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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Aus dem Darm stammende mikrobielle Metaboliten haben vielfältige Wirkungen, die zu komplexem Verhalten bei Tieren führen. Unser Ziel ist es, eine Schritt-für-Schritt-Methode bereitzustellen, um die Auswirkungen von mikrobiellen Metaboliten aus dem Darm im Gehirn über die intrazerrebroventrikuläre Verabreichung über eine Führungskanüle zu beschreiben.

Zusammenfassung

Der Einfluss der Darmmikrobiota und ihrer Metaboliten auf die Physiologie und das Verhalten des Wirts wurde in diesem Jahrzehnt umfassend untersucht. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass Darmmikrobiota-abgeleitete Metaboliten hirnvermittelte physiologische Funktionen durch komplizierte Darm-Hirn-Bahnen im Wirt modulieren. Kurzkettige Fettsäuren (SCFAs) sind die wichtigsten bakteriellen Metaboliten, die während der Ballaststofffermentation durch das Darmmikrobiom produziert werden. Sekretierte SCFAs aus dem Darm können an mehreren Stellen in der Peripherie wirken und die Immun-, endokrinen und neuronalen Reaktionen aufgrund der großen Verteilung von SCFAs-Rezeptoren beeinflussen. Daher ist es schwierig, die zentralen und peripheren Wirkungen von SCFAs durch orale und intraperitoneale Verabreichung von SCFAs zu unterscheiden. Dieser Artikel stellt eine videobasierte Methode vor, um die funktionelle Rolle von SCFAs im Gehirn über eine Führungskanüle in frei beweglichen Mäusen zu hinterfragen. Die Menge und Art der SCFAs im Gehirn kann durch Kontrolle des Infusionsvolumens und der Infusionsrate eingestellt werden. Diese Methode kann Wissenschaftlern eine Möglichkeit bieten, die Rolle von Darmmetaboliten im Gehirn zu schätzen.

Einleitung

Der menschliche Magen-Darm-Trakt beherbergt verschiedene Mikroorganismen, die auf den Wirt 1,2,3 einwirken. Diese Darmbakterien können Darmmetaboliten während ihrer Verwendung von Nahrungsbestandteilen absondern, die vom Wirt verbrauchtwerden 4,5. Interessanterweise können die Darmmetaboliten, die nicht in der Peripherie metabolisiert werden, über den Kreislauf zu anderen Organen transportiertwerden 6. Bemerkenswert ist, dass diese sezernierten Metaboliten als Mediatoren für die Darm-Hirn-Achse dienen können, definiert als die bidirektionale Kommunikation zwischen dem zentralen Nervensystem und dem Darm7. Frühere Studien haben gezeigt, dass Darmmetaboliten komplexes Verhalten und Emotionen bei Tieren modulieren können 8,9,10,11.

Kurzkettige Fettsäuren (SCFAs) sind die Hauptmetaboliten, die von Darmmikrobiota während der Fermentation von Ballaststoffen und unverdaulichen Kohlenhydraten produziertwerden 6. Acetat, Propionat und Butyrat sind die häufigsten SCFAs im Darm12. SCFAs dienen als Energiequelle für Zellen im Magen-Darm-Trakt. Nicht metabolisierte SCFAs im Darm können durch die Pfortader zum Gehirn transportiert werden, wodurch Gehirn und Verhalten moduliertwerden 6,12. Frühere Studien haben gezeigt, dass SCFAs eine entscheidende Rolle bei neuropsychiatrischen Störungen spielen könnten 6,12. Zum Beispiel rettete die intraperitoneale Injektion von Butyrat in BTBR T + Itpr3tf / J (BTBR) Mäusen, einem Tiermodell der Autismus-Spektrum-Störung (ASD), ihre sozialen Defizite13. Mit Antibiotika behandelte Ratten, die Mikrobiota von depressiven Probanden erhielten, zeigten eine Zunahme von angstähnlichen Verhaltensweisen und fäkalen SCFAs14. Klinisch wurden Veränderungen der fäkalen SCFAs-Spiegel bei Menschen mit ASD im Vergleich zu typischerweise entwickelnden Kontrollen beobachtet15,16. Menschen mit Depressionen haben niedrigere fäkale SCFAs-Werte als gesunde Probanden17,18. Diese Studien deuteten darauf hin, dass SCFAs das Verhalten von Tieren und Menschen auf verschiedenen Wegen verändern können.

Mikrobielle Metaboliten üben vielfältige Wirkungen auf mehrere Stellen im Körper aus und beeinflussen die Physiologie und das Verhalten des Wirts 4,19, einschließlich des Magen-Darm-Trakts, des Vagusnervs und des Sympathikus. Es ist schwierig, die genaue Rolle von Darmmetaboliten im Gehirn zu bestimmen, wenn die Metaboliten über periphere Wege verabreicht werden. Dieser Artikel stellt ein videobasiertes Protokoll vor, um die Auswirkungen von Darmmetaboliten im Gehirn einer sich frei bewegenden Maus zu untersuchen (Abbildung 1). Wir haben gezeigt, dass SCFAs während Verhaltenstests akut durch die Führungskanüle verabreicht werden können. Die Art, das Volumen und die Infusionsrate der Metaboliten können je nach Zweck modifiziert werden. Der Ort der Kanülierung kann angepasst werden, um den Einfluss von Darmmetaboliten in einer bestimmten Gehirnregion zu untersuchen. Unser Ziel ist es, Wissenschaftlern eine Methode zur Verfügung zu stellen, um die möglichen Auswirkungen von mikrobiellen Metaboliten aus dem Darm auf das Gehirn und das Verhalten zu untersuchen.

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Protokoll

Alle Versuchsprotokolle und die Pflege der Tiere wurden vom National Cheng Kung University (NCKU) Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt.

1. Vorbereitung für das Versuchstier

  1. Besorgen Sie sich 6-8 Wochen alte männliche Wildtyp-Mäuse C57BL/6JNarl von einem Händler.
  2. Unterbringung der Mäuse in einem Standard-Mäusekäfig mit Standard-Mausfutter und sterilisiertem Wasser ad libitum.
    HINWEIS: Die Unterbringungsbedingungen für das Laboratory Animal Center der NCKU sind 22 ± 1 °C Temperatur, 55% ± 10% Luftfeuchtigkeit und ein 13 h / 11 h Hell-Dunkel-Zyklus.

2. Stereotaktische Chirurgie

  1. Bereiten Sie das stereotaktische Instrument, chirurgische Instrumente und verwandte Gegenstände vor und sterilisieren Sie es.
    HINWEIS: Alle Gegenstände, die direkt mit der Operationsstelle in Kontakt kommen, sollten sterilisiert werden, um eine Infektion zu vermeiden.
  2. Betäuben Sie die Maus, indem Sie sie in den Plexiglaskäfig mit 1% -5% Isofluran in Sauerstoff legen.
    HINWEIS: Beobachten Sie die Maus genau, um sicherzustellen, dass die Atemfrequenz bei etwa einem Atemzug pro Sekunde gehalten wird.
  3. Nehmen Sie die Maus aus der Anästhesiekammer. Rasieren Sie die Operationsstelle (Mauskopf) mit einem Haustiertrimmer. Setzen Sie die Maus auf den stereotaktischen Rahmen, indem Sie die Mausschneidezähne an der Schneideleiste im stereotaktischen Schneidezahnhalter befestigen. Bedecken Sie die Nase mit der Nasenkonusmaske.
  4. Betäuben Sie die Maus während der stereotaktischen Operation mit 1% -2,5% Isofluran in Sauerstoff. Beurteilen Sie die Nozizeption der Maus über den Zehenklemmreflex und stellen Sie eine konstante Atemfrequenz sicher, bevor Sie die Operationsstelle einschneiden.
  5. Legen Sie ein Heizkissen (37,0 °C) unter die Maus auf den stereotaktischen Rahmen, um die Körpertemperatur während der Operation aufrechtzuerhalten. Alternativ können Sie die Kerntemperatur mit Hilfe einer rektalen Wärmesonde halten, die den programmierten Wärmer und das Heizkissen verbindet.
  6. Entfernen Sie das beschnittene Fell am Kopf mit Klebeband. Injizieren Sie der Maus das Analgetikum Ketoprofen (5 mg/kg) subkutan, um Schmerzen zu lindern. Tragen Sie Augensalbe auf, um trockene Augen zu vermeiden.
  7. Führen Sie den spitzen Ohrbügel in den Gehörgang ein, um den Kopf zu fixieren.
  8. Zentrieren Sie den Kopf, indem Sie die Skala der Ohrleiste anpassen.
  9. Ziehen Sie die Nasenklemme am Schneidezahnhalter fest, um vertikale Bewegungen zu vermeiden. Drücken Sie den Kopf vorsichtig, um zu überprüfen, ob der Kopf fixiert ist, und vermeiden Sie, dass sich der Kopf während der nachfolgenden Operation lockert.
  10. Desinfizieren Sie die Kopfhaut mit drei abwechselnden Peelings Chlorhexidin mit einem Wattestäbchen. Beginnen Sie jedes Peeling von der Mitte zur Außenseite (vom am meisten desinfizierten zentralen Bereich zum am wenigsten desinfizierten Bereich).
    HINWEIS: Die Verwendung von Peelings von der Mitte nach außen könnte Wissenschaftlern helfen, Infektionen und Verunreinigungen durch das Fell zu minimieren. Der äußere Bereich liegt in der Nähe der unrasierten Kopfregion, die noch viel Fell hat und nicht leicht gründlich zu desinfizieren ist.
  11. Schneiden Sie die Kopfhaut anterior/posterior (<1 cm) mit einer chirurgischen Klinge. Öffnen Sie den Schnitt und wischen Sie den Schädel mit einem Wattestäbchen ab, das von einer Mikrosezierzange gehalten wird.
    HINWEIS: Die Mikrosezierzange, die chirurgische Klinge und die Wattestäbchen müssen vor der Operation autoklaviert werden. Während des chirurgischen Prozesses sterilisieren Sie alle chirurgischen Geräte mit einem Glasperlensterilisator (150 °C) für mindestens 5 s vor und nach jedem Tier. Bereiten Sie ein sterilisiertes Becherglas vor, um die chirurgische Klinge und die Pinzette während des chirurgischen Prozesses und zwischen den Tieren zu halten.
  12. Identifizieren Sie die Bregma und Lambda auf dem Schädel. Verwenden Sie die Bregma als Referenz, um die Region von Interesse zu lokalisieren.
    1. Optional: Montieren Sie den stereotaktischen Bohrer auf dem stereotaktischen Bohrerhalter und verwenden Sie die Spitze des Bohrers, um Bregma als Referenz zu zeigen. Sterilisieren Sie den stereotaktischen Bohrer mit dem Glasperlensterilisator (150 °C) für mindestens 5 s.
  13. Kalibrieren und richten Sie die flache horizontale Schädelebene in links/rechts und vorderen/hinteren Ebenen mit Bregma/Lambda aus.
    HINWEIS: Wenn sich die Maus nicht in einer korrekten horizontalen Ebene befindet, montieren Sie die Maus wieder auf dem stereotaktischen Instrument.

3. Kommerzielle kundenspezifische Führungskanülenimplantation

  1. Identifizieren und markieren Sie die Position des rechten lateralen Ventrikels basierend auf den stereotaktischen Koordinaten: Abstand zu Bregma, anterior/posterior (A/P): 0,26 mm, medial/lateral (M/L): -1,0 mm, dorsal/ventral (D/V): -2,0 mm 20.
    HINWEIS: Die Koordinaten können basierend auf der interessierenden Region geändert werden. Die Koordinaten für den lateralen Ventrikel basierten auf erwachsenen C57BL/6J-Mäusen mit einem Gewichtsbereich von 26-30 g. Wenn jüngere Mäuse verwendet werden, lesen Sie die Diskussion.
  2. Bohren Sie ein Loch (Durchmesser = 1,5 mm) durch den Schädel an der markierten Stelle mit einem stereotaktischen Bohrer zur Implantation einer handelsüblichen Führungskanüle.
  3. Bohren Sie zwei bis vier weitere Löcher (Durchmesser = 1,5 mm) mit einem stereotaktischen Bohrer zur Befestigung von Edelstahlschrauben auf den Schädel.
    HINWEIS: Sterilisieren Sie den stereotaktischen Bohrer mit einem Glasperlensterilisator (150 °C) für mindestens 5 s vor und nach jedem Tier.
  4. Wischen Sie die Knochenreste ab und stoppen Sie die Blutung mit einem Wattestäbchen.
  5. Wischen Sie den Schädel mit Lidocain (1 mg / kg) mit einem Wattestäbchen ab, um eine lokalanästhetische, juckreizstillende und schmerzlindernde Wirkung zu erzielen. Wenn die Blutung nach dem Bohren nicht aufhört, legen Sie vorsichtig ein Wattestäbchen auf das Loch für die Hämostase.
  6. Montieren Sie zwei bis vier rostfreie Schrauben an den Löchern, um Anker für Dentalacryl bereitzustellen.
  7. Legen Sie die handelsübliche Führungskanüle auf den stereotaktischen Kanülenhalter und desinfizieren Sie sie mit dem Glasperlensterilisator (150 °C).
    HINWEIS: Die handelsübliche Führungskanüle, der handelsübliche Dummy und der kommerzielle Injektor (Abbildung 2A) wurden mit den Spezifikationen in der Materialtabelle angepasst.
  8. Bewegen Sie den stereotaktischen Kanülenhalter in das für den Seitenventrikel gebohrte Loch und führen Sie die handelsübliche Führungskanüle langsam in das Loch ein, bis die gewünschte Tiefe (2,5 mm) erreicht ist.
    HINWEIS: Die dorsale/ventrale Koordinate kann definiert werden, indem die Spitze der handelsüblichen Führungskanüle als Referenz festgelegt wird, wenn die Spitze kaum in das Loch eingeführt wird.
  9. Tragen Sie 10 μL n-Butylcyanacrylatkleber (Gewebekleber) auf, um die handelsübliche Führungskanüle im Bohrloch zu fixieren, und warten Sie 3-4 min. Lösen Sie die handelsübliche Führungskanüle vorsichtig vom stereotaktischen Kanülenhalter und entfernen Sie den Halter.
  10. Tragen Sie das Zahnacryl auf die eingeschnittene Kopfhaut auf, um die handelsübliche Führungskanüle zu fixieren, und warten Sie mindestens 5 Minuten. Implantieren Sie den handelsüblichen Dummy in die handelsübliche Führungskanüle, um ein Verstopfen der Kanüle durch Blut oder Körperflüssigkeit zu vermeiden (Abbildung 2B).
  11. Lösen Sie den Ohrbügel vom Gehörgang und entfernen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen.
  12. Setzen Sie die Maus in einen neuen Käfig mit einem Heizkissen darunter, um sich von der Anästhesie zu erholen, und beobachten Sie kontinuierlich, bis die Maus vollständig erwacht.
    HINWEIS: Lassen Sie das Tier nicht unbeaufsichtigt, bis es wieder ausreichend Bewusstsein erlangt hat, um das sternale Liegen aufrechtzuerhalten. Ein Tier, das operiert wurde, sollte nicht in die Gesellschaft anderer Tiere zurückkehren, bis es vollständig genesen ist.
  13. Setzen Sie die Maus je nach institutionellem IACUC-Protokoll und Versuchsaufbau wieder in ein Einzelgehäuse oder ein Gruppengehäuse ein. Stellen Sie bei Gruppenunterkünften sicher, dass weniger Mäuse in einem Käfig untergebracht sind, um unerwünschte Verletzungen oder das Ablösen der Kanüle zu minimieren.
  14. Verabreichen Sie Ibuprofen (0,2 mg / ml) im Trinkwasser für mindestens 3 Tage zur postoperativen Behandlung und überwachen Sie zweimal täglich auf Anzeichen von Schmerzen und Stress für mindestens 3 Tage.
    1. Während der postoperativen Pflege tragen Sie Roxithromycin-Salbe um die Haut auf, um Entzündungen und Infektionen bei den Mäusen zu verhindern.
    2. Überwachen Sie den Zustand des Tieres und geben Sie rechtzeitig eine intraperitoneale Injektion von 5% Glukose und / oder 0,9% Natriumchlorid, um genügend Energie bereitzustellen.
    3. Wenn sich der Zustand von Schmerzen, Stress oder Infektion stetig verschlechtert, euthanasieren Sie die Maus durch CO2 -Inhalation.
  15. Warten Sie 1 Woche nach der Operation, bis die Maus für die intrazerrebroventrikuläre Verabreichung von SCFAs und Verhaltenstests bereit ist.

4. Vorbereitung der SCFAs

  1. Natriumacetat, Natriumbutyrat und Natriumpropionat werden in künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) gelöst (siehe Materialtabelle).
  2. Stellen Sie sicher, dass die Chemikalien vollständig aufgelöst sind, stellen Sie dann den pH-Wert auf 7,4 ein und filtern Sie die SCFAs-Mischung durch einen 0,22-μm-Filter für die Sterilisation.

5. Einrichtung des Infusionssystems für die intrazerrebroventrikuläre Verabreichung von SCFAs während der Verhaltenstests

  1. Montieren Sie eine Deckenkamera, um das Verhalten aufzuzeichnen. Schließen Sie die Kamera an einen Computer an, um die Videoaufzeichnungssoftware zu steuern (Abbildung 3).
  2. Füllen Sie eine 10-μL-Spritze mit destilliertem Wasser.
    HINWEIS: Vermeiden Sie Luftblasen in der Mikroliterspritze.
  3. Verbinden Sie eine Mikroinjektionspumpe mit der Mikroinjektionssteuerung.
  4. Montieren Sie die Mikroliterspritze an der Mikroinjektionspumpe. Um die Spritze zu installieren, drücken Sie den Knopf, um die Klemme zu lösen und die Spritze an der entsprechenden Position zu installieren. Schließen Sie die Klemme, und ziehen Sie die Kolbenhalteschraube an der Mikroinjektionspumpe fest (Abbildung 4A).
  5. Führen Sie den handelsüblichen Injektor in das Polyethylenrohr ein (Abbildung 2A).
  6. Hängen Sie das Polyethylenrohr an die Deckenkamera über der Testarena.
  7. Füllen Sie das Polyethylenröhrchen mit destilliertem Wasser mit einer Insulinspritze. Verbinden Sie die Mikroliterspritze mit dem hängenden Polyethylenschlauch.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Polyethylenschlauch lang genug ist, damit sich die Maus im Testbereich frei bewegen kann.

6. Systemeinstellungen der Mikroinjektionssteuerung

  1. Schalten Sie den Microinjection-Controller ein, und drücken Sie Display All Channels (Alle Kanäle anzeigen), um auf den Bildschirm Command (Command) zuzugreifen (Abbildung 4C). Drücken Sie Configuration (Konfiguration) und stellen Sie Volume Target auf 9.800 nL mit einer Lieferrate auf 100 nL/s ein. Gießen Sie 9.800 nL destilliertes Wasser aus dem Polyethylenröhrchen, das mit der Mikroliterspritze verbunden ist (drücken Sie Direction, um in den Infuse-Modus zu wechseln, und drücken Sie RUN) (siehe rote Quadrate im Befehlsbildschirm von Abbildung 4C).
  2. Drücken Sie Configuration (Konfiguration ) und stellen Sie Volume Target auf 3.000 nL mit einer Lieferrate auf 100 nL/s ein. Entnehmen Sie 3.000 nL Mineralöl ( drücken Sie Direction , um in den Auszahlungsmodus zu wechseln, und drücken Sie RUN) (siehe rote Quadrate im Befehlsbildschirm in Abbildung 4C).
    HINWEIS: Am Polyethylenrohr sollte eine klare Öl-Wasser-Phasentrennung eingehalten werden.
  3. Zerlegen Sie den Polyethylenschlauch von der Mikroliter-Spritzennadel. Spucken Sie 3.000 nL destilliertes Wasser aus der Mikroliter-Spritzennadel aus (drücken Sie Direction, um in den Infuse-Modus zu wechseln, und drücken Sie RUN).
  4. Führen Sie die Mikroliterspritze wieder in das Polyethylenröhrchen ein. Drücken Sie Konfiguration und stellen Sie Volume Target auf 9.500 nL mit einer Lieferrate auf 100 nL/s ein. Ziehen Sie 9.500 nL SCFAs ab (drücken Sie Direction, um in den Auszahlungsmodus zu wechseln, und drücken Sie RUN). Beschriften Sie die Öl-SCFAs-Phase, um zu validieren, ob die SCFAs erfolgreich infundiert wurden.
  5. Drücken Sie Konfiguration und stellen Sie das gewünschte Volumenziel mit Lieferrate auf 7 nL/s ein. Drücken Sie Direction, um in den Infuse-Modus zu wechseln (siehe rote Quadrate im Befehlsbildschirm von Abbildung 4C).
    HINWEIS: Bestimmen Sie das Volumen basierend auf der Infusionszeit. Wenn beispielsweise die Infusionszeit 3 min für die Verabreichungsrate von 7 nL / s beträgt, Zielvolumen = 1.260 nL.
  6. Drücken Sie RUN , um die Mikroliterspritze nach vorne zu infundieren, bis die Flüssigkeit am vorderen Ende des handelsüblichen Injektors austritt, bevor Sie den Injektor in die Kanüle für die SCFA-Injektion einführen.

7. Infusion von SCFAs in den lateralen Ventrikel durch die kommerzielle Führungskanüle in einer frei beweglichen Maus

  1. Betäuben Sie die Maus, indem Sie sie in den Plexiglaskäfig mit 1% -5% Isofluran in Sauerstoff legen.
    HINWEIS: Beobachten Sie die Maus genau, um sicherzustellen, dass die Atemfrequenz bei etwa einem Atemzug pro Sekunde gehalten wird.
  2. Rufen Sie die Maus und führen Sie den handelsüblichen Injektor in die handelsübliche Führungskanüle ein (Abbildung 4B).
    HINWEIS: Wenn die handelsübliche Führungskanüle durch Blut oder Körperflüssigkeit verstopft ist, lösen Sie sie vorsichtig mit einer Pinzette.
  3. Lassen Sie die Maus vor dem Verhaltenstest 15 Minuten lang in einem Käfig von der Anästhesie erholen.
  4. Für den grundlegenden Fortbewegungstest setzen Sie die Maus in einen neuartigen Käfig und lassen Sie sie 35 Minuten lang frei erkunden. Infusion von SCFAs mit einer Verabreichungsrate von 7 nL/s für ein Zielvolumen von 2.100 nL in den ersten 5 Minuten (drücken Sie Richtung in den Infusionsmodus und drücken Sie RUN).
    HINWEIS: Die Fortbewegung im neuartigen Käfig kann mit der Video-Tracking-Software21,22 für das Verhalten von Tieren analysiert werden.
  5. Betäuben Sie die Maus (wiederholen Sie Schritt 7.1) und entfernen Sie den handelsüblichen Injektor aus der handelsüblichen Führungskanüle.
    HINWEIS: Der Maus können wiederholt verschiedene Kontrollen/Metaboliten injiziert werden, nachdem die entsprechende Zeit zum Auswaschen der vorherigen Injektion gegeben wurde. Solange die Kanüle am Mauskopf befestigt ist, kann die Maus wiederholt mit verschiedenen Metaboliten getestet werden.

8. Wiederherstellung des Mikroinjektionssystems

  1. Zerlegen Sie den Polyethylenschlauch aus der Mikroliterspritze.
  2. Injizieren Sie Luft in das Röhrchen mit der Insulinspritze, um das destillierte Wasser im Polyethylenschlauch zu verwerfen. Entleeren Sie die Mikroliterspritze.
  3. Drücken Sie Reset Pos (Pos zurücksetzen ) im Bildschirm Configuration (Konfiguration ), um den Bildschirm Spritzenstoppdefinition zu öffnen (Abbildung 4C).
  4. Drücken Sie Zurückziehen, bis ein Signalton ertönt, um die Mikroinjektionspumpe in die vollständig zurückgezogene Position zurückzusetzen (Abbildung 4C).
  5. Kehren Sie zum Bildschirm Command (Command) zurück, und schalten Sie den Mikroinjektionscontroller aus, wenn auf diesem Bildschirm das Zeichen **END REACH** angezeigt wird (Abbildung 4C).

9. Optional: Validierung der intrazerebroventrikulären Injektion mittels neuralem Tracer

  1. Infusion von 2.100 nL des neuralen Tracers mit der Verabreichungsrate von 7 nL / s , um die Infusionsstelle zu überprüfen.
    HINWEIS: Lassen Sie den Injektor 5 Minuten in der Führungskanüle, um einen Rückfluss zu verhindern.
  2. Anästhesieren Sie die Maus durch eine Überdosierung von Isofluran (5%) 30 min nach der Infusion von neuralem Tracer.
  3. Überprüfen Sie die Atemfrequenz und den Schwanz-/Pfotenklemmreflex bei der betäubten Maus.
    HINWEIS: Mäuse müssen vor dem nächsten Schritt nicht reagieren.
  4. Machen Sie einen 4-5 cm langen Schnitt durch die Haut, den Muskel und die Bauchdecke unterhalb des Brustkorbs.
  5. Bewegen Sie die Leber vorsichtig vom Zwerchfell weg.
  6. Schneiden Sie das Zwerchfell ein, um das Herz der Maus freizulegen.
  7. Durchbluten Sie die Maus durch das Herz mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und eiskaltem 4% Paraformaldehyd in PBS.
  8. Enthaupten Sie die Maus und sezieren Sie das Gehirn vorsichtig mit einer Mikrosezierzange und einer Mikrosezierschere, um das gesamte Gehirn herauszunehmen23. Die Hirnproben für 3-4 Tage in eiskaltem 4% Paraformaldehyd in PBS legen und 3 x 5 min mit PBS waschen.
  9. Schneiden Sie das Gehirn im Gehirnschnitthalter der Maus beim achten Schnitt des Maushirnscheibenhalters (1 mm/Abschnitt) von der vorderen in die hintere Richtung in zwei Teile. Legen Sie das Gehirn in die Einbettungsform und betten Sie die Gehirnproben in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt ein (4% in PBS).
  10. Kleben Sie das in Agarose eingebettete Gehirn mit Sekundenkleber auf die Bühne des Vibratoms. Schneiden Sie das Gehirn koronal in 50 μm Gehirnschnitte mit dem Vibratom.
  11. Inkubieren Sie die Gehirnschnitte in dem Antikörper, der auf den neuralen Tracer abzielt, der in Blockierpuffer (1:1.000 Verdünnung) verdünnt ist, über Nacht bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Der Blockierpuffer enthielt 10% Pferdeserum, 0,1% Triton X-100 und 0,02% Natriumazid.
  12. Die Scheiben 3 x 5 min mit PBST (PBS mit 0,1% Triton X-100) waschen.
  13. Inkubieren Sie die Gehirnschnitte in fluoreszenzfarbstoffkonjugierten sekundären Antikörpern, verdünnt in Blockierpuffer (1:500 Verdünnung) für 2 h bei Raumtemperatur.
  14. Die Scheiben 3 x 5 min mit PBS waschen.
  15. Montieren Sie die Hirnschnitte auf dem Objektträger mit einem Montagemedium, das 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) enthält.
  16. Decken Sie den Objektträger mit einem mikroskopischen Deckglas ab.
  17. Tragen Sie Nagellack auf die Objektträgerkante auf, um ein Auslaufen des Montagemediums zu vermeiden.
  18. Nach nächtlicher Inkubation bei Raumtemperatur, geschützt vor Licht, das Fluoreszenzsignal an der Infusionsstelle mit einem Fluoreszenzmikroskop abbilden.

10. Optional: Infusion von Metaboliten durch eine maßgeschneiderte Edelstahl-Führungskanüle in der lateralen Herzkammer bei Mäusen

  1. Befolgen Sie die Protokollabschnitte 1-8 und ersetzen Sie die handelsübliche Führungskanüle durch eine Führungskanüle aus Edelstahl, um Chemikalien durch einen Edelstahlinjektor in der Maus zu infundieren.
    HINWEIS: Die Vor- und Nachteile der verschiedenen kommerziellen und Edelstahlkanülen werden im Diskussionsabschnitt erläutert.
  2. Führen Sie das chirurgische Protokoll auf die in den Protokollabschnitten 2 und 3 beschriebene Weise durch, denken Sie jedoch daran, die handelsübliche Führungskanüle durch eine Führungskanüle aus Edelstahl zu ersetzen (Abbildung 5B).
    HINWEIS: Die Führungskanüle aus Edelstahl, der Edelstahl-Dummy und der Edelstahl-Injektor (Abbildung 5A) wurden mit den Spezifikationen in der Materialtabelle angepasst. Führen Sie die maßgeschneiderte Führungskanüle aus Edelstahl bis zur gewünschten Tiefe (2,0 mm) in das Loch ein.
  3. Infusion von SCFAs über die Führungskanüle aus Edelstahl mit dem Mikroinjektionssystem, bestehend aus Mikroinjektionscontroller und Mikroinjektionspumpe (Abbildung 4B) (identisch mit den Protokollabschnitten 4-7). Für den Edelstahl-Dummy der Edelstahl-Führungskanüle biegen Sie eine Seite des Edelstahl-Injektors vorsichtig, bis die Spitze der anderen Seite 1 mm länger ist als die Edelstahl-Führungskanüle.
  4. Infektion 2.100 nL des neuralen Tracers durch die Edelstahl-Führungskanüle in den lateralen Ventrikel bei Mäusen (wie Protokollabschnitt 9).
  5. Entnehmen Sie die Probe für 30 Minuten nach der neuralen Tracerinfusion (wie Protokollabschnitt 9).
  6. Führen Sie die Bildaufnahme in den mit neuronalen Tracern infundierten Hirnschnitten durch (identisch mit Protokollabschnitt 9).

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Ergebnisse

Die Maus wurde 1 Woche nach der Erholung von der Implantation der Führungskanüle mit SCFAs infundiert, um die Bewegungsaktivität in einem neuartigen Käfig zu bewerten. Die Maus wurde in einen neuartigen Käfig gesetzt und in den ersten 5 Minuten mit 2.100 nL SCFAs oder ACSF (Lieferrate von 7 nL / s) in das Gehirn durch die kommerzielle Führungskanüle infundiert, die in den lateralen Ventrikel des Gehirns implantiert wurde. Die Bewegungsaktivität in einem neuartigen Käfig wurde für weitere 30 Minuten nach der Inf...

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Diskussion

Darm-abgeleitete Metaboliten wurden ohne großen präzisen Mechanismus mit hirnvermittelten Erkrankungen in Verbindung gebracht, teilweise aufgrund ihrer multiplen Bindungsstellen im Körper 6,12,24. Frühere Berichte deuteten darauf hin, dass SCFAs als Liganden für G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, epigenetische Regulatoren und Quellen für die Energieproduktion an mehreren Stellen im Körper dienen könnten

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit dieser Arbeit.

Danksagungen

Wir danken den Mitarbeitern des Laboratory Animal Center der National Cheng Kung University (NCKU) für die Pflege der Tiere. Diese Arbeit wurde durch das Stipendium des Prof. Kun-Yen Huang Education Fund der CHENG-HSING Medical Foundation an C.-W.L. unterstützt; die Mittel des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie (MOST) in Taiwan: (Undergraduate Research MOST 109-2813-C-006-095-B) an T.-H.Y.; (MOST 107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3) bis W.-L.W.; und das Higher Education Sprout Project, Ministry of Education to the Headquarters of University Advancement at NCKU to W.-L.W.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Material
Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofen A2:D41Pfizern/a
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbitThermoFisher ScientificA-21206
Anti-Fluorescent Gold (rabbit polyclonal)MilliporeAB153-I
Bottle Top Vacuum Filter, 500 mL, 0.22 μm, PES, SterileNEST121921LA01
CaCl2 Sigma-AldrichC1016ACSF: 0.14 g/L
Chlorhexidine scrub 2%PhoenixNDC 57319-611-09
Chlorhexidine solutionPhoenixNDC 57319-599-09
Commercial dummyRWD Life Science62004Single_OD 0.20 mm/ M3.5/G = 0.5 mm
Commercial guide cannulRWD Life Science62104Single_OD 0.41 mm-27G/ M3.5/C = 2.5 mm 
Commercial injectorRWD Life Science62204Single_OD 0.21 mm-33G/ Mates with M3.5/C = 3.5 mm/G = 0.5 mm
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270ACSF: 0.61 g/L
Dental acrylicHYGENICn/a
Fixing screwsRWD Life Science62521
Fluoroshield mounting medium with DAPIAbcamAB104139
Horse serumThermoFisher Scientific16050130
Insulin syringesBBraunXG-LBB-9151133S-1BX1 mL
Isoflurane Panion & BF biotechDG-4900-250D
KCl Sigma-AldrichP3911ACSF: 0.19 g/L
Ketoprofen Swiss Pharmaceuticaln/a
Lidocaine AstraZenecan/a
Low melting point agaroseInvitrogen16520
MgCl2 Sigma-AldrichM8266ACSF: 0.19 g/L
Microscope cover slipsMARIENFELD101242
Microscope slidesThermoFisher Scientific4951PLUS-001E
Mineral oil light, white NFMacron Fine ChemicalsMA-6358-04
NaCl Sigma-AldrichS9888ACSF: 7.46 g/L
NaH2PO4 Sigma-AldrichS8282ACSF: 0.18 g/L
NaHCO3 Sigma-AldrichS5761ACSF: 1.76 g/L
n-butyl cyanoacrylate adhesive (tissue adhesive glue)3M1469SB3M Vetbond
Neural tracer Santa CruzSC-358883FluoroGold
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
Polyethylene tubeRWD Life Science62329OD 1.50, I.D 0.50 mm and OD 1.09, I.D 0.38 mm
Puralube Vet (eye) OintmentDechra 12920060
Sodium acetate Sigma-AldrichS2889SCFAs: 13.5 mM
Sodium azide Sigma-AldrichS2002
Sodium butyrate Sigma-AldrichB5887SCFAs: 8 mM
Sodium propionate Sigma-AldrichP1880SCFAs: 5.18 mM
Stainless guide cannulaChun Ta stainless steel enterprise CO., LTD.n/aOD 0.63 mm; Local vendor
Stainless injectorChun Ta stainless steel enterprise CO., LTD.n/aOD 0.3 mm; dummy is made from injector; local vendor
SuperglueKrazy GlueKG94548R
Triton X-100Merck1.08603.1000
Equipment
Cannula holderRWD Life ScienceB485-68217
Ceiling cameraFOSCAMR2
Digital stereotaxic instrumentsStoelting51730D
Dissecting microscopeINNOVIEWSEM-HT/TW
Glass Bead SterilizerRWD Life ScienceRS1501
Heating padStoelting53800M
Leica microscope LeicaDM2500
Micro Dissecting ForcepsROBOZRS-5136Serrated, Slight Curve; Extra Delicate; 0.5mm Tip Width; 4" Length 
Micro Dissecting ScissorsROBOZRS-59184.5" Angled Sharp
Microinjection controllerWorld Precision Instruments (WPI)MICRO2TSMARTouch Controller
Microinjection syringe pumpWorld Precision Instruments (WPI)UMP3T-1UltraMicroPump3  
Microliter syringeHamilton8001410 µL
Optical Fiber Cold Light with double FiberStepLGY-150Local vendor
Pet trimmerWAHL09962-2018
Vaporiser for IsofluraneStepAS-01Local vendor
VibratomeLeicaVT1000S
Software
Animal behavior video tracking softwareNoldusEthoVisionVersion: 15.0.1416
Leica Application Suite X softwareLeicaLASXVersion: 3.7.2.22383

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