MS2-Affinitätsreinigung gekoppelt mit RNA-Sequenzierung in grampositiven Bakterien

Zusammenfassung

Die MAPS-Technologie wurde entwickelt, um das Targetom einer bestimmten regulatorischen RNA in vivo zu untersuchen. Die sRNA von Interesse ist mit einem MS2-Aptamer gekennzeichnet, das die Co-Reinigung ihrer RNA-Partner und deren Identifizierung durch RNA-Sequenzierung ermöglicht. Dieses modifizierte Protokoll eignet sich besonders für grampositive Bakterien.

Zusammenfassung

Obwohl kleine regulatorische RNAs (sRNAs) im bakteriellen Bereich des Lebens weit verbreitet sind, sind die Funktionen vieler von ihnen nach wie vor schlecht charakterisiert, insbesondere aufgrund der Schwierigkeit, ihre mRNA-Ziele zu identifizieren. Hier beschrieben wir ein modifiziertes Protokoll der MS2-Affinity Purification in Verbindung mit RNA Sequencing (MAPS) Technologie, mit dem Ziel, alle RNA-Partner einer spezifischen sRNA in vivo aufzudecken. Im Großen und Ganzen ist das MS2-Aptamer mit der 5'-Extremität der interessierenden sRNA verschmolzen. Dieses Konstrukt wird dann in vivo exprimiert, so dass die MS2-sRNA mit ihren zellulären Partnern interagieren kann. Nach der Bakterienernte werden die Zellen mechanisch lysiert. Der Rohextrakt wird in eine Amylose-basierte Chromatographiesäule geladen, die zuvor mit dem MS2-Protein beschichtet ist, das mit dem Maltose-bindenden Protein verschmolzen ist. Dies ermöglicht die spezifische Erfassung von MS2-sRNA und interagierenden RNAs. Nach der Elution werden co-gereinigte RNAs durch Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung und anschließende bioinformatische Analyse identifiziert. Das folgende Protokoll wurde im grampositiven Humanpathogen Staphylococcus aureus implementiert und ist prinzipiell auf alle grampositiven Bakterien übertragbar. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die MAPS-Technologie eine effiziente Methode darstellt, um das regulatorische Netzwerk einer bestimmten sRNA gründlich zu erforschen und eine Momentaufnahme ihres gesamten Targetoms zu bieten. Es ist jedoch wichtig zu bedenken, dass die von MAPS identifizierten mutmaßlichen Ziele noch durch komplementäre experimentelle Ansätze validiert werden müssen.

Einleitung

Hunderte, vielleicht sogar Tausende von kleinen regulatorischen RNAs (sRNAs) wurden in den meisten bakteriellen Genomen identifiziert, aber die Funktionen der überwiegenden Mehrheit von ihnen bleiben uncharakterisiert. Insgesamt sind sRNAs kurze nicht-kodierende Moleküle, die eine wichtige Rolle in der bakteriellen Physiologie und Anpassung an schwankende Umgebungen spielen^1,2,3. Tatsächlich stehen diese Makromoleküle im Zentrum zahlreicher komplizierter regulatorischer Netzwerke, die Stoffwechselwege, Stressreaktionen, aber auch Virulenz und Antibiotikaresistenz beeinflussen....