On-Chip-Kristallisation und großflächige serielle Beugung bei Raumtemperatur

Zusammenfassung

Dieser Beitrag beschreibt, wie man die Proteinkristallisation auf Crystal-on-Crystal-Geräten einrichtet und wie man eine automatisierte serielle Datenerfassung bei Raumtemperatur mit der On-Chip-Kristallisationsplattform durchführt.

Zusammenfassung

Biochemische Reaktionen und biologische Prozesse können am besten verstanden werden, indem gezeigt wird, wie Proteine zwischen ihren funktionellen Zuständen übergehen. Da kryogene Temperaturen unphysiologisch sind und die Proteinstrukturdynamik verhindern, abschrecken oder sogar verändern können, ist eine robuste Methode für routinemäßige Röntgenbeugungsexperimente bei Raumtemperatur sehr wünschenswert. Das Crystal-on-Crystal-Gerät und die dazugehörige Hard- und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden, sind so konzipiert, dass sie eine In-situ-Röntgenbeugung bei Raumtemperatur für Proteinkristalle unterschiedlicher Größe ohne Probenmanipulation ermöglichen. Hier stellen wir die Protokolle für die wichtigsten Schritte von der Gerätemontage, On-Chip-Kristallisation, optischem Scannen, Kristallerkennung bis hin zur Röntgenaufnahmeplanung und automatisierten Datenerfassung vor. Da diese Plattform keine Kristallgewinnung oder andere Probenmanipulation erfordert, können Hunderte bis Tausende von Proteinkristallen, die auf Chip gezüchtet werden, programmierbar und mit hohem Durchsatz in einen Röntgenstrahl eingebracht werden.

Einleitung

Aufgrund der ionisierenden Wirkung von Röntgenstrahlung war die Proteinkristallographie in den letzten drei Jahrzehnten weitgehend auf kryogene Bedingungen beschränkt. Daher ergibt sich das aktuelle Wissen über Proteinbewegungen während seiner Funktion weitgehend aus Vergleichen zwischen statischen Strukturen, die in verschiedenen Zuständen unter kryogenen Bedingungen beobachtet wurden. Kryogene Temperaturen behindern jedoch unweigerlich das Fortschreiten einer biochemischen Reaktion oder Interkonversion zwischen verschiedenen Konformationszuständen, während Proteinmoleküle arbeiten. Um die Proteinstrukturdynamik mit atomarer Auflösung direkt durch Kristallographie zu....

Protokoll

1. Gerätevormontage

1. Beschriften Sie den Außenring (30 mm Durchmesser) zur Probenidentifikation. Geben Sie ggf. den Projektnamen, die Gerätenummer, die Kristallisationsbedingung und das Datum an (Abbildung 1A). Legen Sie den äußeren Ring kopfüber auf eine saubere Oberfläche (Abbildung 1B), und legen Sie vorsichtig einen Quarzwafer in den Ring (Abbildung 1C). Dieser erste Quarzwafer dient als Eingangsfenster für die einfallenden Röntgenstrahlen.
2. Gießen Sie eine kleine Menge Mikroskop-Tauchöl (Viskosität von 150 cSt) in eine Petrischale. Tauchen ....

Ergebnisse

Mehrere repräsentative Datensätze wurden in den letzten Jahren veröffentlicht 10,12 zusammen mit den kristallographischen Ergebnissen und wissenschaftlichen Erkenntnissen aus einer Vielzahl von Proteinproben, einschließlich Photorezeptorproteinen und Enzymen, zum Beispiel einem pflanzlichen UV-B-Photorezeptor UVR8, einer lichtgetriebenen DNA-Reparaturphotolyase PhrB^10, einem neuartigen Fern-Rotlicht-Sensorprotein aus einer multidomänensensorischen Histidinkinase ^<.......

Diskussion

Die Proteinkristallographie in den frühen Jahren, die bei Raumtemperatur durchgeführt wurde, hatte enorme Schwierigkeiten, Röntgenstrahlenschäden zu bekämpfen. Daher wurde es durch die robustere Kryokristallographie-Methode ersetzt, da Synchrotron-Röntgenquellen leicht verfügbar wurden²⁰. Mit dem Aufkommen von Freie-Elektronen-Röntgenlasern wurde die Proteinkristallographie bei Raumtemperatur in den letzten Jahren wiederbelebt, wobei viele neue Entwicklungen von dem Wunsch angetrieben wurd.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analysis software	In-house developed
Cerium doped yttrium aluminum garnet	MSE Supplies		Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates
Chip holder	In-house developed
Control software	In-house developed
Immersion oil	Cargille Laboratories	16482	Type A low viscosity 150 cSt
inSituX platform	In-house developed
IR light source	Thorlabs Incorporated	LED1085L	LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18
Microscope	Zeiss		SteREO Discovery V8
Outer ring	In-house developed
Petri dish	Fisher Scietific	FB0875713
Pipette	Pipetman	F167380	P10
Pump lasers	Thorlabs Incorporated	LD785-SE400	785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode
Raspberry Pi	Raspberry Pi Fundation
Retaining ring	Thorlabs Incorporated	SM1RR	SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts
Seedless quartz crystal	University Wafers, Inc.	U01-W2-L-190514	25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X
Shim	In-house developed
X-ray beam stop	In-house developed