Visualisierung von Darmmikrobiota-Wirt-Interaktionen durch Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung , Lektinfärbung und Bildgebung

Zusammenfassung

Dieses optimierte Protokoll beschreibt einen Workflow zur Erkennung und Abbildung von Bakterien in komplexen Gewebeproben, von der Fixierung des Gewebes bis zur Färbung von Mikroben mit fluoreszierender In-situ-Hybridisierung .

Zusammenfassung

Die Messung der Lokalisation von Mikroben in ihrem In-vivo-Kontext ist ein wesentlicher Schritt, um die funktionellen Beziehungen zwischen der Mikrobiota und dem Wirbeltierdarm aufzudecken. Die räumliche Landschaft der Darmmikrobiota wird durch physikalische Merkmale - Darmschleim, Krypten und Falten - streng kontrolliert und von wirtskontrollierten Eigenschaften wie pH-Wert, Sauerstoffverfügbarkeit und Immunfaktoren beeinflusst. Diese Eigenschaften begrenzen die Fähigkeit von kommensalen Mikroben und Krankheitserregern gleichermaßen, den Darm stabil zu besiedeln. Auf der Mikrometerskala bestimmt die mikrobielle Organisation die Nahbereichsinteraktionen zwischen verschiedenen Mikroben sowie die Wechselwirkungen zwischen Mikroben und ihrem Wirt. Diese Wechselwirkungen beeinflussen dann die großräumige Organfunktion und die Gesundheit des Wirts.

Dieses Protokoll ermöglicht die Visualisierung der räumlichen Organisation der Darmmikrobiota von Entfernungen zwischen Zellen bis hin zu organweiten Skalen. Die Methode basiert auf der Fixierung von Darmgewebe unter Beibehaltung der Darmstruktur und der Schleimeigenschaften. Die fixierten Proben werden dann eingebettet, geschnitten und gefärbt, um bestimmte Bakterienarten durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) hervorzuheben. Wirtsmerkmale wie Schleim und Wirtszellbestandteile sind mit fluoreszierend markierten Lektinen markiert. Schließlich werden die gefärbten Schnitte mit einem konfokalen Mikroskop unter Verwendung von Kachel-Scan-Bildgebung bei hoher Vergrößerung abgebildet, um die Mikrometer- bis Zentimeterlängenskalen zu überbrücken. Diese Art der Bildgebung kann auf Darmabschnitte aus Tiermodellen und Biopsien aus menschlichem Gewebe angewendet werden, um die Biogeographie der Mikrobiota im Darm in Gesundheit und Krankheit zu bestimmen.

Einleitung

Mikrobielle Visualisierungstechniken haben ursprünge, die so alt sind wie die Mikrobiologie selbst, als Antonie Van Leeuwenhoek im 17. ^Jahrhundert mit seinem Mikroskop Bakterien (die er "Animalcules" nannte) aus Zahnbelag und Stuhl beobachtete. Seitdem wurden zahlreiche Techniken entwickelt, um die räumliche Organisation des Konsortiums von Bakterien, Pilzen und Viren zu visualisieren, die mit einem Wirt - der Mikrobiota1 - leben. Die Aufklärung der Lokalisation dieser Mikroben ist wichtig, um ihre Funktion in ihrem tierischen Wirt zu bestimmen. Die Biogeographie von Bakterien ist sowohl in kommensalen als auch in pathogenen Taxa wichtig, da die Nähe zu bestimmten Orten (z. B. dem Epithel), Nahrungssubstraten und spezifischen Mikroben die bakterielle Produktion von Metaboliten diktieren kann, die Interspezies und Inter-Kingdom-Interaktionen zugrunde liegen.

Eine Schlüsselstruktur, die Bakterien und wirtsgewebe an mehreren unterschiedlichen Körperstellen wie der Mundhöhle, dem Darm oder der Lunge trennt, ist der Schleim - eine vom Wirt produzierte Schicht, die sowohl die mikrobielle Translokation auf die Wirtsepithelzellen verhindert als auch als Nahrungsressource für die Mikrobiota ^dient2,3,4 . Die Charakterisierung von Verstößen und Veränderungen in dieser Barriere ist von entscheidender Bedeutung und führt zu mechanistischen Einblicken in Wirt-Mikrobiota-Interaktionen, die durch Sequenzierung allein nicht erhalten ^würden5,6,7. Beispielsweise ermöglichte die Bildgebung die Entdeckung, dass die Exposition gegenüber Antibiotika die Schleimschicht und die Organisation der Mikrobiota stören ^kann7,8 und dass Abführmittel den Schleim erschöpfen können, was mit großen Veränderungen der Immunparameter korreliert5.

Dieses Protokoll skizziert einen allgemeinen Rahmen für die Fixierung, Färbung und Bildgebung der Mikrobiota und des Wirtsgewebes (Abbildung 1), der auf der Arbeit von Johansson und Hansson9 aufbaut. Während dieses Protokoll im Zusammenhang mit Darmabschnitten modelliert wird, kann es leicht an andere Gewebetypen angepasst werden. Dieses Protokoll ermöglicht die Verarbeitung von experimentellen klinischen Proben von Tieren oder Menschen; Hinweise zur Verarbeitung beider Probentypen wurden beigefügt. In dem hier gezeigten Beispiel wurden das Wirtsepithel und die luminalen Bakterien gleichzeitig mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-Färbung, Schleim mit dem Fluorescein (FITC)-konjugierten Lektin, Ulex europaeus Agglutinin I (UEA-1) und einem spezifischen Bakterientaxon unter Verwendung von FISH markiert. FISH-Sonden werden normalerweise gegen die 16S-rRNA-Gene eines Taxons entwickelt, um das hohe Signal der Bindung eines Transkripts mit hoher Kopie sicherzustellen.

In diesem Beispiel zielt die Sonde auf die 16S rRNA der Muribaculaceae-Bakterienfamilie ab (Abbildung 2). Die Flecken können jedoch leicht durch verschiedene FISH-Sonden und / oder Lektine ersetzt werden, um die entsprechende biologische Fragestellung zu berücksichtigen. Zuvor validierte FISH-Sonden finden sich auf ^ProbeBase10, einer Online-Ressource für rRNA-gerichtete Oligonukleotidsonden, oder auf ^SILVA11, einer ribosomalen RNA-Datenbank. Für das Design neuer Sonden kann sich der Leser auf neue Pipelines wie HiPR-FISH8 oder Oligominer12 beziehen. Mit diesem Protokoll ist es möglich, die enge Packung von Bakterien im Darmlumen und die verschiedenen Merkmale des Darmschleims im gesamten Verdauungstrakt zu beobachten. Der hier beschriebene Workflow ermöglicht die quantitative Analyse der Mikrobiota im räumlichen Kontext ihrer Wirtsumgebung.

Protokoll

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Tierversuche und Gewebeentnahmen wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care (CCAC) durchgeführt und vom Animal Care Committee der University of British Columbia genehmigt. Zum Einsatz kamen keimfreie Swiss Webster Mäuse. Alle Tiere waren 8-10 Wochen alt, beide Geschlechter wurden verwendet und alle Mäuse wurden mit mindestens zwei Mäusen pro Käfig untergebracht. Die Tiere wurden mit Kohlendioxid mit sekundärer zervikaler Luxation oder Herzpunktion eingeschläfert.

1. Entwerfen eines Bildgebungsexperiments: Überlegungen und Probensammlung

1. FISH-Sondendesign
   1. Wenn eine geeignete FISH-Sonde vorhanden ist, wählen Sie eine bereits vorhandene veröffentlichte, die im Vergleich zum Hintergrund ein starkes Signal in markierten Zellen zeigt.
   2. Validierung neuer Sonden in vitro , um ihre Effizienz der Bindung an feste Proben der Zielbakterien und der Off-Target-Bindung an andere Bakterien zu bestimmen.
   3. Überprüfen Sie alle zu verwendenden 16S FISH-Sonden gegen 16S-Sequenzen aus dem Zielorganismus oder gegen die 16S rRNA-Sequenzierung aus den zu analysierenden Proben, um sicherzustellen, dass der erwartete Anteil positiver Übereinstimmungen vorhanden ist und dass sonden nicht unspezifisch an andere Mikrobiota-Mitglieder binden.
      1. Richten Sie die FISH-Sonden mit einem Tool wie Clustal ^Omega13 entweder an Sequenzen in voller Länge oder an Amplikonsequenzvarianten aus, um die potenzielle Bindung von Sonden und ihren Zielen zu bewerten.
      2. Zusätzlich zu den In-silico-Tests sollten die Genauigkeit und der Grad der FISH-Färbung von nicht validierten Sonden an Reinkulturen ^{getestet werden8,14}.

HINWEIS: Bei der Färbung mehrerer Gemeindemitglieder können Sonden kombinatorisch verwendet werden (z. B. die Kombination einer familienspezifischen Sonde und einer gattungsspezifischen Sonde), wenn sich die verwendeten Fluorophore in Anregungs- und Emissionsspektren nicht überlappen (es sei denn, sie bilden sich auf einem System ab, das eine lineare Entmischung durchführen kann). Darüber hinaus kann die Spezifität durch die Einbeziehung von Spezifitätskontrollen/verschlüsselten Sonden oder durch Wettbewerb mit nicht fluoreszierenden Sonden nachgewiesen werden.

1. Probentypen und Gewebeentnahme
   1. Schneiden Sie mit scharfen und sauberen Werkzeugen Darmsegmente aus notibiotischen Swiss Webster-Mäusen für die Bildgebung. Minimieren Sie die Störung der Probe so weit wie möglich und behandeln Sie die Abschnitte an ihren Kanten, um eine Beeinträchtigung des Bildgebungsbereichs zu vermeiden. Fixieren Sie die Probe so schnell wie möglich nach der Dissektion, um eine Degradation zu verhindern.
      HINWEIS: Für Tierversuche werden intakte, ungespülte Darmabschnitte bevorzugt; Die Membran hilft, die Luminal- und Schleimhautorganisation intakt zu halten.
   2. Reinigen Sie Werkzeuge, indem Sie sie mit 70% Ethanol zwischen Proben und Standorten abwischen. Erhalten Sie mindestens drei biologische Replikate pro Darmabschnitt / Biopsiestandort, wobei Sie darauf achten, konsistente Darmpositionen zu entnehmen, da sich der Schleim und die Darmarchitektur sowie die Mikrobiota an verschiedenen Stellen signifikant verändern.

2. Fixierung und Infiltration von Gewebeproben

1. Fixierung
   1. Bereiten Sie frisches Methacarn in einem kompatiblen Behälter mit den folgenden Verhältnissen zu: 60% absolutes Methanol, 30% Chloroform und 10% Eisessig. Geben Sie jede dieser Chemikalien in einen Abzug. Wählen Sie einen Behälter, der durch Aufbrechen des Deckels entlüftet werden kann. Da Methacarn nicht mit Polystyrol kompatibel ist, bereiten Sie es in einem Polyethylenbehälter unter Verwendung von Glaszylindern / serologischen Pipetten für Chloroform und Eisessig vor.
      HINWEIS: Während des Mischens entstehen Dämpfe, die dazu führen können, dass sich Druck im Behälter aufbaut. Es ist ratsam, den Behälter nach dem Entfernen aus dem Abzug relativ fest verschlossen zu halten, wenn keine Proben aktiv hinzugefügt werden. Chloroform ist giftig; nicht einatmen, schlucken oder durch die Haut absorbieren. Methanol ist giftig und leicht entzündlich; nicht einatmen, schlucken oder durch die Haut absorbieren. Eisessig ist brennbar und stark korrosiv für Haut und Augen.
   2. Nach dem Dosieren den Behälter verschließen, zum Mischen schwenken und dann entlüften; wiederholen Sie dies, bis die Ausgasung aufgehört hat (und sich der Druck unter dem Deckel nicht mehr merklich aufbaut).
      HINWEIS: Methacarn nicht in Abflüssen entsorgen; sammeln und entsorgen als gefährliche chemische Abfälle gemäß den institutionellen Richtlinien. Verwenden Sie einen Bleistift zum Beschriften von Histologiekassetten, da sich in der Methacarn-Lösung viele Federtinten lösen.
   3. Legen Sie die Darmschnitte in Histologiekassetten, indem Sie vorsichtig eine Gewebekante mit einer Pinzette halten. Schließen Sie die Kassette und tauchen Sie sie vollständig in frische Methacarn-Lösung ein. Stellen Sie sicher, dass die Lösung beim Eintauchen der Kassetten nicht älter als einige Stunden ist.
   4. Für klinische Proben, die in einer klinischen Suite ohne Zugang zu einem Abzug gesammelt werden, verwenden Sie einen Polyethylen-Vorratsbehälter mit einer in den Deckel geschnittenen Klappe, die den Durchgang der Histologiekassetten ermöglicht. Kleben Sie diese Klappe zu, wenn Sie keine Proben passieren, um das Entweichen giftiger Dämpfe zu verhindern.
      HINWEIS: Es ist wichtig, Abdeckband zu verwenden, um die Auflösung von Klebstoff auf dem Behälter zu vermeiden - einige Arten von Klebeband (z. B. Verpackungsband aus Kunststoff) halten den Methacarndämpfen möglicherweise nicht gut stand.
   5. Proben für mindestens 3 h und maximal zwei Wochen fixieren.
      HINWEIS: Dickere Proben erfordern möglicherweise Fixierzeiten von mehr als 3 h. Die Fixierungszeit kann gewählt werden, um eine gleichzeitige Paraffininfiltrationsverarbeitung für Kassetten zu ermöglichen, die in verschiedenen Methacarnlösungen fixiert sind (z. B. um gleichzeitig eine Paraffininfiltration an Probengruppen durchzuführen, die über zwei Wochen gesammelt und fixiert wurden).
2. Paraffininfiltration und -einbettung
   1. Das Paraffin in einen hitzebeständigen Behälter geben und über Nacht im Ofen bei 60 °C schmelzen. Da Paraffinpellets vor dem Schmelzen mehr Platz beanspruchen, stellen Sie sicher, dass genügend Paraffin geschmolzen wird, um alle Kassetten abzudecken.
      HINWEIS: Die Temperatur sollte nicht höher als 60 °C sein, da dies zu Artefakten führen kann.
   2. Waschen Sie das Gewebe, indem Sie die Flüssigkeit in den entsprechenden Abfallbehälter gießen und sofort durch die folgenden Chemikalien ersetzen.
      1. 30 Min. in absolutem Methanol inkubieren. Einmal wiederholen.
      2. In absolutem Ethanol für 20 min inkubieren. Einmal wiederholen.
      3. 15 Min. in Xylolen inkubieren. Einmal wiederholen.
      4. Tauschen Sie die Wäschen schnell aus und achten Sie darauf, die Kassetten nicht trocknen zu lassen. Stellen Sie sicher, dass jede Wäsche die Kassetten im Becher oder Behälter vollständig bedeckt.
         HINWEIS: Xylole sind brennbar, und wenn sie eingeatmet werden, können die Dämpfe das zentrale Nervensystem mit möglichen langfristigen neurologischen Folgen bei Exposition gegenüber hohen Konzentrationen (>200 ppm) unterdrücken. Behandeln Sie Xylole nur in einem Abzug. Da Xylole gefährlich sind, achten Sie darauf, die erforderliche Mindestmenge zu verwenden, um die histologischen Kassetten abzudecken.
   3. Orientieren Sie während des Einbettens die Darmsegmente parallel zur Länge der Kassette (im Gegensatz zu aufrecht) mit einer Pinzette, um Längsschnitte quer anstelle von Querschnittskrapfen bereitzustellen, um mehr potenzielle Probenfläche für die quantitative Bildgebung bereitzustellen (Abbildung 1B).
   4. Öffnen Sie die Kassetten leicht (~ 1-2 cm oder 0,5 Zoll), damit das Paraffin eindringen kann, ohne die Gewebesegmente zu verlieren. Verwenden Sie für diesen Schritt doppelte Handschuhe oder eine Pinzette, um eine Überhitzung oder ein leichtes Brennen der Finger zu verhindern. Tauchen und verschließen Sie die Kassetten in den Behälter mit geschmolzenem Paraffin und legen Sie den Behälter zurück in den 60 ° C-Ofen. Stellen Sie sicher, dass die Kassetten mit Paraffin gefüllt sind und keine großen Luftblasen zurückbleiben.
   5. Nach der Inkubation für 2 h bei 60 °C den Behälter aus dem Ofen nehmen. Entfernen Sie die Kassetten vorsichtig mit einer Pinzette und legen Sie sie zum Abkühlen einzeln auf ein Stück Aluminiumfolie. Lagern Sie sie bei Raumtemperatur, bis sie zum Einbetten und Schneiden bereit sind.
   6. Schneiden Sie die Paraffinblöcke mit einem Mikrotom, schneiden Sie tief genug in den Block, dass luminale Inhalte freigelegt werden, was einen Längsschnitt von Zotten und / oder Krypten zusätzlich zu luminalen Inhalten und Schleim ermöglicht. Achten Sie darauf, die Klingen zu ersetzen, da Fäkalienmaterial die Klinge im Vergleich zu Gewebe schnell stumpf macht. Schneiden Sie Schnitte auf 4 μm Dicke für optimale Schärfe der Bilder. Übertragen Sie die Abschnitte auf normale unbeschichtete Schienen.
   7. Färben Sie für die FISH-Färbung die Darmabschnitte so schnell wie möglich (d. H. Innerhalb weniger Wochen nach dem Schneiden), um ein starkes FISH-Signal zu erhalten. Wenn die FISH-Färbung weggelassen wird, kann die Lektin- und DAPI-Färbung an weniger frischen (d. H. Monate alten) Proben ohne signifikanten Signalverlust durchgeführt werden.

3. Färbende Bakterien und Wirtsmerkmale

1. Präparat
   1. Den Backofen auf 60 °C erhitzen. Erwärmen Sie ein leeres Coplin-Glas und genügend Volumen, um die Glasschieber im Glas zweimal mit Xylolen in einer Glasflasche zu bedecken, wobei sie darauf achten, den Deckel zu parafilmieren, um eine Verdunstung der Xylole zu verhindern. Lassen Sie die Temperatur der Xylole 60 °C erreichen.
      HINWEIS: Ein Standard-Coplin-Glas passt auf 8 Objektträger, und die Objektträger können mit etwa 50 ml Flüssigkeit bedeckt werden (kann je nach Marke zwischen 40 und 60 ml variieren). Xylol-Ersatzstoffe sind weniger toxisch und wurden von anderen Gruppen erfolgreich für den Entwachsungsschritt (Schritt 3.2)^8,9 verwendet.
   2. Wenn ein separater Ofen verfügbar ist, erwärmen Sie einen Hybridisierungsofen auf 50 °C vor. Andernfalls kann dieser Schritt mit demselben Ofen durchgeführt werden, der nach Schritt 3.2.3 zum Backen der Objektträger verwendet wird.
   3. Vorbereitung der FISH-Hybridisierungslösung: 20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 0,9 m NaCl; 0,01%²⁶ - 0,1%⁹ (w/v) Natriumdodecylsulfat (SDS) in nukleasefreiem Wasser. Falls erforderlich, fügen Sie 5-50% (v/v) Formamid hinzu. Erwärmen Sie diese Hybridisierungslösung bei 50 °C während der Entparaffinisierung.
      HINWEIS: Formamid ist ein Amid, das als Teratogen wirkt; Griff Formamid mit Handschuhen und Schutzbrille. In kleinen Dosen und bei Exposition gegenüber Augen, Haut oder Schleimhäuten ist es irritierend. In großen Mengen kann Formamiddampf einen medizinischen Eingriff erfordern. Formamid kann zu 100% in einem -20 °C Gefrierschrank gelagert werden.
2. Vorbereitung der Objektträger für die Färbung: Deparaffinisierung
   1. Legen Sie die Dias in das Coplin-Glas, um sicherzustellen, dass die Abschnitte nicht mit anderen Dias oder dem Glas in Berührung kommen, und backen Sie die Dias bei 60 ° C für 10 min.
   2. Füllen Sie das Coplin-Glas im Abzug mit vorgewärmten Xylolen aus dem Ofen und achten Sie darauf, nicht direkt auf die Proben zu gießen und möglicherweise das Gewebe zu entfernen. Stellen Sie das Coplin Glas wieder in den 60 °C warmen Ofen. Lassen Sie die Flasche mit den restlichen Xylolen im Abzug.
   3. Gießen Sie die gebrauchten Xylole zur Entsorgung in einen geeigneten Abfallbehälter, achten Sie darauf, die Gewebeabschnitte auf den Glasobjektträgern nicht zu stören, und verwenden Sie eine Pinzette, um zu verhindern, dass die Objektträger aus dem Coplin-Glas fallen. Füllen Sie das Coplin-Glas mit den restlichen Xylolen auf und inkubieren Sie es für 10 min bei Raumtemperatur im Abzug.
   4. Inkubieren Sie die Abschnitte in 99,5% Ethanol für 5 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie nach diesem Inkubationsschritt die Objektträger aus dem Coplin-Glas, wischen Sie die Rückseite der Objektträger auf einem Labortuch oder Papiertuch ab und trocknen Sie sie kurz an der Luft, bis die Ethanoltröpfchen verschwunden sind.
      HINWEIS: Das Wischen der Rückseite der Folien ermöglicht eine bessere Visualisierung des Trocknungsfortschritts.
3. Bakterielle Färbung mit FISH
   1. Verwenden Sie einen Flüssigkeitsblocker oder PAP-Pen, um den Bereich der Flüssigkeitsausdehnung zu begrenzen, indem Sie den Bereich jedes Gewebeabschnitts umkreisen. Stellen Sie sicher, dass die Tinte nicht mit dem Abschnitt selbst in Berührung kommt. Erstellen Sie einen Kreis so nah wie möglich an jedem Gewebeabschnitt, ohne das Gewebe zu berühren, um die Oberfläche zu minimieren, die von der Hybridisierungslösung abgedeckt werden muss.
   2. Bereiten Sie die Hybridisierungslösung vor: Für jeweils 50 μL vorgewärmte Hybridisierungslösung werden 0,5 μg Sonde (z. B. 0,5 μL 1 μg/μL Sonde) hinzugefügt. Pipettieren Sie die Hybridisierungslösung auf die Abschnitte auf dem Objektträger (~20 μL/Schnitt, abhängig von der Schnitt-/Kreisgröße). Schützen Sie die Hybridisierungslösung und die Objektträger ab diesem Zeitpunkt während der Inkubationsschritte und der Lagerung vor Licht.
   3. Stellen Sie sicher, dass das Volumen der verwendeten Flüssigkeit den gesamten Abschnitt abdeckt, wenn Sie mit einem flexiblen Kunststoff-Deckglas überzogen werden. Inkubieren Sie den Objektträger in einer Feuchtkammer, um die Verdunstung zu reduzieren. Erstellen Sie eine feuchte Kammer mit einer Pipettenspitzenbox mit Tüchern oder Papiertüchern an der Unterseite, die mit überschüssiger Hybridisierungslösung oder phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) getränkt wurden, um Feuchtigkeit bereitzustellen. Inkubieren Sie die Abschnitte bei 45-50 °C, je nach Sondensatz, für >3 h.
   4. Fish-Waschpuffer aufwärmen: 20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 0,9 M NaCl bis 50 °C während der Inkubationszeit. Bereiten Sie genügend Waschpuffer vor, um die Objektträger im Coplin-Glas abzudecken.
   5. Entfernen Sie die Kunststoff-Deckgläser; Inkubieren Sie die Objektträger in FISH-Waschpuffer in einem Coplin-Glas, beide auf 50 °C vorgewärmt. Das Coplin Glas für 10-20 min wieder in den 50 °C warmen Ofen stellen. Entfernen Sie bei dicken Proben die Deckgläser im Coplin-Glas, indem Sie den Puffer hinzufügen und die Deckgläser vorsichtig entfernen, um ein Verschmieren der Scheibe zu vermeiden.
4. Färbung des Schleims und der Wirtsmerkmale
   1. Bereiten Sie einen allgemeinen DNA/Schleim-Gegenfleck in PBS vor: endgültige 10 μg/ml DAPI + 40 μg/ml Schleimfärbung UEA-1. Bereiten Sie genügend Gegenfleck vor, um die Flecken in Abwesenheit eines Deckglases abzudecken, um zu vermeiden, dass das Gewebe mit zusätzlichen Deckgläsern beschädigt wird.
      HINWEIS: Das Abdecken der Flecken in Abwesenheit eines Deckglases erfordert größere Volumina als die in 3.3.2 verwendeten 20 μL. Für durchschnittlich große Abschnitte (~ 10 mm Durchmesser) reichen 200 μL aus, um einen Punkt abzudecken; Testen Sie dieses Volumen vorher auf einem Dummy-Dia.
   2. Entfernen Sie den FISH-Waschpuffer und ersetzen Sie ihn durch PBS im Coplin-Glas. Unmittelbar nach dem Nachfüllen des Coplin Glases mit PBS dekantieren Sie das PBS.
   3. Entfernen Sie die Objektträger aus dem Glas und pipettieren Sie den Gegenfleck oben auf dem Abschnitt, während Sie sicherstellen, dass das Gewebe nicht mit der Pipettenspitze berührt wird. Bedecke den gesamten Abschnitt mit einer Blase. Bei 4 °C für 45 min im Dunkeln inkubieren.
   4. Waschen Sie die Flecken 3 mal schnell mit frischem PBS: Während Sie die Objektträger mit einer Pinzette an Ort und Stelle halten, gießen Sie das PBS in eine Spüle und füllen Sie es sofort mit frischem PBS auf.
   5. Wischen Sie die Rückseite der Dias gegen ein Tuch oder Papiertuch und lassen Sie den größten Teil des PBS von den Abschnitten verdunsten, unterstützt durch eine Vakuumleitung, die mit einer Pipettenspitze verbunden ist. Vermeiden Sie es noch einmal, den Abschnitt mit der Pipettenspitze zu berühren.
   6. Montieren Sie die Abschnitte mit einem Montagemedium (ohne DAPI) und lassen Sie es bei Raumtemperatur von Glasabdeckungslippen abdecken, um sicherzustellen, dass die Deckgläser flach sind und keine Luftblasen im Montagemedium vorhanden sind.
   7. Befestigen Sie die Deckgläser auf dem Objektträger, indem Sie die Ränder des Deckglases mit klarem Nagellack bemalen und dabei darauf achten, dass er sich vom Rand des Objektträgers fernhält, um sicherzustellen, dass der Objektträger während der Bildgebung waagerecht im Objektträgerhalter sitzt.
   8. Lagern Sie die Objektträger bei 4 °C im Dunkeln einige Wochen, bevor die Fluoreszenz erschöpft ist.

4. Bildgebung und Bildanalyse

1. Visualisierung der Flecken
   1. Wählen Sie einen Bereich des Gewebes aus, der sowohl Gewebe als auch Lumen enthält, um die Mikrobiota-Wirts-Schnittstelle abzubilden. Für die quantitative Bildgebung der Schleimdicke und die luminale Biogeographie wählen Sie Sichtfelder aus, in denen die Scheiben der Epithelzotten und/oder Krypten longitudinal und nicht im Querschnitt verlaufen. Vermeiden Sie Bereiche mit großen Lücken zwischen dem Schleim und dem Epithel, um Schnittartefakte zu vermeiden.
   2. Lokalisieren Sie Gewebe und korrigieren Sie die Brennebene, indem Sie das DAPI-Signal zum Lokalisieren und Fokussieren verwenden, um eine Photobleiche des FISH-Fluoreszenzsignals zu vermeiden.
   3. Passen Sie die Imaging-Einstellungen an. Um die bakterielle DAPI-Färbung sichtbar zu machen, erhöhen Sie die Laserleistung und gewinnen Sie bis zu dem Punkt, an dem das DAPI-Signal von Epithelzellen übersättigt oder "ausgeblasen" wird.
      HINWEIS: Übersättigen Sie nicht übermäßig, da dies zu Photobleichen und visuellen Artefakten in den Kernen führt, die nicht wiederhergestellt werden können.
   4. Verwenden Sie für alle anderen Kanäle die minimale Laserleistung, die ein klares Signal über dem Hintergrund liefert, und achten Sie darauf, nicht zu übersättigt zu sein.
      HINWEIS: Dies ist besonders wichtig bei der Durchführung von Kachel-Scans, da Photobleaching problematisch ist, wenn die Überlappung zwischen Kacheln abgebildet wird.
   5. Verwenden Sie eine 40-fache oder höhere Vergrößerung, um einzelne Bakterien abzubilden.
   6. Erwerben Sie die Bilder.
      1. Erfassen Sie Kachelscans, um quantitative Daten über die Schleimdicke und die räumliche Verteilung der Mikroben innerhalb des Lumens zu erhalten. Stellen Sie eine Überlappung von 15 % zwischen den Kacheln sicher und prüfen Sie auf Vignettierung/ungleichmäßige Beleuchtung, die durch <1-fachen Zoom verstärkt werden kann. Achten Sie beim Einrichten eines Kachelscans genau darauf, ob das Gewebe in allen Kacheln scharf ist, da verschwommene/unscharfe Bilder nicht analysiert werden können (Abbildung 3B).
      2. Wenn möglich, minimieren Sie die Anzahl der Kacheln, die benötigt werden, um eine bestimmte Länge des Epithels abzubilden, indem Sie den Scanbereich so drehen, dass das Epithel und die Schleimschicht parallel zur Kachel und nicht in einem Winkel sind. Andernfalls finden Sie einen Abschnitt des Epithels, der parallel oder senkrecht zum Bildgebungsbereich verläuft, um einen ähnlichen Effekt zu erzielen.

Ergebnisse

Um die Lokalisation spezifischer darmkommensaler Bakterien im Mausdarm zu untersuchen, wurden in dieser Studie keimfreie Swiss Webster Mäuse verwendet, die mit einzelnen Bakterienisolaten besiedelt waren. Für dieses Experiment waren die markierten Bakterienarten i) ein menschliches Isolat der Muribaculaceae-Familie5, Muribaculum intestinale, eine reichlich vorhandene und weit verbreitete Familie von Bakterien in der murinen Mikrobiota15, sowie ii) Bacteroides thetaiotaomicron, ein genetisch behandelbares und häufiges Darmbakterium. Nach zweiWöchiger Gleichgewichtsbekämpfung wurden die Mäuse eingeschläfert, und ein Segment des Dickdarms, das ein Fäkalienpellet enthielt, wurde geschnitten und in frisch zubereitetem Methacarn fixiert. Nach zwei Tagen der Fixierung wurden die Abschnitte durch Verarbeitung durch Methanol, Ethanol und Xylole dehydriert, mit Paraffin infiltriert, eingebettet und dann in luminale 4 μm-Scheiben geschnitten. Diese Proben wurden dann mit einer FISH-Sonde (3' Cy3-markiert) speziell für das Muribaculum-Isolat angefärbt, die mit Oligominer-Software12 entworfen und mit NuPACK und ^{mathFISH16,17} auf sekundäre und tertiäre Struktur und minimale unspezifische Bindung überprüft wurde. Die Proben wurden auch mit dem Rhodamin-gebundenen Lektin UEA-1 (das fucosylierte Glykane im Schleim färbt) und DAPI gegengefärbt. Die gebeizten Schnitte wurden mit einem 40-fachen Ölobjektiv und einem Super-Resolution-Modul abgebildet.

Abbildung 1: Workflow der Visualisierung der Mikrobiota-Wirts-Schnittstelle im Darm. (A) Ein veranschaulichter Workflow für die Pipeline. (B) Die beiden Schnittebenen ergeben entweder Querschnitte (bevorzugt für diese Pipeline) oder Querschnitts-"Donuts". (C) Das Einbetten von Geweben sehr unterschiedlicher Dicke kann zu Scheiben führen, die nur für das eine oder andere Gewebe optimal sind. Abkürzungen: FISH = Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung ; DAPI = 4′,6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Die Abbildung des Dickdarms zeigt die Lokalisation von Muribaculum intestinale relativ zum Schleim in einem gnotobiotischen Mausmodell. Die Abschnitte wurden mit DAPI (blau), Muribaculaceae FISH-Sonde (rot) und UEA-1 (grün) gefärbt. (A) Distaler Dickdarm der Maus monokolonisiert mit Muribaculum intestinale und (B) distaler Dickdarm der Maus bikolonisiert mit Muribaculum intestinale und Bacteroides thetaiotaomicron. Maßstabsbalken = 20 μm. (C und D) Cy3-FISH (links), DAPI (Mitte) und kombinierte Cy3-FISH + DAPI-Kanäle für luminale Einschubanteile von (A) bzw. (B). Maßstabsleiste = 5 μm. In (A) und (C) sind alle bakterienförmigen und bakteriengroßen DAPI-Signale mit Cy3 (einzelne Pfeilspitzen) markiert, und in (B) und (D) gibt es zusätzlich zu diesen Cy3- und DAPI-doppelpositiven Zellen (einzelne Pfeilspitzen) DAPI-gefärbte Bakterienzellen, die Cy3-negativ sind (Doppelpfeilspitzen), wie für Mono- und Bi-Kolonisationszustände zu erwarten. Mit Ausnahme längerer fadenförmiger Bakterien sind größere (>4 μm lange) DAPI-positive Strukturen (stumpfe Pfeile) Pflanzenmaterial oder Kerne von Wirtszellen. Abkürzungen: FISH = Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung ; DAPI = 4′,6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Häufige Probleme. (A) Flache Schnitte liefern keine luminalen Scheiben des Darms. (Links) Ein Darmsegment, das in einer Tiefe geschnitten wurde, die einen Blick auf das Lumen sowie Längsansichten des Epithels bietet. (Rechts) Ein Darmsegment, das zu flach geschnitten wurde und nur Querschnitte von Krypten und keine konstante Schleimschicht oder Bakterien enthüllt. (B) Ungleichmäßige Gewebe-/Deckglasabdeckung kann zu verschwommenen und ungleichmäßig beleuchteten Fliesenscans führen. Es wurde ein Kachel-Scan mit unscharfen Positionen eingerichtet (obere rechte Ecke). (C) Beispiel für normalen Hintergrund (links) und hohen Hintergrund (rechts). In diesem Beispiel beachten Sie für das DAPI-Signal das Signal, das vom Epithel außerhalb der Kerne kommt. Alle Maßstabsbalken = 20 μm. Abkürzung: DAPI = 4′,6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Das oben beschriebene Protokoll bietet eine reproduzierbare Methode zur Visualisierung der Wirt-Mikrobiota-Schnittstelle. Diese Assays haben erheblich von der Protokollentwicklung profitiert, angefangen von der Optimierung der ^{FISH-Markierung18} bis hin zur Schleimkonservierung und ^Bildgebung9. Fixierung und Einbettung bieten auch eine nützliche Aufbewahrung von Proben; Darüber hinaus können paraffininfiltrierte Kassetten ohne Einschränkungen verschickt werden, da die Proben vollständig fixiert und inert sind.

Bedeutung und alternative Methoden
Die Kombination von FISH und Schleimfärbung ermöglicht die Analyse der Mikrobiota-Zusammensetzung an bestimmten Gewebestellen und die Interaktion zwischen einzelnen Bakterien und dem Wirt. Alternative Techniken, die die Analyse spezifischer Stellen innerhalb der Mikrobiota beinhalten, sind in der Regel nicht in der Lage, die Einzelzellnatur dieser Wechselwirkungen zu erforschen, wie im Fall der Laser-Capture-Mikrodissektion in Verbindung mit ^{Sequenzierung19}. Sequenzierungsbasierte Techniken haben jedoch den Vorteil, dass sie das Erbgut der Mikrobiota auf einer feineren Ebene und breiter erfassen können als 16S rRNA-Sonden.

Ein Fallstrick des vorgestellten Protokolls besteht darin, dass es eine einmalige Momentaufnahme der Mikrobiota in Bezug auf den Wirt liefert. Für die Echtzeitbildgebung bei lebenden Tieren sind spezielle bildgebende Verfahren erforderlich, um die Erfassung eines Fluoreszenzsignals in tiefem Gewebe zu erleichtern (z. B. intravitale Zwei-Photonen-Mikroskopie und Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie20,21). Bei diesen Methoden wird der Modellorganismus entweder mit Bakterien besiedelt, die mit Molekülen gefärbt sind, die an ihre Hülle ^binden20 oder gentechnisch veränderten Bakterien, die fluoreszierende Proteine ^{beherbergen21}. Im letzteren Fall ist die Reifung von Fluoreszenzproteinen ein Schlüsselthema, da die meisten fluoreszierenden Standardproteine Sauerstoff benötigen, um Licht zu emittieren. Daher werden Modellorganismen benötigt, die mindestens nanaerobe Umgebungen (nanomolare Sauerstoffkonzentration) haben, wie der aerobe Zebrafisch ^gut21.

In diesem Protokoll wird Methanol-Carnoy als Fixiermittel anstelle von Paraformaldehyd oder Formalin verwendet, da es kein Wasser enthält. Dies verhindert Hydratation, Austrocknung und Kollaps der Schleimschicht während der Verarbeitung und ermöglicht genaue Messungen der Schleimdicke. Während die Methacarnfixierung und die Paraffineinbettung zu einem Standard auf diesem Gebiet geworden sind, wurden verschiedene Fixiermittel und Einbettungstechniken untersucht, um die Schleimkonservierung zu ^{optimieren9,22}, wobei einige Studien darauf hindeuten, dass Harze der Paraffineinbettung überlegen sein ^können22. Eine weitere wichtige Einschränkung der Paraffineinbettung und Methacarn-Fixierung ist der Verlust der fluoreszierenden Proteinfluoreszenz, der durch den Einsatz alternativer Fixiermittel (z. B. Formalin oder Paraformaldehyd (PFA)) oder modifizierter Einbettungstechniken vermieden werden ^kann23. Jedes Fixiermittel hat Vor- und Nachteile, und die Wahl des Fixiermittels hängt von den Bildgebungsprioritäten ab. Bildgebungsmodalitäten können kombiniert werden, wenn biologische Replikate in PFA und Methacarn fixiert sind und Bilder aus beiden Proben gewonnen werden.

FISH wurde in Einzelfällen mit Immunfluoreszenz mit spezifischen polyklonalen Anti-Muc2C3-Kaninchen-Antikörpern ^{kombiniert9,24}. Diese Ergebnisse wurden nicht in großem Umfang mit anderen Muc2-Antikörpern reproduziert, was darauf hindeutet, dass die Wahl der Antikörper für den Erfolg der FISH-Immunfluoreszenz-Kombination entscheidend sein kann. Die Bedingungen für eine erfolgreiche Antikörperfärbung für einen bestimmten Antikörper erlauben möglicherweise keine Beibehaltung der FISH-Färbung.

Fehlerbehebung
In diesem Protokoll stellen Probenentnahme, Schneiden und Färben kritische Schritte dar, um die Erstellung von Bildartefakten zu verhindern. Zum Beispiel kann das Drücken auf das Gewebe bei der Entnahme und vor dem Einbetten zu einer Fehllokalisierung der Mikrobiota führen und die Schleimqualität beeinträchtigen. Eine weitere wichtige Überlegung ist, die Kombination von Segmenten sehr unterschiedlicher Dicke in einer einzigen Kassette zu vermeiden, z. B. ein relativ leeres Stück des Dünndarms und ein Pellet im distalen Dickdarm. Die unterschiedlichen Dicken führen zu Schwierigkeiten bei der Bildgebung: Nach dem Einbetten kann sich der Querschnitt in einer bestimmten Tiefe für ein Segment in der falschen Tiefe für die Bildgebung des anderen befinden (z. B. befindet sich das Lumen für jedes Gewebe in unterschiedlichen Tiefen) (Abbildung 1B, C und Abbildung 3A). Darüber hinaus können Sie für die Bildgebung von Tiermodell-Stuhlpellets in peritoneale Membranen eingewickelt ^werden24. Bei dieser Technik wird ein kleiner Abschnitt des frisch isolierten Peritoneums sanft um den Stuhl gefaltet und bewahrt die Struktur des Pellets während der im Protokoll beschriebenen Waschschritte.

Im Gegensatz zur Verarbeitung von tierischem Gewebe mit Inhalt stellt die Bildgebung menschlicher Darmproben einige Herausforderungen dar. Insbesondere werden der Luminalgehalt und die Schleimhautschleimhaut wahrscheinlich durch die Darmvorbereitung der Koloskopie gestört, die normalerweise vor Darmbiopsien oder Resektionsverfahren durchgeführt wird. Darüber hinaus ist es bei der Entnahme von Biopsien hilfreich, die Gewebeorientierung zu beachten, um bei der Identifizierung spezifischer Merkmale (z. B. Lumen vs. Submukosa) in Abwesenheit von Darminhalt zu helfen. Die Voreinbettung mit 3%igem Agar und/oder Agar:Gelatine-Mischungen kann bei der Aufrechterhaltung der Gewebepolarität nützlich ^sein25; Es gibt jedoch Probleme mit der Dehydrierung und Teilung von Agar, wie in der Literatur berichtet, und die Verarbeitungszeiten müssen möglicherweise geändert werden.

Ein Schlüsselaspekt für eine gute FISH-Färbung ist die Anpassung der Formamidkonzentration für spezifische FISH-Sonden. Formamid wird die Hybridisierungsstrenge von FISH-Sonden zu ihren Zielen kontrollieren. Es ist wichtig sicherzustellen, dass a) die richtige Formamidkonzentration für die Färbung einer bestimmten Gemeinschaft gewählt wird und b) dass eine geeignete Formamidkonzentration sogar für die verwendete Sondenkombination möglich ist - dies kann die optimale Sondenwahl bei Verwendung mehrerer Sonden beeinflussen. Websites wie mathFISH (http://mathfish.cee.wisc.edu/) können bei der Berechnung der richtigen Formamidkonzentrationen für eine bestimmte Sonde helfen. In Ermangelung von Informationen über geeignete Formamidkonzentrationen kann dieses Protokoll mit 0% und 10% Formamid getestet werden.

Das Schneiden der eingebetteten Proben erfordert das Schneiden des Blocks auf eine ausreichende Tiefe, um luminale Scheiben zu erhalten, da ein zu flaches Schneiden in einen Block zu einer Querschnittsansicht der Zotten /Krypten ohne luminalen Inhalt führt (Abbildung 3A). Färben Sie die Proben kurz nach dem Schneiden auf ein optimales FISH-Signal und verwenden Sie frisches DAPI (oder DAPI, das bei -20 °C gespeichert ist), um Hintergrundprobleme zu beheben (Abbildung 3C). FISH-Färbung von Abschnitten, die älter als einen Monat sind, kann zu einer schlechteren / inkonsistenten Färbung führen.

Wenn das Gewebe oder der Deckglas in Bezug auf den Objektträger nicht perfekt flach ist, ist die Probe möglicherweise nicht an jeder Position innerhalb eines Fliesenscans scharf (Abbildung 3B), was zu verschwendetem Aufwand und potenziellem Photobleichen führt. Dies kann durch kleinere Kachelscans gelöst werden, bei denen alle Positionen als scharf verifiziert wurden. Das Schneiden mit stumpfen Klingen kann auch zur Ablösung des Schleim- und Leuchtinhalts führen, die während der Bildgebung als große dunkle Bereiche erscheinen. Schließlich kann die Verdunstung der Lösung oder der Blasen während des Hybridisierungsschritts zu einer ungleichmäßigen Färbung der FISH-Sonden im Gewebe führen.

Ein weiterer kritischer Parameter, der die Effizienz der FISH-Sondenbindung beeinflusst, ist der Wettbewerb zwischen verschiedenen Sonden. Eine nützliche Überprüfung, um zu überprüfen, ob die FISH-Sonde Bakterien markiert, besteht darin, die Kolokalisierung des Signals der FISH-Sonde mit DAPI zu untersuchen (Abbildung 2C, D). In Proben, die die Verwendung mehrerer rRNA-Sonden erfordern, ist die Anpassung von Parametern wie Hybridisierungstemperatur, Sondenkonzentration und Formamid von entscheidender Bedeutung, um sicherzustellen, dass die Sonden effizient an die richtige Spezies ^binden18.

Hinweise zur Bildgebung
FISH-gefärbte Bakterien lassen sich am besten mit einem konfokalen Mikroskop und einem Objektiv mit mindestens 40-facher Vergrößerung sichtbar machen. Während die 63-fache Vergrößerung bevorzugt wird, um Bakterien auf Einzelzellebene abzubilden, kann die 40-fache Vergrößerung auch durch Maximierung des digitalen Zooms oder durch Verwendung eines Superauflösungssystems verwendet werden. Systeme, die mit Superauflösungsfähigkeiten ausgestattet sind, können auch die subzelluläre Auflösung einzelner Bakterienzellen liefern. Objektive mit niedrigerer Vergrößerung können verwendet werden, um ein allgemeines Gefühl für die Bakterienlokalisation und die Schleimdicke zu erhalten.

Die Aufnahme von 16-Bit-Bildern anstelle von 8-Bit-Bildern wird ebenfalls dringend empfohlen, da der höhere Dynamikbereich dazu beiträgt, den großen Bereich des DAPI-Signals aus den extrem hellen Kernen des Epithels und das relativ schwache Signal luminaler Bakterien zu erfassen. Abgesehen von der Verwendung des oben beschriebenen Bildgebungsaufbaus ist die Wahl der Fluorophore eine wichtige Überlegung für die Bildgebung. Für eine optimale Trennung zwischen Bakterientypen ist sicherzustellen, dass sich die verwendeten Fluorophore in Anregungs- und Emissionsspektren nicht überlappen (es sei denn, die Bildgebung auf einem System mit der Fähigkeit, eine lineare Entmischung durchzuführen). Zusätzlich können Sonden in Kombination verwendet werden (z. B. die Kombination einer familienspezifischen Sonde und einer gattungsspezifischen Sonde), um zusätzliche Community-Mitglieder zu identifizieren. Bei der Verwendung von linearen sortenreinen oder nicht validierten Sonden ist es wichtig, die Genauigkeit und den Grad der FISH-Färbung an Reinkulturen zu ^testen8,14.

Sobald die Bilder gesammelt sind, stehen mehrere Tools für die quantitative Analyse der Wirt-Mikrobiota-Schnittstelle zur Verfügung, wie ^BacSpace26, HiPR-FISH8 und andere Segmentierungswerkzeuge27. BacSpace ist eine MATLAB-Software, die die Segmentierung der Gewebe- und Leuchtkomponenten sowie die Entfernung von Pflanzenmaterial aus Bildern ^{ermöglicht26}. Das Programm bietet auch eine Analyse der Schleimdicke in 2D und eine Quantifizierung der räumlichen Verteilung basierend auf Pixelabständen in verschiedenen ^Kanälen26. Umgekehrt ermöglicht die HiPR-FISH Bildanalyse-Software die Segmentierung von FISH-gefärbten ^Zellen8. Schließlich könnten auch andere bakterielle Segmentierungswerkzeuge, die für In-vitro-Experimente optimiert ^wurden27, an diese Anwendung angepasst werden.

Schlussfolgerung
Die In-situ-Bildgebung ermöglicht die quantitative Analyse einzelner mikrobieller Taxa im Kontext anderer Gemeindemitglieder und der verschiedenen Mikroumgebungen, die durch Ernährung, Schleim und Wirtsepithelkrypten entstehen. Die Interaktion zwischen Organismen bestimmt die Biologie der wirtsassoziierten mikrobiellen Systeme und liefert eine wesentliche Analyse der Veränderung dieser Strukturen während der Störung, die Auswirkungen auf die Gesundheit hat. Insbesondere die Fähigkeit, die Mikrobiota in situ durch das oben beschriebene Protokoll abzubilden, bietet ein unglaubliches Fenster in die Biogeographie der Mikrobiota in Bezug auf den tierischen Wirt.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum foil
Chloroform	Fisher	C298-500	Toxic
Coplin jar	Fisher	08-813E
Cover glass, 22 × 22 mm, no #1	VWR	CA48366-227-1
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	Resuspended to 5 mg/mL
Empty pipette tip box(es)			To melt paraffin
Ethanol, anhydrous, molecular grade	--	--
FISH probes
FISH hybridization solution	--	--	20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl, 0.01% (w/v) SDS in nuclease-free water. Optional addition of 5–50% (v/v) formamide
FISH washing buffer	--	--	20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl
Fluorescently-labeled Ulex Europaeus Agglutinin (UEA-1) lectin	Vector Laboratories	FL-1061 (Fluorescein-labeled) or RL-1062-2 (Rhodamine-labeled)	UEA-1 labels fucosylated glycans, so it is not appropriate for germ-free mice or for samples from fucosyltransferase 2 (FUT2)-deficient hosts.
Forceps
Formamide	Sigma-Aldrich	F9037
Fumehood
Glacial Acetic Acid	Fisher	A38-212	Corrosive and flammable
HybriSlip flexible plastic cover slips, 22 x 22 mm × 0.25 mm	Sigma Aldrich	GBL722222	for FISH hybridization steps, can substitute glass coverslips
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen	Vector Laboratories	H-4000
Kimwipes
Methanol	Fisher	A412	Toxic and flammable
Microtome			for sectioning
Multipurpose Specimen Storage Containers, 473 mL	Fisher	14-955-117A	Can substitute with a glass or polyethylene container of your choice. Methacarn is not compatible with polystyrene or metal.
Nail Polish	Electron Microscopy Sciences	72180	Any nail polish should work
Oven			Necessary range: 45-60 °C
Paraffin: Leica Paraplast	Leica	39601006
PBS, Phosphate-buffered Saline (10x solution)	Fisher	BP3991	Dilute to 1x for protocol
Sodium chloride	Fisher	S271
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 20% Solution, RNase-free	Invitrogen	AM9820
Tissue-Loc HistoScreen Cassettes	Thermo Scientific	CA83009-999
Trizma hydrochloride solution, 1M Tris-HCl, pH 7.4	Sigma-Aldrich	T2663-1L
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
Water, nuclease-free	Fisher	BP2484100
Xylenes	Fisher	X3P-1GAL	Toxic and flammable