Mikrochirurgische Erzeugung von Riesenbifurkationsaneurysmen bei Kaninchen zur Evaluierung endovaskulärer Geräte

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir die Technik zur mikrochirurgischen Herstellung von Riesenbifurkationsaneurysmen bei Kaninchen zur Beurteilung endovaskulärer Geräte.

Zusammenfassung

Riesenaneurysmen sind gefährliche Läsionen, die eine endovaskuläre Behandlung erfordern, mit hohen Raten von Aneurysma-Rekanalisationen und -Rupturen. Zuverlässige In-vivo-Modelle sind selten, werden aber für die Erprobung neuer endovaskulärer Geräte benötigt. Wir demonstrieren die technischen Aspekte der Entstehung von Riesenbifurkationsaneurysmen bei neuseeländischen Weißkaninchen (2,5-5,5 kg). Aus der Vena jugularis externa wird ein 25-30 mm langer Venenbeutel entnommen und mikrochirurgisch eine Bifurkation zwischen beiden Halsschlagadern angelegt. Der Beutel wird in der Bifurkation vernäht, um ein riesiges Aneurysma nachzuahmen. Dieses Protokoll fasst unsere zuvor veröffentlichte Standardtechnik für venöse Beutel-Aneurysmen mit echter arterieller Bifurkation zusammen und hebt ihre wesentlichen Modifikationsschritte für Riesenaneurysmen hervor. Mit dieser modifizierten Technik konnten wir ein Tiermodell für Riesenaneurysmen erstellen, das hinsichtlich der Hämodynamik und des Gerinnungssystems eine hohe Vergleichbarkeit zum Menschen aufweist. Darüber hinaus wurden niedrige Morbiditäts- und Aneurysma-Durchgängigkeitsraten erreicht. Das vorgeschlagene Riesenaneurysma-Modell bietet eine hervorragende Möglichkeit, neue endovaskuläre Geräte zu testen.

Einleitung

Die endovaskuläre Embolisation hat sich zu einer wichtigen Alternative zum Aneurysma-Clipping für die Behandlung von rupturierten zerebralen Aneurysmen entwickelt¹. Der Hauptnachteil dieser Behandlungsstrategie sind die hohen Aneurysma-Rekanalisationsraten mit verzögerter Aneurysma-Ruptur². Es hat sich gezeigt, dass große und riesige Aneurysmen besonders anfällig für diese Komplikationen sind. Daher werden ständig neue endovaskuläre Geräte entwickelt³. Modelle für experimentelle Studien sind für die Prüfung dieser Geräte unerlässlich ^4,5.

Menschliche zerebrale Aneurysmen wurden an Ratten, Kaninchen, Hunden und Schweinen untersucht ^6,7,8. Kaninchenmodelle haben jedoch die beste Vergleichbarkeit mit dem Menschen in Bezug auf die Hämodynamik und das Gerinnungssystem gezeigt 9,10,11,12. Im Modell der arteriellen Bifurkation des venösen Pouchs bei Kaninchen wird ein venöser Beutel in eine mikrochirurgisch hergestellte echte Bifurkation beider Arteria carotis communis (CCA) eingenäht, um ein Aneurysma zu imitieren¹³. Ein echtes Bifurkationsmodell für Riesenaneurysmen bei Kaninchen war jedoch bis vor kurzem nicht verfügbar. Die ersten Ergebnisse mit Hilfe von numerischer Strömungsmechanik und biomechanischen Tests wurden von unserer Gruppe im Jahr 2016 veröffentlicht¹⁴.

Da Riesenaneurysmen eine Herausforderung für die Behandlung beim Menschen darstellen und ein zuverlässiges Tiermodell für ihre Forschung von entscheidender Bedeutung ist, präsentieren wir eine komprimierte Zusammenfassung der verbesserten Techniken zur Herstellung von riesigen experimentellen Aneurysmen^12,13. Die Vorteile dieser Methode sind (i) die minimale Morbidität und die hohe Durchgängigkeit von Aneurysmen 14, die hohe Vergleichbarkeit mit dem Menschen in Bezug auf die Hämodynamik und das Gerinnungssystem 9,10,11,12 und die Kosteneffizienz im Vergleich zu Hundemethoden, (ii) das echte Bifurkationsdesign für ein Riesenaneurysma^13, (iii) die gute hämodynamische Vergleichbarkeit der erzeugten Aneurysmen, die durch Computational Fluid Dynamics gezeigt wird ¹⁴und (iv) die hohen Langzeitdurchgängigkeitsraten¹⁵.

Protokoll

Die Tierversuche wurden von der Tierethikkommission des Instituts, an dem diese Studie durchgeführt wurde, genehmigt. Für dieses Tiermodell wurden neuseeländische weiße Kaninchen (2,5-5,5 kg) verwendet.

HINWEIS: Unsere Standardtechnik zur Herstellung der venösen pouch-echten arteriellen Bifurkationsaneurysmen bei Kaninchen wurde 2011 veröffentlicht, und eine Adaption für Riesenaneurysmen wurde 2016 veröffentlicht^12,13. Wir fassen diese Techniken zusammen und beleuchten wesentliche Schritte zur Modifikation von Riesenaneurysmen.

1. Präoperative Phase

1. Verabreichen Sie Ketamin (30 mg/kg) und Xylazin (6 mg/kg) über perilumbale intramuskuläre Injektion zur Vollnarkose. Dann wird das Kaninchen intubiert (Schlauchdurchmesser: 4 mm, Länge: 18 mm; diese Größe kann je nach Größe des Tieres variieren) und mit der Gasanästhesie (2 % Isofluran) fortgesetzt. Überwachen Sie die Anästhesietiefe, indem Sie alle 15 Minuten die Zehen kneifen und bei Bedarf anpassen.
2. Rasieren Sie den Bereich vom Kieferwinkel bis zum Brustkorb mit einer Haarschneidemaschine. Desinfizieren Sie den Operationsbereich mit mindestens drei abwechselnden Runden Chlorhexidin- oder Povidon-Jod-Peeling, gefolgt von Alkohol. Decken Sie die Operationsstelle ab.

2. Chirurgische Phase I

1. Schneiden Sie die Haut entlang der Mittellinie vom Kieferwinkel bis zum Manubrium sterni mit einem Skalpell ein. Führen Sie eine stumpfe Dissektion in der Unterhaut durch.
2. Wechseln Sie zum Operationsmikroskop. Präparieren Sie ein 2-3 cm langes, astloses Segment der linken Vena jugularis externa. Tragen Sie wiederholt 4 % Papaverin tropfenweise auf die Gefäße auf, um Vasospasmus zu verhindern, und fügen Sie optional 5 mg/ml Neomycinsulfat tropfenweise zur Infektionskontrolle hinzu.
3. Entnahme des Venenabschnitts nach proximaler und distaler Ligatur mit 6-0 nicht resorbierbaren Nähten. Legen Sie das Venensegment in eine heparinisierte Kochsalzlösung (1.000 I. Heparin in 20 ml 0,9%iger Kochsalzlösung und 1 ml 4%iger Papaverin-HCl)¹³.

3. Chirurgische Phase II

1. Bereiten Sie beide CCAs vor, indem Sie sie von der Carotis-Bifurkation bis zu ihrem Ursprung sezieren. Achten Sie sorgfältig auf die medialen arteriellen Äste, die den Kehlkopf, die Luftröhre und die neuronalen Strukturen versorgen.
2. Verabreichen Sie 1.000 IE Heparin intravenös.
3. Bringen Sie einen temporalen mikrochirurgischen Clip am distalen Ende des rechten CCA an.
4. Ligatieren und schneiden Sie die rechte CCA proximal direkt über dem Truncus brachiocephalica mit Polyfilament 6-0 nicht resorbierbaren Nähten.
5. Verwenden Sie ein steriles Stück Gummi (z. B. von einem Handschuh) als Unterlage, um den Eingriff zu erleichtern. Entfernen Sie die Adventitia an der Anastomosenstelle beider Gefäße mit einer anatomischen Mikrozange und einer Mikroschere. Clipping der Anastomosenstelle des linken CCA distal und proximal¹³.

4. Chirurgische Phase III

1. Führen Sie eine Arteriotomie am linken CCA entsprechend der Größe der geplanten Anastomose mit dem rechten CCA und dem venösen Beutel durch. Bestimmen Sie die Länge der Arteriotomie anhand des Durchmessers der kontralateralen Halsschlagader (ca. 2 mm) zusammen mit der Größe des geplanten Aneurysmahalses.
   HINWEIS: Die Größe ist so flexibel wie die möglichen Aneurysmagrößen und Halsgrößen dieses universellen Aneurysmamodells. Die Mindestgröße sollte nicht kleiner als 3 mm sein und kann bis maximal ca. 15 mm betragen.
2. Reinigen Sie die Aneurysmastelle mit heparinisierter Kochsalzlösung (ca. 5 ml). Mit vier bis fünf nicht resorbierbaren 10-0-Monofilamentnähten und Vernähen des hinteren Umfangs des rechten CCA-Stumpfes mit der zuvor beschriebenen Arteriotomie des linken CCA.
3. Schneiden Sie den Stumpf des rechten CCA längs auf eine Länge von 1-1,5 cm ab. Anastomose des hinteren Teils des venösen Beutels mit der Arteriotomie des linken CCA mit 10-0 Nähten. Dann wird die Rückseite des Venenbeutels mit der Hinterwand des rechten CCA mit drei bis vier Nähten vernäht.
4. Naht die vordere Anastomose in der gleichen Reihenfolge.
5. Lassen Sie den temporalen Clip auf dem rechten CCA los. In der Regel ist die Anastomose undicht. Verwenden Sie dies, um Luft und Blutgerinnsel auszuwaschen.
6. Versiegeln Sie die Anastomose mit Fett aus dem Unterhautgewebe des chirurgischen Zugangs und Fibrinkleber.
7. Verschließen Sie die Faszie mit 4-0 nicht resorbierbaren Nähten. Führen Sie den Wundverschluss mit 4-0 resorbierbaren Nähten¹³ durch.

5. Postoperative Phase

1. 10 mg/kg Acetylsalicylsäure intravenös verabreichen.
2. Postoperative Analgesie durch ein transdermales Fentanylpflaster (12,5 μg/h) an der rasierten Region für 3 Tage^{erreichen 13}.
   HINWEIS: Konsultieren Sie den Tierarzt der Einrichtung über geeignete
   Analgesie-Optionen.
3. Erreichen Sie eine postoperative Antikoagulation durch die Verabreichung von 100 I.E./kg niedermolekularem Heparin täglich subkutan über einen Zeitraum von 2 Wochen.

Ergebnisse

Im Jahr 2011 veröffentlichten wir eine verbesserte Technik für das Modell der arteriellen Verzweigung des venösen Beutels zur Entstehung von Aneurysmen bei Kaninchen¹⁶. Die mittlere Aneurysmalänge betrug 7,9 mm und die mittlere Halsbreite 4,1 mm. Durch die Verwendung von unterbrochener Naht und aggressiver Antikoagulation konnten wir bei 14 von 16 Aneurysmen eine Mortalität und Durchgängigkeit von 0% erreichen. Diese Technik wurde dann für die Erzeugung von Riesenaneurysmen adaptiert, und im Jahr 2016 wurden numerische Strömungsmechanik und biomechanische Tests durchgeführt¹⁴. In dieser Studie wurde aufgrund der Verfügbarkeit eines erfahrenen Tierarztes auch das anästhetische Management von der Verwendung von Beatmungsmasken auf Intubation umgestellt. Dies stellt unserer Erfahrung nach einen kritischen Schritt dar, da die Intubation eines Kaninchens schwierig sein und zu hohen präoperativen Mortalitätsraten führen kann. Des Weiteren konnte die postoperative Antikoagulation mit niedermolekularem Heparin von 250 IE/kg auf 100 IE/kg reduziert werden. Mit diesem Regime konnten wir bei 11 von 12 Aneurysmen eine Mortalität und Durchgängigkeit von 0% erreichen. Die Aneurysmalängen betrugen 21,5-25,6 mm, die Halsbreiten 7,3-9,8 mm. Die detaillierten Ergebnisse dieser Studie sind in Tabelle 1 dargestellt. Des Weiteren wurden diese Aneurysmen für die Evaluierung endovaskulärer Geräte verwendet. Abbildung 1 zeigt ein Bild eines Stent-assistierten embolisierten Riesenaneurysmas nach der Aneurysma-Entnahme.

Abbildung 1: Foto eines Stent-assistierten embolisierten Riesenaneurysmas nach Aneurysma-Entnahme. 1 links CCA, Stent-Muttergefäße; 2 rechts CCA, Mutterschiff; + embolisierter Aneurysmasack. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Aneurysma-Nr.	Offenkundigkeit	Durchmesser der Mutterarterie [mm]	Länge [mm]	Halsbreite [mm]	Breite der Kuppel [mm]	Seitenverhältnis [-]
2	Nein	--	--	--	--	--
1	ja	2.4	23.4	7.7	9.9	3
3	ja	2.2	25.1	8.7	10.3	2.9
4	ja	2.5	23.5	9.8	10.6	2.4
5	ja	2.8	24.8	8.6	9.8	2.9
6	ja	2.5	21.5	9.8	9.3	2.2
7	ja	2.2	24.2	7.9	10.5	3.1
8	ja	2.3	25.6	9.3	10.2	2.8
9	ja	2.4	22.1	7.3	10	3
10	ja	2.2	25.6	8.9	9.7	2.9
11	ja	2.3	23.4	9.7	11.1	2.4

Tabelle 1: Aneurysma-Daten, die für numerische Strömungsmechanik und biomechanische Tests generiert wurden. Gezeigt werden die aktualisierten und detaillierten Ergebnisse von 11 Aneurysmen, die im Jahr 2016 entstanden sind. Diese Tabelle wurde von Sherif et ^al.14 modifiziert.

Diskussion

Es gibt einige kritische Schritte, um die Replizierbarkeit des oben beschriebenen Protokolls sicherzustellen. Die sorgfältige Entfernung des thrombogenen periadventitialen Gewebes an der Anastomosenstelle ist unerlässlich¹³. Man muss darauf achten, dass die Anastomose spannungsfrei ist und möglichst wenig Nähte hat. Bei Riesenaneurysmen ist es wichtig, mit der Rückseite der Anastomose zu beginnen. Dies ermöglicht eine bessere Sicht und Kontrolle für die schwierigsten Nähte im Vergleich zu den zuvor vorgeschlagenen Verfahren^17,18,19.

Im Gegensatz zu normal großen Aneurysmen ist der Schlüsselfaktor für die Entnahme des Venenbeutels die sorgfältige Präparation eines 2-3 cm langen Venenabschnitts. Es ist wichtig, alle kleinen Seitenäste der Vena jugularis externa zu präparieren, um sie sicher ligieren zu können. Beim Vernähen der Anastomosen sollte der direkte Kontakt mit den Gefäßen vermieden werden, indem die Enden der einzelnen Nähte etwas länger gelassen werden. Nur diese freien Nahtenden sollten mit der Zange gegriffen werden, um den Aneurysmakomplex zu bewegen. Dieses technische Detail hilft bei der Anwendung einer berührungslosen Technik mit den Gefäßen, die ein allgemeines Prinzip in der vaskulären Mikrochirurgie ist. Eine weitere Herausforderung im Vergleich zu normal großen Aneurysmen ist die durch den riesigen Aneurysmasack verursachte Sehstörung auf der Rückseite des Gefäßaneurysmakomplexes. Dies kann zu vermehrten technischen Schwierigkeiten auf der Rückseite der Anastomose führen. Nach Abschluss der Anastomose ist aufgrund der höheren Thrombusbildungswahrscheinlichkeit innerhalb des Riesenaneurysmasacks eine längere Spülzeit notwendig. Man sollte sich über Leckagen im Klaren sein, da diese sehr häufig sind. Wenn sie nicht mit dem Fettpolster verschlossen sind, sollten zusätzliche Nähte durchgeführt werden.

Eine Einschränkung ist die Verwendung eines extrakraniellen Aneurysmas als Modell für die intrakranielle Pathologie. Darüber hinaus sind für die erfolgreiche Umsetzung dieses Protokolls hohe mikrochirurgische Anforderungen und gut ausgestattete Labore erforderlich. Außerdem sind Kaninchen empfindliche Tiere, und eine gute Tierhaltung ist entscheidend für die Überlebenschancen.

Das vorgestellte Modell bietet mehrere Vorteile gegenüber den derzeit weit verbreiteten Modellen. Das derzeit am weitesten verbreitete Modell für zerebrale Aneurysmen ist das Elastase-Modell. Für dieses Modell wurde jedoch noch nie eine biomechanische Prüfung der Aneurysmawandeigenschaften durchgeführt. Daher ist die biomechanische Vergleichbarkeit dieses Modells mit menschlichen Bedingungen unklar. Im Gegenteil, diese biomechanischen Tests sind für unser vorgeschlagenes Modell verfügbar und zeigen eine gute Vergleichbarkeit mit menschlichen Bedingungen¹⁴. Ein weiterer signifikanter Vorteil dieses vorgeschlagenen Modells gegenüber dem Elastase-Modell ist die echte Bifurkationshämodynamik¹⁸. Dieses Modell entsteht in einer echten künstlich erzeugten Bifurkation, während der Elastase-verdaute Aneurysmasack am Ende der CCA gebildet wird, der mehr oder weniger eine Seitenwandgeometrie nachahmt.

Bis zu diesem Zeitpunkt gab es so gut wie keine anderen Riesenaneurysma-Modelle. Diese Modelle werden jedoch dringend für die Evaluierung neuer endovaskulärer Geräte benötigt. In der Literatur wurde nur ein Hundemodell für Riesenbifurkationsaneurysmen beschrieben²⁰. Die Hämodynamik des Hundes und das Gerinnungssystem zeigten jedoch signifikante Unterschiede im Vergleich zum Menschen, während das Kaninchenmodell seine Überlegenheit hinsichtlich seiner Vergleichbarkeit mit dem Menschen gezeigt hat¹⁴.

Neu entwickelte endovaskuläre Geräte zur Behandlung von Aneurysmen werden häufig in Kaninchenmodellen getestet. Unser zuvor veröffentlichtes Modell der Venenbeutel-Bifurkationsaneurysmen wurde für die CE- und FDA-Zulassung solcher Geräte verwendet ^3,18. Ein zuverlässiges und vergleichbares Tiermodell für Riesenaneurysmen bei Kaninchen gab es jedoch bis vor kurzem nicht. Beim Menschen weisen Riesenaneurysmen die höchsten Rekanalisationsraten und verzögerten Rupturen nach endovaskulärer Behandlung auf. Daher werden dringend neue endovaskuläre Geräte gesucht, und die Industrie hat den Bedarf an einem riesigen Aneurysma-Kaninchenmodell aufgeworfen. Eine weitere Anwendung ist die Beurteilung der Aneurysmawand mittels Hochfeld-Magnetresonanztomographie, die darauf abzielt, potentielle Risikofaktoren für eine Ruptur zu identifizieren, wie z.B. Aneurysmawanddurchmesser oder Kontrastverstärkungsverhalten²². Darüber hinaus sind Langzeitstudien erforderlich, um die Durchgängigkeit dieses Aneurysmamodells im Laufe der Zeit zu bewerten, sowie Studien, die das Aneurysmaverhalten mit Flow-Diverter-Stents und intrasakkulären Flow-Divertern zeigen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Saline			Any genericon
4% Papaverin HCl			Any genericon
Ethilon 10-0 monofil non resorbable sutures	Ethicon Inc	2814	Taper point needle
Evicel Bioglue	Ethicon Biosurgery Inc.	3901
Fentanyl dermal patch 12.5 μg/h			Any genericon
Heparin			Any genericon
Ketamin 50 mg/mL			Any genericon
Neomycin sulfate 5 mg/mL			Any genericon
Vicryl 4-0 polyfilament restorable sutures	Ethicon Inc	J386H
Xylazine 20 mg/mL			Any genericon