On-Chip-Kristallisation und großflächige serielle Beugung bei Raumtemperatur

Zusammenfassung

Dieser Beitrag beschreibt, wie man die Proteinkristallisation auf Crystal-on-Crystal-Geräten einrichtet und wie man eine automatisierte serielle Datenerfassung bei Raumtemperatur mit der On-Chip-Kristallisationsplattform durchführt.

Zusammenfassung

Biochemische Reaktionen und biologische Prozesse können am besten verstanden werden, indem gezeigt wird, wie Proteine zwischen ihren funktionellen Zuständen übergehen. Da kryogene Temperaturen unphysiologisch sind und die Proteinstrukturdynamik verhindern, abschrecken oder sogar verändern können, ist eine robuste Methode für routinemäßige Röntgenbeugungsexperimente bei Raumtemperatur sehr wünschenswert. Das Crystal-on-Crystal-Gerät und die dazugehörige Hard- und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden, sind so konzipiert, dass sie eine In-situ-Röntgenbeugung bei Raumtemperatur für Proteinkristalle unterschiedlicher Größe ohne Probenmanipulation ermöglichen. Hier stellen wir die Protokolle für die wichtigsten Schritte von der Gerätemontage, On-Chip-Kristallisation, optischem Scannen, Kristallerkennung bis hin zur Röntgenaufnahmeplanung und automatisierten Datenerfassung vor. Da diese Plattform keine Kristallgewinnung oder andere Probenmanipulation erfordert, können Hunderte bis Tausende von Proteinkristallen, die auf Chip gezüchtet werden, programmierbar und mit hohem Durchsatz in einen Röntgenstrahl eingebracht werden.

Einleitung

Aufgrund der ionisierenden Wirkung von Röntgenstrahlung war die Proteinkristallographie in den letzten drei Jahrzehnten weitgehend auf kryogene Bedingungen beschränkt. Daher ergibt sich das aktuelle Wissen über Proteinbewegungen während seiner Funktion weitgehend aus Vergleichen zwischen statischen Strukturen, die in verschiedenen Zuständen unter kryogenen Bedingungen beobachtet wurden. Kryogene Temperaturen behindern jedoch unweigerlich das Fortschreiten einer biochemischen Reaktion oder Interkonversion zwischen verschiedenen Konformationszuständen, während Proteinmoleküle arbeiten. Um die Proteinstrukturdynamik mit atomarer Auflösung direkt durch Kristallographie zu beobachten, sind robuste und routinemäßige Methoden zur Durchführung von Beugungsexperimenten bei Raumtemperatur erforderlich, was technische Innovationen in der Probenabgabe, Datenerfassung und posterioren Datenanalyse erfordert. Zu diesem Zweck haben die jüngsten Fortschritte in der seriellen Kristallographie neue Wege eröffnet, um die molekularen Bilder von Zwischenprodukten und kurzlebigen Strukturspezies bei Raumtemperatur ^1,2,3 aufzunehmen. Im Gegensatz zu der in der konventionellen Kryokristallographie weit verbreiteten "Ein-Kristall-ein-Datensatz"-Strategie verfolgt die serielle Kristallographie eine Datenerfassungsstrategie, die der Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie ähnelt. Konkret werden die experimentellen Daten in der seriellen Kristallographie in kleinen Fraktionen aus einer großen Anzahl von Einzelproben gesammelt, gefolgt von einer intensiven Datenverarbeitung, bei der Datenfraktionen ausgewertet und zu einem vollständigen Datensatz zur 3D-Strukturbestimmung zusammengeführt werden⁴. Diese "One-Crystal-One-Shot"-Strategie mildert effektiv die Röntgenstrahlungsschädigung von Proteinkristallen bei Raumtemperatur durch eine Beugung vor der Zerstörungsstrategie⁵.

Da die serielle Kristallographie eine große Anzahl von Proteinkristallen benötigt, um einen Datensatz zu vervollständigen, stellt sie viele biologische Systeme, in denen Proteinproben begrenzt sind und/oder eine empfindliche Kristallhandhabung erforderlich ist, vor große technische Herausforderungen. Eine weitere wichtige Überlegung ist, wie die Kristallintegrität in seriellen Beugungsexperimenten am besten erhalten werden kann. Die In-situ-Beugungsmethoden adressieren diese Bedenken, indem sie es Proteinkristallen ermöglichen, direkt von dort zu beugen, wo sie wachsen, ohne die Versiegelung der Kristallisationskammer 6,7,8,9 zu brechen. Diese handhabungsfreien Verfahren sind selbstverständlich kompatibel mit großflächiger serieller Beugung. Wir haben kürzlich über das Design und die Implementierung einer Kristallisationsvorrichtung für die In-situ-Beugung berichtet, die auf einem Crystal-on-Crystal-Konzept basiert - Proteinkristalle, die direkt auf monokristallinem Quarz¹¹ gezüchtet werden. Dieses "Kristall-auf-Kristall"-Gerät bietet mehrere Vorteile. Erstens verfügt es über ein röntgen- und lichttransparentes Fenster aus einem monokristallinen Quarzsubstrat, das wenig Hintergrundstreuung erzeugt, was zu hervorragenden Signal-Rausch-Verhältnissen in Beugungsbildern von Proteinkristallen führt. Zweitens ist der einkristalline Quarz eine ausgezeichnete Dampfsperre, die Glas entspricht und somit eine stabile Umgebung für die Proteinkristallisation bietet. Im Gegensatz dazu neigen andere Kristallisationsvorrichtungen, die polymerbasierte Substrate verwenden, aufgrund der Dampfdurchlässigkeit zum Austrocknen, es sei denn, das Polymermaterial weist eine erhebliche Dicke auf, was folglich zu einer hohen Hintergrundstreuung beiträgt¹⁰. Drittens ermöglicht dieses Gerät die Abgabe einer großen Anzahl von Proteinkristallen an den Röntgenstrahl ohne jegliche Form von Kristallmanipulation oder -ernte, was für die Erhaltung der Kristallintegrität entscheidend ist¹¹.

Um serielle Röntgenbeugungsexperimente mit den Crystal-on-Crystal-Geräten zu rationalisieren, haben wir einen Diffraktometer-Prototyp entwickelt, der ein einfaches Umschalten zwischen den optischen Scanning- und Röntgenbeugungsmodi¹² erleichtert. Dieses Diffraktometer hat einen geringen Platzbedarf und wurde für die serielle Datenerfassung an zwei Beamlines der Advanced Photon Source (APS) am Argonne National Laboratory verwendet. Konkret haben wir BioCARS 14-ID-B für die Laue-Beugung und LS-CAT 21-ID-D für die monochromatische Oszillation verwendet. Diese Diffraktometer-Hardware ist nicht erforderlich, wenn eine Synchrotron- oder Röntgen-Freie-Elektronen-Laser-Beamline mit zwei Schlüsselfunktionen ausgestattet ist: (1) motorisierte Probenpositionierung mit einem Verfahrbereich von ±12 mm um den Röntgenstrahl in alle Richtungen; und (2) eine On-Axis-Digitalkamera für die Kristallbetrachtung unter Lichtbeleuchtung, die für untersuchte Proteinkristalle sicher ist. Das monokristalline Quarzgerät bildet zusammen mit einem tragbaren Diffraktometer und der Steuerungssoftware für optisches Scannen, Kristallerkennung und automatisierte In-situ-Datenerfassung die inSituX-Plattform für die serielle Kristallographie. Obwohl diese Entwicklung in erster Linie durch ihre dynamischen Kristallographie-Anwendungen mit einer polychromatischen Röntgenquelle motiviert ist, haben wir das Potenzial dieser Technologie zur Unterstützung monochromatischer Oszillationsmethoden^10,12 demonstriert. Mit Automatisierung bietet diese Plattform eine serielle Datenerfassungsmethode mit hohem Durchsatz bei Raumtemperatur mit erschwinglichem Proteinverbrauch.

In diesem Beitrag beschreiben wir im Detail, wie man die On-Chip-Kristallisation in einem Nasslabor aufbaut und wie man serielle Röntgendatenerfassung an einer Synchrotron-Beamline mit der inSituX-Plattform durchführt.

Die Batch-Methode wird verwendet, um eine On-Chip-Kristallisation unter einer ähnlichen Bedingung wie die Dampfdiffusionsmethode für dieselbe Proteinprobe einzurichten (Tabelle 1). Als Ausgangspunkt empfehlen wir, Fällungsmittel in einer 1,2-1,5-fachen Konzentration für die Dampfdiffusionsmethode zu verwenden. Bei Bedarf kann die Chargenkristallisation durch Feingittersiebung weiter optimiert werden. Quarzwafer sind für Optimierungsversuche nicht notwendig; Stattdessen können Glasdeckgläser verwendet werden (siehe unten). Teilweise beladene Kristallisationsgeräte werden empfohlen, um Optimierungsversuche in kleinerem Maßstab durchzuführen. Eine Reihe von Proteinproben wurde erfolgreich auf solchen Geräten unter Verwendung der Batch-Methode¹⁰ kristallisiert (Tabelle 1).

Das Gerät selbst besteht aus folgenden Teilen: 1) einem äußeren Ring; 2) zwei Quarzwafer; 3) eine scheibenartige Unterlegscheibe aus Kunststoff oder Edelstahl; 4) einen Sicherungsring; 5) Mikroskop-Tauchöl als Dichtmittel (Abbildung 1). Das Gesamtvolumen der Kristallisationslösung, die auf einen Chip geladen wird, hängt vom Zweck des Experiments ab. Die Kapazität der Kristallisationskammer kann durch Auswahl einer Unterlegscheibe unterschiedlicher Dicke und/oder Innendurchmesser eingestellt werden. Wir richten routinemäßig Kristallisationsgeräte mit einer Kapazität von 10-20 μL mit Scheiben von 50-100 μm Dicke ein. Ein typisches Gerät kann Zehntausende bis Tausende von Proteinkristallen produzieren, die für die serielle Datenerfassung geeignet sind (Abbildung 2).

Wenn die On-Chip-Kristallisation erfolgreich ist, werden Dutzende bis Hunderte oder sogar Tausende von Proteinkristallen auf jedem Quarzgerät erzeugt, die für die Röntgenbeugung bereit sind. An einer Synchrotron-Beamline wird eine solche Vorrichtung mittels eines kinematischen Mechanismus auf einem dreiachsigen Translationstisch des Diffraktometers montiert. Das Kristallisationsfenster eines montierten Gerätes wird optisch gescannt und in Dutzenden bis Hunderten von Mikroaufnahmen abgebildet. Diese Mikroaufnahmen werden dann zu einer hochauflösenden Montage zusammengefügt. Bei lichtempfindlichen Kristallen kann das optische Scannen unter Infrarotlicht (IR) durchgeführt werden, um eine unbeabsichtigte Photoaktivierung zu vermeiden. Eine Computer-Vision-Software wurde entwickelt, um zufällig auf dem Gerät verteilte Proteinkristalle zu identifizieren und zu lokalisieren. Diese Kristalle werden dann nach ihrer Größe, Form und Position eingestuft, um die Datenerfassungsstrategie in der seriellen Kristallographie zu informieren oder zu leiten. Zum Beispiel können einzelne oder mehrere Schüsse auf jedem Zielkristall lokalisiert werden. Benutzer konnten einen einzelnen Durchgang oder mehrere Routen durch gezielte Kristalle planen. Wir haben Software implementiert, um verschiedene Reiserouten zu berechnen. Zum Beispiel wird die kürzeste Route mit Algorithmen berechnet, die das Problem des Handlungsreisenden¹³ angehen. Für dynamische kristallographische Pump-Probe-Anwendungen können Zeitpunkt und Dauer von Laser- (Pump) und Röntgenaufnahmen (Sonde) gewählt werden. Eine automatisierte serielle Datenerfassung ist so programmiert, dass sie jeden Zielkristall nacheinander in den Röntgenstrahl transloziert.

Zu den wichtigsten Komponenten des insituX-Diffraktometers gehören: 1) ein Gerätehalter; 2) eine dreiachsige Übersetzungsstufe; 3) eine Lichtquelle für optisches Scannen; 4) ein Röntgenstrahlstopp; 5) Pumplaser, wenn lichtempfindliche Proteine untersucht werden; 6) Raspberry Pi Mikrocomputer mit einer IR-empfindlichen Kamera; 7) Steuerungssoftware zur Synchronisierung von Motoren, Kameras, Lichtquellen, Pumplaser und zur Schnittstelle mit Beamline-Steuerungen.

Protokoll

1. Gerätevormontage

1. Beschriften Sie den Außenring (30 mm Durchmesser) zur Probenidentifikation. Geben Sie ggf. den Projektnamen, die Gerätenummer, die Kristallisationsbedingung und das Datum an (Abbildung 1A). Legen Sie den äußeren Ring kopfüber auf eine saubere Oberfläche (Abbildung 1B), und legen Sie vorsichtig einen Quarzwafer in den Ring (Abbildung 1C). Dieser erste Quarzwafer dient als Eingangsfenster für die einfallenden Röntgenstrahlen.
2. Gießen Sie eine kleine Menge Mikroskop-Tauchöl (Viskosität von 150 cSt) in eine Petrischale. Tauchen Sie eine Unterlegscheibe in das Öl, und stellen Sie sicher, dass beide Seiten der Unterlegscheibe ordnungsgemäß geölt sind (Abbildung 1D). Entfernen Sie das überschüssige Öl, indem Sie die Unterlegscheibe auf eine saubere Oberfläche tupfen.
3. Legen Sie die geölte Unterlegscheibe auf den ersten Quarzwafer (Abbildung 1E).
   HINWEIS: Tauchöl ist ein ausgezeichnetes Dichtmittel, das die Kristallisationskammer vor potenziellem Dampfverlust schützt. Richtig montierte Späne halten in der Regel wochenlang ohne sichtbare Trocknung. Dieser Vormontageschritt erfolgt unter Raumlicht. Bei lichtempfindlichen Proben müssen alle nachfolgenden Schritte, einschließlich Probenbeladung, Gerätelagerung und Beobachtung, unter Sicherheitslicht durchgeführt werden.

2. Probenbeladung und Gerätemontage

1. Verwenden Sie eine Pipette, um die Proteinlösung und den Kristallisationspuffer auf dem ersten Quarzwafer gründlich zu mischen. Das Volumenverhältnis zwischen Proteinprobe und Puffer liegt typischerweise zwischen 2:1 und 1:2 (Abbildung 1F). Stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen der Kristallisationslösung die maximale Kapazität der Kristallisationskammer, die durch die Größe und Dicke der Unterlegscheibe bestimmt wird, nicht überschreitet. Vermeiden Sie Luftblasen während des Mischens.
   HINWEIS: Die Zusammensetzung eines Kristallisationspuffers variiert von Experiment zu Experiment. Die Kristallisationsbedingungen finden Sie in Tabelle 1 .
2. Platzieren Sie den zweiten Quarzwafer über der Mischlösung, wenn sich die Lösung auszubreiten beginnt (Abbildung 1G). Dieser zweite Quarzwafer dient als Austrittsfenster der gebeugten Röntgenstrahlen.
3. Klopfen Sie den zweiten Quarzwafer leicht auf den Rand, um das Öl zu verteilen und gleichzeitig Luft herauszudrücken. Sichern Sie das Gerät, indem Sie einen Sicherungsring in den Außenring schrauben (Abbildung 1H). Verwenden Sie bei Bedarf ein Anzugswerkzeug (Abbildung 1I). Beachten Sie, dass eine übermäßige Straffung dazu führen kann, dass sich empfindliche Quarzwafer verformen oder sogar reißen.

3. Gerätespeicherung und Kristallisationsoptimierung

1. Lagern Sie die montierten Geräte (Abbildung 1J) in einer Box bei Raumtemperatur oder in einem Inkubator mit Temperaturregelung.
   HINWEIS: Proteinkristalle können in wenigen Stunden bis Tagen nach dem Zusammenbau einer Kristallisationsvorrichtung auftreten. Typische Ergebnisse der On-Chip-Kristallisation sind für mehrere repräsentative Proteinproben dargestellt (Abbildung 2).
2. Überwachen Sie das Kristallwachstum, indem Sie die Kristallisationsvorrichtung unter einem Mikroskop beobachten. Falls erforderlich, optimieren Sie die Kristallisationsbedingungen durch Iterationen der Abschnitte 1-3.

4. Kalibrierung

HINWEIS: Die in den folgenden Abschnitten genannten Programme und Befehle werden in der inSituX-Software ausgeführt.

1. Installieren Sie einen dünnen Kristall aus dotiertem Yttrium-Aluminium-Granat auf dem Chiphalter (Abbildung 3). Installieren Sie den Strahlanschlag. Machen Sie Röntgenfluoreszenzbilder des direkten Strahls, indem Sie das Programm ausführen:
   burnmark.py .param
   Dabei ist ein vom Benutzer ausgewählter Name für das Kristallisationsgerät. .param ist ein Dateiname, der gerätespezifische Steuerungsparameter enthält. Die Standardwerte werden schrittweise durch spezifische Werte entlang des Protokolls ersetzt. Eine Beispieldatei .param wird in Zusatzdatei 1 gezeigt.
2. Finden Sie die genaue Position des direkten Röntgenstrahls, indem Sie das Strahlprofilanpassungsprogramm ausführen:
   beam.py -d
   wobei der Dateiname des Röntgenfluoreszenzbildes ist (Abbildung 4).
   HINWEIS: Dieses Programm berechnet die genauen direkten Strahlpositionen sowie die Strahlgröße. Die Strahlposition markiert das Translokationsziel für alle Kristalle desselben Geräts. Die Strahlgröße wird auch für die Zielplanung verwendet.

5. Optisches Scannen

1. Setzen Sie eine Kristallisationsvorrichtung in den Chiphalter ein, und sichern Sie das Gerät mit einer Rändelschraube (Abbildung 3A).
2. Montieren Sie den Chiphalter über einen kinematischen Mechanismus auf dem Translationstisch des Diffraktometers (Abbildung 3B).
3. Installieren Sie eine geeignete Lichtquelle für die Aufnahme von Mikroaufnahmen aus dem optischen Fenster des Geräts. Weißlicht, IR-Licht oder anderes Licht der Wahl kann abhängig von der Lichtempfindlichkeit der Proteinprobe sowie dem Zweck des Experiments verwendet werden.
4. Führen Sie das Scanprogramm aus:
   scan.py .param
   Dieses Programm erfasst eine Reihe von Mikroaufnahmen, die automatisch auf bestimmte Benutzercomputer übertragen werden.
5. Führen Sie das Kachelprogramm auf einem Benutzercomputer aus:
   tile.py -x -y
   wobei < x > und die Anfangswerte für Spalten- bzw. Zeilenverschiebungen von Mikrobildern sind. Dieses Programm fügt alle Mikroaufnahmen zu einer Montage von 1-3 μm/Pixel Auflösung zusammen (Abbildung 5).
   HINWEIS: Die Schritte 5.4 und 5.5 dauern in der Regel einige Minuten. Die Gesamtzahl der Mikroaufnahmen reicht von einigen zehn bis zu hunderten, abhängig von der Scanfläche und der Vergrößerung.
6. Führen Sie das Kristallfindungsprogramm aus:
   findX.py -c -w -x
   wobei das gekachelte Bild ist. Dieses Programm führt Kristallerkennung und Schussplanung durch. > und geben die zu findende Kristallgröße an. Wenn der Benutzer kleinere Kristalle vermeiden möchte, kann als Cutoff verwendet werden, indem eine Zahl eingestellt wird, die größer ist als die Größe unerwünschter kleiner Kristalle. ist ein Winkelwert, der die Toleranz für Kristalle mit unregelmäßiger Form festlegt. bezieht sich auf die direkte Strahlgröße, die sich aus der obigen Profilverschraubung ergibt (Schritt 4.2; Abbildung 4). Außerdem kann ein Sollwert von Benutzern festgelegt werden, um gezielte Aufnahmen weiter zu verteilen. Diese Schlüsselparameter ermöglichen eine spezifische Kristallauswahl und Zielplanung (Abbildung 6).

6. Röntgenbeugung

1. Entfernen Sie die Lichtquelle und installieren Sie den Strahlstopp. Stellen Sie einen geeigneten Detektorabstand ein. Folgen Sie dem Sicherheitsprotokoll der Beamline, um den Röntgenstall zu durchsuchen. Öffnen Sie den Röntgenverschluss und ggf. den Laserverschluss.
2. Führen Sie das Datenerfassungsprogramm für die serielle Beugung aus:
   collect.py .param -l
   Dieser Befehl löst eine Datenerfassung aus, bei der alle geplanten Aufnahmen nacheinander nach einer vorprogrammierten Reihenfolge besucht werden. Jeder Zielkristall wird in die Strahlposition transloziert (Schritt 4.2). Bei jedem Stopp erfolgt die Röntgenbelichtung mit oder ohne Laserbeleuchtung in einer geplanten Zeitverzögerung. Film 1 zeigt eine automatisierte Datenerfassungssequenz , die mit einer Frequenz von 1 Hz betrieben wird. Routinemäßig werden Dutzende bis Hunderte von Beugungsbildern von einer einzigen Kristallisationsvorrichtung gesammelt (Film 2).
   HINWEIS: Abschnitt 4 Kalibrierung und Abschnitt 5 optischer Scan sind in der inSituX-Plattform enthalten und daher vollständig auf eine andere Beamline übertragbar. Abschnitt 6 Röntgenbeugung muss einige Details im Betrieb der Strahllinie beinhalten.

Ergebnisse

Mehrere repräsentative Datensätze wurden in den letzten Jahren veröffentlicht 10,12 zusammen mit den kristallographischen Ergebnissen und wissenschaftlichen Erkenntnissen aus einer Vielzahl von Proteinproben, einschließlich Photorezeptorproteinen und Enzymen, zum Beispiel einem pflanzlichen UV-B-Photorezeptor UVR8, einer lichtgetriebenen DNA-Reparaturphotolyase PhrB^10, einem neuartigen Fern-Rotlicht-Sensorprotein aus einer multidomänensensorischen Histidinkinase ^<...

Diskussion

Die Proteinkristallographie in den frühen Jahren, die bei Raumtemperatur durchgeführt wurde, hatte enorme Schwierigkeiten, Röntgenstrahlenschäden zu bekämpfen. Daher wurde es durch die robustere Kryokristallographie-Methode ersetzt, da Synchrotron-Röntgenquellen leicht verfügbar wurden²⁰. Mit dem Aufkommen von Freie-Elektronen-Röntgenlasern wurde die Proteinkristallographie bei Raumtemperatur in den letzten Jahren wiederbelebt, wobei viele neue Entwicklungen von dem Wunsch angetrieben wurd...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analysis software	In-house developed
Cerium doped yttrium aluminum garnet	MSE Supplies		Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates
Chip holder	In-house developed
Control software	In-house developed
Immersion oil	Cargille Laboratories	16482	Type A low viscosity 150 cSt
inSituX platform	In-house developed
IR light source	Thorlabs Incorporated	LED1085L	LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18
Microscope	Zeiss		SteREO Discovery V8
Outer ring	In-house developed
Petri dish	Fisher Scietific	FB0875713
Pipette	Pipetman	F167380	P10
Pump lasers	Thorlabs Incorporated	LD785-SE400	785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode
Raspberry Pi	Raspberry Pi Fundation
Retaining ring	Thorlabs Incorporated	SM1RR	SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts
Seedless quartz crystal	University Wafers, Inc.	U01-W2-L-190514	25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X
Shim	In-house developed
X-ray beam stop	In-house developed