Hochdurchsatz-Transkriptomanalyse zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen

Zusammenfassung

Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt eine komplette Pipeline zur Analyse von RNA-Sequenzierungs-Transkriptomdaten von Rohlesungen bis hin zur Funktionsanalyse, einschließlich Qualitätskontroll- und Vorverarbeitungsschritten bis hin zu fortschrittlichen statistischen Analyseansätzen.

Zusammenfassung

Krankheitserreger können eine Vielzahl von Infektionskrankheiten verursachen. Die biologischen Prozesse, die vom Wirt als Reaktion auf eine Infektion induziert werden, bestimmen die Schwere der Erkrankung. Um solche Prozesse zu untersuchen, können Forscher Hochdurchsatz-Sequenzierungstechniken (RNA-seq) verwenden, die die dynamischen Veränderungen des Wirtstranskriptoms in verschiedenen Stadien der Infektion, klinischen Ergebnissen oder Krankheitsschwere messen. Diese Untersuchung kann zu einem besseren Verständnis der Krankheiten sowie zur Aufdeckung potenzieller Wirkstoffziele und Behandlungen führen. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt eine komplette Pipeline zur Analyse von RNA-Sequenzierungsdaten vom Rohlesen bis zur Funktionsanalyse. Die Pipeline ist in fünf Schritte unterteilt: (1) Qualitätskontrolle der Daten; (2) Kartierung und Annotation von Genen; (3) statistische Analyse zur Identifizierung differentiell exprimierter Gene und koexprimierter Gene; (4) Bestimmung des molekularen Grades der Störung von Proben; und (5) Funktionalanalyse. Schritt 1 entfernt technische Artefakte, die sich auf die Qualität nachgelagerter Analysen auswirken können. In Schritt 2 werden Gene nach Standardbibliotheksprotokollen kartiert und annotiert. Die statistische Analyse in Schritt 3 identifiziert Gene, die in infizierten Proben im Vergleich zu nicht infizierten Proben differentiell exprimiert oder koexprimiert werden. Die Probenvariabilität und das Vorhandensein potenzieller biologischer Ausreißer werden mit dem Ansatz des molekularen Störungsgrades in Schritt 4 überprüft. Schließlich zeigt die Funktionelle Analyse in Schritt 5 die mit dem Krankheitsphänotyp assoziierten Signalwege auf. Die vorgestellte Pipeline zielt darauf ab, Forscher durch die RNA-seq-Datenanalyse aus Wirt-Pathogen-Interaktionsstudien zu unterstützen und zukünftige In-vitro- oder In-vivo-Experimente voranzutreiben, die für das Verständnis des molekularen Mechanismus von Infektionen unerlässlich sind.

Einleitung

Arboviren wie Dengue, Gelbfieber, Chikungunya und Zika wurden weithin mit mehreren endemischen Ausbrüchen in Verbindung gebracht und haben sich in den letzten Jahrzehnten als einer der Hauptpathogene für die Infektion des Menschen ^{herausgestellt1,2}. Personen, die mit dem Chikungunya-Virus (CHIKV) infiziert sind, haben oft Fieber, Kopfschmerzen, Hautausschlag, Polyarthralgie und ^{Arthritis3,4,5}. Viren können die Genexpression der Zelle untergraben und verschiedene Wirtssignalwege beeinflussen. Kürzlich verwendeten Blutt....

Protokoll

Die in diesem Protokoll verwendeten Proben wurden von den Ethikkommissionen sowohl der Abteilung für Mikrobiologie des Instituts für Biomedizinische Wissenschaften der Universität von São Paulo als auch der Bundesuniversität von Sergipe genehmigt (Protokolle: 54937216.5.0000.5467 bzw. 54835916.2.0000.5546).

1. Docker Desktop-Installation

HINWEIS: Die Schritte zum Vorbereiten der Docker-Umgebung unterscheiden sich zwischen den Betriebssystemen (Betriebssystemen). Daher müssen Mac-Benutzer die als 1.1 aufgeführten Schritte, Linux-Benutzer die als 1.2 aufgeführten Schritte und Windows-Benutzer die als....

Ergebnisse

Die Rechenumgebung für Transkriptomanalysen wurde auf der Docker-Plattform erstellt und konfiguriert. Dieser Ansatz ermöglicht es Linux-Anfängern, Linux-Terminalsysteme ohne a priori Managementkenntnisse zu verwenden. Die Docker-Plattform verwendet die Ressourcen des Hostbetriebssystems, um einen Dienstcontainer zu erstellen, der die Tools bestimmter Benutzer enthält (Abbildung 1B). Ein Container basierend auf der Linux OS Ubuntu 20.04 Distribution wurde erstellt und vollständig für tr.......

Diskussion

Die Aufbereitung der Sequenzierbibliotheken ist ein entscheidender Schritt, um biologische Fragestellungen bestmöglich zu beantworten. Die Art der Transkripte, die für die Studie von Interesse sind, wird bestimmen, welche Art von Sequenzierungsbibliothek ausgewählt wird, und bioinformatische Analysen vorantreiben. Zum Beispiel ist es aus der Sequenzierung einer Pathogen- und Wirtsinteraktion je nach Art der Sequenzierung möglich, Sequenzen aus beiden oder nur aus den Wirtstranskripten zu identifizieren.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
CEMiTool	Computational Systems Biology Laboratory	1.12.2	Discovery and the analysis of co-expression gene modules in a fully automatic manner, while providing a user-friendly HTML report with high-quality graphs.
EdgeR	Bioconductor (Maintainer: Yunshun Chen [yuchen at wehi.edu.au])	3.30.3	Differential expression analysis of RNA-seq expression profiles with biological replication
EnhancedVolcano	Bioconductor (Maintainer: Kevin Blighe [kevin at clinicalbioinformatics.co.uk])	1.6.0	Publication-ready volcano plots with enhanced colouring and labeling
FastQC	Babraham Bioinformatics	0.11.9	Aims to provide a simple way to do some quality control checks on raw sequence data coming from high throughput sequencing
FeatureCounts	Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research	2.0.0	Assign mapped sequencing reads to specified genomic features
MDP	Computational Systems Biology Laboratory	1.8.0	Molecular Degree of Perturbation calculates scores for transcriptome data samples based on their perturbation from controls
R	R Core Group	4.0.3	Programming language and free software environment for statistical computing and graphics
STAR	Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research	2.7.6a	Aligner designed to specifically address many of the challenges of RNA-seq data mapping using a strategy to account for spliced alignments
Bowtie2	Johns Hopkins University	2.4.2	Ultrafast and memory-efficient tool for aligning sequencing reads to long reference sequences
Trimmomatic	THE USADEL LAB	0.39	Trimming adapter sequence tasks for Illumina paired-end and single-ended data
Get Docker	Docker	20.10.2	Create a bioinformatic environment reproducible and predictable (https://docs.docker.com/get-docker/)
WSL2-Kernel	Windows	NA	https://docs.microsoft.com/en-us/windows/wsl/wsl2-kernel
Get Docker Linux	Docker	NA	https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/
Docker Linux Repository	Docker	NA	https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/#install-using-the-repository
MDP Website	Computational Systems Biology Laboratory	NA	https://mdp.sysbio.tools
Enrichr Website	MaayanLab	NA	https://maayanlab.cloud/Enrichr/
webCEMiTool	Computational Systems Biology Laboratory	NA	https://cemitool.sysbio.tools/
gProfiler	Bioinformatics, Algorithmics and Data Mining Group	NA	https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost
goseq	Bioconductor (Maintainer: Matthew Young [my4 at sanger.ac.uk])	NA	http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/goseq.html
SRA NCBI study	NCBI	NA	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA507472/