Ein experimentelles Modell des Myokardinfarkts zur Untersuchung der Herzreparatur und des Umbaus bei Knockout-Mäusen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein experimentelles Modell des Myokardinfarkts, ein Echokardiographie-Verfahren zur Untersuchung des Umbaus und der Funktion des Herzens und Verfahren zur Quantifizierung von Fibrose und Hypertrophie in Picrosirius-Rot- und Rhodamin-gefärbten Schnitten sowie die Infarktgröße und den Expansionsindex in Schnitten, die mit Masson-Trichrom gefärbt wurden.

Zusammenfassung

Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind die häufigste Todesursache in den westlichen Ländern, wobei der akute Myokardinfarkt (MI) die häufigste Form ist. In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur Untersuchung der Rolle von Galectin 3 (Gal-3) in der zeitlichen Evolution der kardialen Heilung und des Umbaus in einem experimentellen Tiermodell des Myokardinfarkts beschrieben.

Zu den beschriebenen Verfahren gehören ein experimentelles Modell des MI mit einer permanenten Koronarligatur bei männlichen C57BL/6J- (Kontrolle) und Gal-3-Knockout-Mäusen (KO), ein Echokardiographie-Verfahren zur Untersuchung des kardialen Umbaus und der systolischen Funktion in vivo, eine histologische Bewertung der interstitiellen Myokardfibrose mit Picrosirius-Rot-gefärbten und Rhodamin-konjugierten Lektin-gefärbten Schnitten zur Untersuchung der Myozytenhypertrophie durch die Querschnittsfläche (MCSA), und die Quantifizierung der Infarktgröße und des kardialen Umbaus (Narbenverdünnung, Septumdicke und Expansionsindex) durch Planimetrie in Schnitten, die mit Massons Trichrom und Triphenyltetrazoliumchlorid gefärbt wurden. Gal-3 KO-Mäuse mit MI zeigten einen gestörten kardialen Umbau und einen Anstieg des Narbenausdünnungsverhältnisses und des Expansionsindex. Zu Beginn des Myokardinfarkts waren auch die Myokardfunktion und der kardiale Umbau stark beeinträchtigt. 4 Wochen nach dem Myokardinfarkt war auch die natürliche Entwicklung der Fibrose bei infarzierten Gal-3-KO-Mäusen betroffen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das experimentelle Modell des MI ein geeignetes Modell ist, um die zeitliche Evolution der Herzreparatur und des Umbaus bei Mäusen mit der genetischen Deletion von Gal-3 und anderen Tiermodellen zu untersuchen. Der Mangel an Gal-3 beeinflusst die Dynamik der Herzreparatur und stört die Evolution des kardialen Umbaus und der Funktion nach MI.

Einleitung

Der Myokardinfarkt (MI) ist die häufigste Form von Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Nach dem Myokardinfarkt erfährt das Myokard serielle morphologische und funktionelle Veränderungen, einschließlich der Heilung der MI-Infarktzone, des ventrikulären Umbaus (VR) und der myokardialen Dysfunktion¹. Die Heilung des Myokardinfarkts ist ein dynamischer und gut orchestrierter Prozess, der mit einer tiefgreifenden entzündlichen Infiltration einhergeht, die in der Bildung einer fibrotischen Narbe endet ^2,3. Das experimentelle Modell des Myokardinfarkts bei Mäusen wird derzeit zur Untersuchung des kardialen Umbaus unter pathologischen Bedingungen verwendet ^4,5, und die Kenntnis des genauen chirurgischen Protokolls ist unerlässlich, um ein reproduzierbares und effektives Verfahren zur Induktion einer permanenten Koronarligatur zu entwickeln. Diese Methode wird benötigt, um die Heilung des Myokardinfarkts und seine Bedeutung für die zeitliche Entwicklung des linksventrikulären Umbaus (LVR) und der mit dem Myokardinfarkt verbundenen kardialen Dysfunktion zu untersuchen.

Galektine sind eine Gruppe von Lektinen, die spezifische Kohlenhydrate in intrazellulären Liganden, Membranrezeptoren und extrazellulären Glykoproteinen erkennen. Galectin 3 (Gal-3) ist ein Mitglied dieser Familie, das durch die Erkennung und Vernetzung von N- und O-Glykanen in Glykokonjugaten auf der Zelloberfläche wirkt und im Immunsystem weit verbreitet ist⁶. Frühere Studien haben die Rolle von Gal-3 als Regulator von Entzündungen und Fibrose bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen untersucht 7,8,9,10,11,12. Da die Ausrichtung auf die regulatorischen Faktoren der Entzündung während der Heilung von großer Bedeutung ist, da Entzündungen die Evolution des Umbaus erheblich beeinflussen können, wollten wir ein Protokoll zur Untersuchung der zeitlichen Evolution des ventrikulären Umbaus nach dem Myokardinfarkt sowie die Schritte und Methoden zur Bestimmung beschreiben, wie die genetische Mutation von Gal-3 die zeitliche Evolution der Heilung bei Myokardinfarkt modifiziert und den kardialen Umbau und die Funktion bei Mäusen beeinflusst.

Protokoll

HINWEIS: Alle in diesem Protokoll beschriebenen Versuche wurden vom Ausschuss für Tierpflege und Forschung der Universität Buenos Aires (CICUAL) in Übereinstimmung mit dem Ausschuss des Nationalen Forschungsrats (USA) für die Aktualisierung des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren¹³ genehmigt. Verwenden Sie für die Experimente männliche, altersgleiche C57BL/6J- und Gal-3 KO-Mäuse (8-10 Wochen alt) mit einem Gewicht von 30-35 g, die eine bessere Manipulation für die Operation ermöglichen. Ermöglichen Sie den Tieren den Zugang zu Wasser und Futter ad libitum. Die Gal-3 KO Mäuse wurden auf einem C57BL/6J Hintergrund in den gleichen Bioressourcenanlagen gezüchtet wie die Kontrollmäuse C57BL/6J.

1. Operationsgebiet und Instrumente

1. Vergewissern Sie sich vor Beginn der Operation, dass das Beatmungsgerät an eine Stromquelle angeschlossen ist und ordnungsgemäß funktioniert. Vergewissern Sie sich, dass genügend Anästhesielösung vorhanden ist. Bereiten Sie die Lösung am Tag der Operation vor, indem Sie die Anzahl der zu verwendenden Tiere berechnen.
2. Vergewissern Sie sich, dass alle chirurgischen Instrumente sterilisiert sind, einschließlich Edelstahlscheren, Mikroscheren, Nadelhalter für große und kleine Nadeln, Retraktoren, extra scharfe, gebogene Pinzetten, gezackte Pinzetten und Gewebezangen. Reinigen Sie den Arbeitsbereich mit 70% Ethanol.
3. Stellen Sie sicher, dass kleine Wattebällchen, Ysops und Gaze zur sofortigen Verätzung möglicher Blutungen zur Verfügung stehen.
4. Halten Sie 10-0 bis 7-0 silikonbeschichtete, geflochtene Seidennähte für die Ligatur der linken absteigenden Koronararterie (LDA), Nylonnaht für den Thoraxverschluss und Leinenfaden zum Verschluss der Haut bereit.

2. Anästhesie und Intubation

1. Wiegen Sie die Mäuse, um die Dosis der Anästhesie zu bestimmen.
2. Ein Heizkissen, das von einer Styroporbasis umgeben ist, auf 40 °C vorwärmen.
3. Anästhesieren Sie die Mäuse mit intramuskulärer Verabreichung von 0,1 ml/10 g Körpergewicht einer Lösung, die Ketamin (65 mg/kg), Xylazin (13 mg/kg) und Acepromazin (1,5 mg/kg) enthält.
4. Sobald die Maus betäubt ist und bevor Sie mit dem chirurgischen Eingriff beginnen, überprüfen Sie die Narkosetiefe, indem Sie einen leicht schmerzhaften Reiz auslösen, z. B. durch Drücken der Füße mit den Fingern. Wenn das Tier auf den Reiz reagiert, passen Sie die Narkosetiefe an.
5. Platzieren Sie die Maus in den dorsalen Dekubitus, kleben Sie ihre Beine an die Arbeitsbasis über dem Heizkissen und legen Sie sie unter ein binokulares Stereomikroskop. Überdehnen Sie den Hals mit einem Faden, der die Oberkieferzähne an der Arbeitsbasis befestigt hält.
6. Für den Intubationsteil legen Sie dann die Luftröhrenringe durch einen minimalen Schnitt im Hals frei und führen Sie ihn mit einem intravenösen 20-G-Katheter durch, der an ein Nagetierbeatmungsgerät angeschlossen ist (Tidalvolumen: 250 ml/Schlag), mit einer Atemfrequenz von 34-38 Zyklen/min, wie zuvor^{beschrieben 14}.
7. Platzieren Sie das Tier in einem lateralen Dekubitus, um die linke laterale Thorakotomie im vierten oder fünften Interkostalraum durchzuführen. Machen Sie einen Schnitt in die Haut des Tieres; Beobachten Sie die Muskeln darunter und spreizen Sie sie vorsichtig, um sie von der Brustwand zu trennen und den Interkostalraum deutlich zu sehen. Stellen Sie zu diesem Zeitpunkt sicher, dass das Tier ordnungsgemäß an das Beatmungsgerät angeschlossen ist. Öffnen Sie dann den Interkostalraum, indem Sie mit der extra scharfen Pinzette ein Loch bohren.
   HINWEIS: Die LDA sollte entlang der freien linksventrikulären (LV) Wand in den oben genannten Interkostalräumen erkennbar sein.
8. Führen Sie die Perikardiektomie durch und identifizieren Sie die LDA, indem Sie die Koronararterien mit den Koronararvenen und der LDA-Verzweigung unterhalb der linken Ohrmuschel kontrastieren. Führen Sie dann die Ligatur des LDA mit dem 8-0 Seidenfaden ~2 mm vom Rand der Ohrmuschel entfernt. Schließen Sie schließlich den Thorax in Schichten mit dem 6-0-Seidenfaden, schließen Sie die Rippen und stellen Sie sicher, dass sich kein Pneumothorax im Inneren befindet (tun Sie dies vorsichtig, indem Sie die Lunge zwingen, sich mit dem Beatmungsgerät auszudehnen), und nähern Sie sich den Muskeln oder nähen Sie sie, bevor Sie die Haut schließen.
9. Sobald die Haut geschlossen ist, trennen Sie die Maus im ventralen Dekubitus langsam vom Beatmungsgerät und entfernen Sie den Endotrachealtubus, wenn sich die Atemfrequenz erholt hat. Lassen Sie das Tier sich von der Narkose in einer ruhigen Umgebung und vorzugsweise bei einer stabilen Raumtemperatur von 27 °C erholen.
10. Warten Sie, bis sich die Tiere von der Narkose erholt haben, ihre Gliedmaßen zu bewegen beginnen und ihre normale Atemfrequenz wiederhergestellt ist. Halten Sie sie dann bis zum Ende des Protokolls in Einzelkäfigen.
11. Das gleiche Verfahren ist bei den Kontrolltieren oder scheinoperierten Tieren durchzuführen, jedoch ohne die Ligatur des LDA.

3. Studiendesign

1. Um die zeitliche Entwicklung der Heilung und des ventrikulären Umbaus nach MI zu testen, randomisieren Sie die Mäuse in die folgenden Gruppen:
   1. Um die frühe Phase des ventrikulären Umbaus nach 1 Woche MI-Evolution zu untersuchen, ordnen Sie die Mäuse den folgenden Gruppen zu: 1) C57 Sham (1 Woche); 2) Gal-3 KO Sham (1 Woche); 3) C57 MI (1 Woche); 4) Gal-3 KO MI (1 Woche).
   2. Um die späte Phase des ventrikulären Umbaus nach 4 Wochen MI zu untersuchen, ordnen Sie die Mäuse den folgenden Gruppen zu: 5) C57 Sham (4 Wochen); 6) Gal-3 KO Sham (4 Wochen); 7) C57 MI (4 Wochen); 8) Gal-3 KO MI (4 Wochen).

4. Echokardiographie

HINWEIS: Für Maus-Echokardiogramme müssen lineare Schallköpfe über 10 MHz verwendet werden, um die Wanddurchmesser und Hohlraumgrößen korrekt sichtbar zu machen. Dieses Verfahren kann unter Narkose mit intraperitonealem (IP) Avertin in einer Menge von 1,15 ml/kg oder bei bewussten Tieren durchgeführt werden. Letzteres kann jedoch bei Mäusen mit MI aufgrund des durch Manipulation verursachten Stresses und der Angst zu verwirrenden Ergebnissen führen.

1. Um eine Maus zu betäuben, heben Sie sie auf, halten Sie sie mit dem Rücken zur Handfläche und drehen Sie sie um, um die Oberfläche des Bauches zu erreichen. In dieser Position injizieren Sie die IP-Anästhesie in einem Winkel von 45° zwischen dem Tier und der Unterhautnadel.
2. Sobald die Maus betäubt ist, rasieren Sie ihre Brust und legen Sie die Maus auf ein vorgewärmtes Heizkissen in der dorsalen Dekubitusposition. Um parasternale Längsachsen- und Kurzachsenansichten zu erhalten, bewegen Sie den Schallkopf um 90°. Sobald Sie die richtige Achsenansicht erhalten haben, platzieren Sie den Cursor auf Höhe der Papillarmuskulatur, drücken Sie die 2D-M-Modus-Taste , um die Bilder aufzunehmen, und verwenden Sie die Bildanalysesoftware, um die folgenden Parameter zu messen:
   1. Messen Sie die LV-Abmessungen, einschließlich der Wandstärke (LVWT), der LV-Bereiche sowohl in der Systole (S) als auch in der Diastole (D) sowie des linksventrikulären diastolischen Bereichs (LVDA) und des linksventrikulären systolischen Bereichs (LVSA) in mindestens drei Schlägen.
   2. Berechnen Sie außerdem die ventrikuläre Funktion anhand der Ejektionsfraktion (EF, %), der Verkürzungsfraktion (SF, %) und der Herzmasse (unter Annahme eines unkorrigierten Würfels) unter Verwendung von Gleichung (1), Gleichung (2) und Gleichung (3), wie zuvor beschrieben¹⁵.
      SF (%) = ([LVEDD - LVEDD]/LVEDD) × 100 (1)
      EF (%) = ([LVDA - LVSA]/LVDA) × 100 (2)
      LV-Masse = 1,055 × ([IVST + LVEDD + PWT]³− [LVEDD]³) (3)
      Dabei ist LVEDD der linksventrikuläre enddiastolische Durchmesser, LVESD der linksventrikuläre endsystolische Durchmesser, IVST die intraventrikuläre Dicke und PWT die hintere Wanddicke.

5. Histologische Bewertung

1. Während der Autopsie entnehmen Sie dem Tier das Herz, indem Sie den Brustkorb von einer Seite zur anderen öffnen und alle ihn umgebenden Strukturen durchtrennen. Reinigen Sie das Blutgerinnsel, das sich in den Hohlräumen befindet, indem Sie sanften Druck mit Seidenpapier ausüben.
2. Ernten und wiegen Sie das Herz auf einer Labor-Präzisionswaage. Tauchen Sie es mindestens 72 h bei Raumtemperatur in 10%iges Formaldehyd. Schneiden Sie das Herz von der Spitze bis zur Basis mit einer Klinge von Hand in 1 mm dicke Querscheiben und bearbeiten Sie die Scheiben, indem Sie sie in Paraffin einbetten. Führen Sie mit einem Mikrotom serielle Schnitte an den in Paraffin eingebetteten Abschnitten von 5 μm Dicke durch.
3. Platzieren Sie jeden Abschnitt zwischen den Objektträgern und färben Sie sie mit Hämatoxylin und Eosin (H&E), Massons Trichrom, Rhodamin-konjugierten, mit Lektin gefärbten Abschnitten oder Picrosiriusrot^15,16.
   1. Mit einem geeigneten Fotomikroskop können Sie digitalisierte Bilder mit 400-facher Geschwindigkeit für die Morphometrie, Fibrose und MCSA-Quantifizierung aufnehmen. Vergewissern Sie sich, dass das Mikroskop an eine Digitalkamera angeschlossen und mit einem Computer mit Bildanalysesoftware verbunden ist. Stellen Sie bei jeder morphometrischen Analyse sicher, dass sich die Bilder in denselben Bereichen befinden, mit mindestens 10 Hochleistungsfeldern bei 400x pro Schnitt (Septum, Infarktzone und entfernte Zone) und ohne Überlappung der Felder.
      1. Um die MCSA zu messen, achten Sie auf die Positionen der kardialen Myozyten und zählen Sie nur die Myozyten, die quer geschnitten und von mindestens drei nahe gelegenen Kapillaren umgeben sind.
      2. Identifizieren Sie in den rot gefärbten Picrosirius-Schnitten die Narben- und Septumbereiche und stellen Sie das interstitielle Kollagen in beiden Zonen dar. Laden Sie die Bilder in die Analysesoftware hoch und öffnen Sie die Registerkarte "Schwellenwert", um alle positiven und negativen Kollagenbereiche hervorzuheben. Um die Daten zu erhalten, drücken Sie auf die Registerkarte "Messen" und speichern Sie die Ergebnisse. Für die Berechnung des prozentualen Anteils an Kollagen pro Region wird Gleichung (4) verwendet, die kollagenpositiven Zonen addiert und durch das Gesamtgewebe, einschließlich der kollagenpositiven Bereiche, dividiert, wie an anderer Stelle^15,16 beschrieben.
         Kollagen (%) = Picrosirius-rote Fläche/Gesamtgewebefläche (4)
      3. Quantifizieren Sie die MCSA aus den digitalisierten Bildern, die aus den Rhodamin-konjugierten Lektin-gefärbten Schnitten der in Paraffin eingebetteten Proben erhalten wurden. Um das richtige Bild zu erhalten, verwenden Sie eine Bildanalysesoftware, um die roten Umrisse der Myozyten zu verfolgen, die die Zellmembranen umgeben. Wählen Sie die Registerkarte "Bereich" aus, zeichnen Sie die Umrisse nach und drücken Sie die Funktion "Registerkarte messen ". Speichern Sie abschließend die Ergebnisse aus den Zellbereichen¹⁶.

6. Quantitative Bestimmung der Infarktgröße und Planimetrie zur Bewertung des kardialen Umbaus

1. Messen Sie die Größe des Myokardinfarkts, die Wandstärke und die Länge des Endokard- und Epikardumfangs mit Hilfe der Planimetrie aus den histologischen Bildern der Trichrom-gefärbten Schnitte von Masson, die mit einem Lichtmikroskop (4x) und der entsprechenden Software aufgenommen wurden.
   1. Für die Quantifizierung der Infarktgröße sind die Infarktzone (blau) und die entfernte Zone (rot) zu identifizieren. Verfolgen und messen Sie die Gesamtlänge der Infarktzone und der entfernten Zone an der endokardialen und epikardialen Seite. Berechnen Sie den Durchschnitt der endokardialen und epikardialen Tracings als Prozentsatz des gesamten LV-Umfangs¹⁷.
   2. Messen Sie in ähnlicher Weise die Narbendicke (den Durchschnitt von fünf äquidistanten Messungen) und die Septumdicke (den Durchschnitt von drei äquidistanten Messungen) in einem mittleren Abschnitt des Herzens und verwenden Sie diese Messungen, um das Verhältnis der Narbendicke (Gleichung [5]) und den Expansionsindex (Gleichung [6]¹⁸) zu bestimmen.
      HINWEIS: Alle Werte können in einer Tabelle aufgezeichnet werden.
      Verhältnis der Narbendicke = Narbendicke/Septumdicke (5)
      Expansionsindex = (LV-Kavitätenfläche/LV-Gesamtfläche) × (Septumdicke/Narbendicke) (6)
      HINWEIS: Da der Umbau die Ausdehnung verändern kann, was zu einer Unter- oder Überschätzung der Infarktgröße führt, kann es einige Zeit dauern, bis ein Pilotversuch zur Messung der Infarktgröße nach 24 h durchgeführt wird, gefolgt von der Euthanasie. In diesem Fall betäuben Sie das Tier mit der gleichen IP-Anästhesielösung, die für das MI-Verfahren verwendet wurde.
2. Legen Sie das Tier in den dorsalen Dekubitus und intubieren Sie es wie zuvor beschrieben. Sobald das Tier betäubt ist, machen Sie einen tiefen diagonalen Schnitt, der die Haut, Muskeln und Rippenknochen von der Xiphoid-Apophyse bis zur Achselhöhle erreicht.
3. Isolieren Sie den Aortenbogen, bohren Sie ein kleines Loch in die aufsteigende Aorta und führen Sie einen Katheter ein, um das Herz mit Evan-Blau zu durchbluten. Entfernen Sie dann manuell das befleckte Herz vom Tier und schneiden Sie es mit einer scharfen Klinge von der Spitze bis zur Basis ab. Legen Sie die Herzscheiben in 1 % Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) in isotonischen Phosphatpuffer (pH 7,4) und inkubieren Sie sie 30 min ^{lang bei} 37 °C 4, um zu bestätigen, dass die Tiere in Bezug auf die Infarktgröße vergleichbar sind.

Ergebnisse

Überleben nach dem Myokardinfarkt und Autopsie
Über einen Zeitraum von 4 Wochen wurden 17 % (4/23) der C57-Mäuse gegenüber 40 % (8/20) der Gal-3-KO-Mäuse tot aufgefunden. Die Autopsie wurde durchgeführt; die toten Gal-3 KO Mäuse zeigten größere Herzen als die C57 Mäuse (Abbildung 1), und 38% der C57 Mäuse im Vergleich zu 32% der Gal-3 KO Mäuse wiesen makroskopische Thoraxgerinnsel auf, die direkt mit...

Diskussion

Das experimentelle Modell des MI durch permanente Koronararterienligatur wird zur Untersuchung einer Vielzahl pathophysiologischer Mechanismen der Herzreparatur und des Umbaus verwendet ^5,14,17. Dieser Artikel fasst verschiedene Methoden zusammen, die derzeit in diesem Labor zur Untersuchung der zeitlichen Entwicklung der Herzreparatur und ihrer Auswirkungen auf den ventrikulären Umbau nach ein...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-0 silk suture	Ethicon
C57BL/6J mice	Department of Bioresources of the Faculty of Veterinary of the University of Buenos Aires, Argentina
Forceps
Hardvard 386 respirator	Hardvard company
Heating pad			maintain animal's temperature during surgery
Image Pro-Plus 6.0	Media Cybernetics		Image Analysis Software
Ketamine	Holiday
Masson Trichrome	BIOPUR
Picrosirius red	BIOPUR
Retractors
Rodent Ventilator Model 683	Harvard Apparatus		Mechanical ventilator
Scissors
Stereoscopic magnifying glass	Arcano
Vivid 7 machine (General Electric Medical Systems, Horten, Norway)	General Electric		Any tracking software can be utilized with this protocol
WGA no. RL-1022, Vector Laboratories, Burlingame	Vector Laboratories
Xylazine	Pro-Ser