH-Lösung jeder Dipeptidlösung auf 7,4 wird in Schritt 1.1.3 beschrieben.

2. Vorbereitung von titania sol

  1. Bereiten Sie eine 10 mM Lösung des MES-Puffers vor, indem Sie 1.066 g MES in 500 ml DDW auflösen. Stellen Sie den pH-Wert mit trockenem Natriumhydroxid beim Rühren und Überwachen des pH-Wertes mit dem pH-Messgerät auf 7,4 ein.
  2. Schleifen Sie 200 mg nanokristallines TiO2 in einem Mörtel für mindestens 5 min (siehe Materialtabelle).
  3. Wiegen Sie 40 mg der gemahlenen Titandioxid-Nanopartikel in einen Laborkolben. Legen Sie den Kolben mit dem Laborstand in das Beschallungsbad (siehe Materialtabelle) ein.
  4. 20 ml 10 mM MES-Puffer in den Kolben mit TiO2 geben und in einem Ultraschallbad (5 L, 40 kHz, 120 W) 20 min beschallen.

3. Mischen und Thermostatisieren

  1. Stellen Sie den Thermostat (siehe Materialtabelle) auf die gewünschten Temperaturen (z. B. 0,00, 10,00, 20,00, 30,00 oder 40,00 °C) ein.
  2. Fügen Sie 1 ml der beschallten Sol von TiO2 zu den markierten Adsorptionsfläschchen hinzu. Platzieren Sie die markierten Adsorptionsfläschchen gegen entsprechende Dipeptidverdünnung in einer behelfsmäßigen Flotationsvorrichtung aus extrudiertem Polystyrolschaum. Legen Sie die Flotationsvorrichtung mit den markierten Fläschchen und den entsprechenden Dipeptidverdünnungen mindestens 5 min in den Thermostat.
  3. Fügen Sie 1 ml jeder Dipeptidverdünnung in die entsprechende markierte Adsorptionsflasche ein, um sicherzustellen, dass alle Mischlösungen die gleiche Temperatur haben. Halten Sie die Serie der erhaltenen Adsorptionsproben auf dem Thermostat bei 0,00, 10,00, 20,00, 30,00 oder 40,00 °C für 24 h, um das Adsorptionsgleichgewicht zu erreichen.
    HINWEIS: Schütteln Sie vorsichtig alle Proben der erhaltenen Dispersionen, bevor Sie sie in den Thermostat geben.
  4. Mischen Sie die2 TiO 2-Dispersionen gelegentlich, indem Sie sie während des Thermostats manuell schütteln.

4. Filtration der thermostatierten Proben

  1. Um eine temperaturinduzierte Reequilibration zu vermeiden, entnahme eine Probe nach der anderen aus dem Thermostat für die Filtration.
  2. Nehmen Sie eine Probe der Dipeptidlösung aus jeder Glasflasche mit einer Spritze durch eine Spritzennadel. Entfernen Sie die Nadel aus der Spritze und setzen Sie den Spritzenfilter (siehe Materialtabelle) auf, um die Dipeptidlösung in die Glasflasche zu filtern. Wiederholen Sie die Filtration mit den anderen Proben.
  3. Analysieren Sie das Filtrat gemäß Abschnitt 5.
    HINWEIS: Zentrieren Sie die Proben nicht, da es einige Minuten dauert und zu einer Änderung des Konzentrationsgleichgewichts führen kann.

5. Ableitung und HPLC-Analyse

  1. Machen Sie eine 50 ml Lösung von Trifluoressigsäure (TFA) in Acetonitril. 0,34 ml TFA in den Messzylinder geben und das Volumen der Lösung auf 50 ml mit Acetonitril bei RT einstellen.
    VORSICHT: Arbeiten Sie mit TFA unter einer Dunstabzugshaube mit Abluftbelüftung, da Trifluoressigsäure beim Einatmen schädlich ist, schwere Hautverbrennungen verursacht und für Wasserorganismen auch bei niedrigen Konzentrationen giftig ist53.
  2. Bereiten Sie die Derivatisierungslösung (d. h. Edman-Reagenz54) vor, indem Sie 299 L Phenylisothiocyanat und 347 l Triethylamin in einen abgestuften Zylinder stellen und das Lösungsvolumen auf 50 ml mit Acetonitril bei RT einstellen.
  3. Vor der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) Analyse leiten Sie die Proben mit Edmans Reagenz in den Chromatographie-Fläschchen ab. Mischen Sie 400 l der Probe mit 400 l Edmans Reagenz. Die Probe bei 60 °C 15 min erhitzen. Nach dem Erhitzen die Probe mit 225 l der TFA-Lösung neutralisieren und einige Minuten warten, um die Probe auf RT abzukühlen.
  4. Verwenden Sie die HPLC-Analyse (siehe Materialtabelle), um die Konzentration der Dipeptidlösung vor und nach der Adsorption zu bestimmen. Legen Sie die Chromatographie-Fläschchen mit den analysierten Lösungen in den HPLC-Autosampler und beginnen Sie mit der Analyse der Proben unter den notwendigen Bedingungen, die von der Software festgelegt werden (siehe Tabelle der Materialien).
    HINWEIS: Die mobile Phase besteht aus 0,1% TFA in entionisiertem Wasser und reinem Acetonitril, mit Acetonitril-Gradienten von 20-90% bei 286 nm für 13 min. Analysieren Sie jede Probe in dreifacher Ausfertigung. Messen Sie die Konzentration der Dipeptidlösung anhand der zuvor festgelegten Kalibrierkurve (Abbildung 2). Für Chromatographie-Spezifikationen siehe Shchelokov et al.55.

Ergebnisse

Die Adsorption eines Dipeptids auf nanokristallinem Titandioxid wurde unter den biokompatiblen Bedingungen in einem Temperaturbereich von 0 bis 40 °C untersucht. Die experimentelle Dipeptidadsorption (A, mmol/g) auf der Oberfläche eines Titandioxids wurde als

figure-results-379

Wobei C0 bzw. C e d...

Diskussion

Die Adsorption von Lösungen für die Isothermenkonstruktion erfordert eine längere Zeit für die Gleichgewichtszeit aufgrund kinetischer Einschränkungen und Sorbens mit einer hohen spezifischen Oberfläche. Darüber hinaus sollten instabil werden von Sols, Nanopartikelaggregaten, Kristallinität, Nanopartikelgrößenverteilung, pH-Wert der Lösung und Wettbewerb um Adsorption beim Adsorbieren von Aminosäuren. Die Adsorptionsisothermenkonstruktion mit der Erschöpfungsmethode bleibt jedoch die am meisten verfügbare M...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der Russischen Stiftung für Grundlagenforschung finanziell unterstützt (Grant-Nr. 15-03-07834-a).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acidTCI Chemicals4432-31-9MES, >98%
AcetonitrilePanreac AppliChemHPLC grade
Chromatography vialsglass
Dipeptide Ile-HisBachem4000894
Double-distilled waterDDW was obtained on spot
Heating cleaning bath "Ultrasons-HD"J.P. Selecta30008655 L, 40 kHz, 120 Watts
High-performance liquid chromatograph system equipped with a UV−vis detectorShimadzu, LC-20 ProminenceHPLC
IsopropanolSigma-Aldrich (Merck)67-63-099.70%
LabSolutions LiteShimadzu223-60410Software for high-performance liquid chromatography system
Nanocrystalline TiO2Pure anatase with at least 99% crystallinity. Average particle size 10.62 ± 3.31 nm. Specific surface 131.9 m2/g (BET). See Langmuir 2019, 35, 538−550, for details.
Phenyl isothiocyanateAcros Organics103-72-0PITC, 98%
Reversed-phase Zorbax columnZORBAX LC150×2.5 mm i.d. with a mean particle size of 5 μm
Syringe filterVladfilter25 mm, 0.2 μm pore, cellulose acetate
Test sterile polymeric tubepolypropylene
Thermostat TC-502BrookfieldRefrigerating/heating circulating bath with the programmable controller for the sample derivatization
TriethylamineSigma-Aldrich (Merck)121-44-8TEA; 99%
Trifluoroacetic acidPanreac AppliChem163317TFA, 99%

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