Das Miniaturschwein: Ein Großtiermodell für die Cochlea-Implantat-Forschung

Zusammenfassung

Miniaturschweine (Minischweine) sind ein ideales Großtiermodell für die Erforschung von Cochlea-Implantaten. Die Cochlea-Implantationschirurgie bei Minischweinen kann verwendet werden, um erste Beweise für die Sicherheit und potenzielle Leistungsfähigkeit neuartiger Elektrodenarrays und chirurgischer Ansätze in einem lebenden System ähnlich dem Menschen zu liefern.

Zusammenfassung

Cochlea-Implantate (CI) sind die effektivste Methode zur Behandlung von Menschen mit schwerem bis hochgradigem sensorineuralem Hörverlust. Obwohl CIs weltweit verwendet werden, existiert kein Standardmodell für die Untersuchung der Elektrophysiologie und Histopathologie bei Patienten oder Tiermodellen mit einem CI oder für die Bewertung neuer Modelle von Elektrodenarrays. Ein großes Tiermodell mit Cochlea-Eigenschaften, die denen des Menschen ähneln, kann eine Forschungs- und Bewertungsplattform für fortgeschrittene und modifizierte Arrays vor ihrer Verwendung beim Menschen bieten.

Dazu haben wir Standard-CI-Methoden mit Bama-Minischweinen etabliert, deren Innenohranatomie der des Menschen sehr ähnlich ist. Für den menschlichen Gebrauch konzipierte Arrays wurden durch eine runde Fenstermembran in die Mini-Schweinecochlea implantiert, und es folgte ein chirurgischer Ansatz, der dem für menschliche CI-Empfänger ähnelte. Auf die Array-Insertion folgten ECAP-Messungen (evoziertes Compound Action Potential), um die Funktion des Hörnervs zu bewerten. Diese Studie beschreibt die Vorbereitung des Tieres, chirurgische Schritte, Array-Insertion und intraoperative elektrophysiologische Messungen.

Die Ergebnisse zeigten, dass das gleiche CI, das für Menschen verwendet wird, leicht in Mini-Schweine über einen standardisierten chirurgischen Ansatz implantiert werden konnte und ähnliche elektrophysiologische Ergebnisse lieferte wie bei menschlichen CI-Empfängern. Minischweine könnten ein wertvolles Tiermodell sein, um erste Beweise für die Sicherheit und potenzielle Leistungsfähigkeit neuartiger Elektrodenarrays und chirurgischer Ansätze zu liefern, bevor sie auf den Menschen angewendet werden.

Einleitung

Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation (WHO) sind weltweit über 1 Milliarde Menschen von Hörverlust bedroht, und es wird geschätzt, dass bis 2050 einer von vier Menschen einen Hörverlust erleiden wird¹. In den letzten 2 Jahrzehnten waren CIs die effektivste Intervention für Menschen mit dauerhaft schwerem und hochgradigem sensorineuralem Hörverlust (SNHL). Ein CI wandelt physikalische Schallsignale in bioelektrische Signale um, die die spiralförmigen Ganglienneuronen (SGNs) stimulieren und Haarzellen umgehen. Im Laufe der Zeit wurden die Indikationen für ein CI erweitert, so dass sie nun Menschen mit Resthörvermögen, einseitigem Hörverlust und sehr alten oder jungen Menschen umfassen ^2,3,4. In der Zwischenzeit wurden vollständig implantierbare CIs und fortschrittliche Arrays entwickelt⁵. Es gibt jedoch kein wirtschaftlich realisierbares Großtiermodell zur Untersuchung der Elektrophysiologie und Histopathologie des Innenohrs mit einem CI. Dieses Fehlen eines großen Tiermodells schränkt die Forschung ein, die CIs verbessern und Einblicke in die elektrophysiologischen Auswirkungen von CIs auf das Innenohr gewinnen möchte.

Mehrere Nagetiermodelle wurden in der CI-Forschung angewendet, wie Maus⁶, Rennmaus⁷, Ratte⁸ und Meerschweinchen⁹; Die Merkmale der Morphologie und der elektrophysiologischen Reaktionen unterscheiden sich jedoch von denen beim Menschen. Cochlea-Strukturen von Tiermodellen, die traditionell für CI-Studien verwendet werden, wie Katzen, Meerschweinchen und andere Tiere, unterscheiden sich stark von denen menschlicher Cochlea-Strukturen¹⁰. Obwohl die Array-Insertion bei Katzen¹¹ und Kaninchen¹² aufgrund ihrer kleineren Cochleae durchgeführt wurde, wurde dies mit Arrays durchgeführt, die nicht für die Anwendung beim Menschen ausgelegt waren. Mehrere große Tiermodelle wurden auch für CI untersucht. Lämmer eignen sich gut als Trainingsmodell für die atraumatische Cochlea-Implantation, aber die geringere Größe der Cochlea macht eine vollständige Insertion unmöglich¹³. Primaten könnten wegen ihrer anatomischen Ähnlichkeit mit Menschen die am besten geeigneten Tiere für die CI-Forschung sein^14,15; Die Geschlechtsreife von Affen ist jedoch verzögert (4-5 Jahre), die Tragzeit beträgt bis zu etwa 165 Tage, und jedes Weibchen produziert normalerweise nur einen Nachwuchs pro Jahr¹⁶. Diese Gründe und die teuren Kosten behindern die umfangreiche Anwendung von Primaten in der CI-Forschung.

Im Gegensatz dazu erreichen Schweine die Geschlechtsreife nach 5-8 Monaten und haben eine Tragzeit von ~ 114 Tagen, was Schweine für die CI-Forschung als großes Tiermodell besser zugänglich macht¹⁶. Bama-Minischweine (Minischweine) stammen 1985 von einer kleinen Schweineart in China ab, deren genetischer Hintergrund gut verstanden ist. Sie zeichnen sich durch eine inhärente geringe Größe, frühe Geschlechtsreife, schnelle Fortpflanzung und einfache Handhabung aus¹⁷. Das Minischwein ist aufgrund seiner Ähnlichkeit mit dem Menschen in Morphologie und Elektrophysiologie ein ideales Modell für die Otologie und Audiologie¹⁸. Die Scala tympani Länge eines Bama Mini-Schweins beträgt 38,58 mm, was nahe an der Länge von 36 mm beim Menschen¹⁰ liegt. Die Mini-Schweine-Cochlea hat 3,5 Windungen, was den 2,5-3 Drehungen bei Menschen¹⁰ ähnelt. Neben der Morphologie ist auch die Elektrophysiologie von Bama-Minischweinen der des Menschen sehr ähnlich¹⁸. Daher haben wir in der vorliegenden Studie für den menschlichen Gebrauch konzipierte Arrays über die runde Fenstermembran in die Mini-Schweine-Cochlea eingeführt und einen ähnlichen chirurgischen Ansatz wie bei menschlichen CI-Empfängern verfolgt. Zur Bewertung des Verfahrens wurden intraoperative ECAP-Messungen durchgeführt. Der hierin beschriebene Prozess könnte sowohl für die präklinische translationale Forschung im Zusammenhang mit CIs als auch als Plattform für die Ausbildung von Assistenzärzten verwendet werden.

Protokoll

Alle Verfahren und Tieroperationen wurden nach den Richtlinien der Ethikkommission des Allgemeinen Krankenhauses der Volksbefreiungsarmee durchgeführt und genehmigt.

1. Anästhesie und chirurgische Vorbereitung

1. Injizieren Sie dem Schwein (männlich, 2 Monate alt, 5 kg) mit Tiletamin und Zolazepam in einer Dosierung von 10-15 mg/kg muskulär und intubieren Sie es mit einem 5,5-französischen Endotrachealtubus. Aufrechterhaltung der Anästhesie durch beatmungsunterstützte Beatmung mit Isofluoran-Inhalation. Überwachen Sie die Sauerstoffsättigung (>90%), die Atmung (15-20/min) und die Herzfrequenz (60-120 Schläge/min) mit der Pulsoximetrieklemme eines EKG-Monitors, der mit der Zunge des Schweins verbunden ist.
2. Legen Sie das Mini-Schwein in eine linke seitliche Position (wenn die rechte Seite implantiert werden soll) auf ein thermostatisch reguliertes Heizkissen, um Unterkühlung zu vermeiden. Bestätigen Sie, dass das Schwein mit verschiedenen Reizen ausreichend betäubt ist. Stellen Sie sicher, dass keine Reaktionen vorhanden sind (z. B. Zehenklebereflex). Tragen Sie künstliche Tränensalbe auf die Augen des Minischweins auf, um das Austrocknen der Hornhaut zu verhindern. Halten Sie die Augen mit einem medizinischen Pflaster geschlossen.
3. Rasieren Sie den Operationsbereich um das Ohrläppchen herum, halten Sie ihn 10 cm im Durchmesser (Abbildung 1) und desinfizieren Sie ihn mit drei abwechselnden Jod- und Alkoholtupfern in kreisenden Bewegungen von der Mitte nach außen. Decken Sie den Operationsbereich mit sterilen OP-Abdecktüchern ab.
4. Decken Sie das Mikroskop mit einer sterilen Kunststoffhülse ab und entfernen Sie die Teile, die die Okulare und das Objektiv bedecken.

2. Chirurgischer Eingriff

1. Lokalisieren Sie die Oberflächenprojektionsstelle der Cochlea 1 cm hinter dem hinteren Ohrmuschelsulcus auf Höhe des Ohrläppchens. Machen Sie einen postaurikulären Schnitt von etwa 5 cm Länge mit der Projektionsstelle als Zentrum mit einem # 15 Skalpell. Teilen Sie das Unterhautgewebe, die Ohrspeicheldrüse und den Musculus sternocleidomastoideus mit einer Mikroschere, um die Oberfläche des Warzenknochens freizulegen (Abbildung 2A). Verwenden Sie bei Bedarf bipolare Kauterisation, um Blutungen zu minimieren.
2. Kortikale Mastoidektomie
   1. Bohren Sie den Mastoid an der Oberflächenprojektion der Cochlea auf dem Warzenknochen (Abbildung 2B) zum äußeren Gehörgang (EAC), der dicht und hellblau ist (Abbildung 2C). Achten Sie darauf, das blasse oder rötliche vertikale Segment des Gesichtsnervs dorsal zum EAC nicht zu beschädigen, um Blutungen zu vermeiden (Abbildung 2C).
      HINWEIS: Wenn der Gesichtsnerv beschädigt ist, ist die bipolare Kauterisation eine gute Wahl, um Blutungen zu stoppen.
3. Legen Sie das Tympanon frei, indem Sie den Knochen bohren, der das hintere knöcherne EAC umgibt (Abbildung 2D). Trennen Sie die Haut des EAC und des Gesichtsnervs mit einer Injektionsnadel, um eine Beschädigung des Gesichtsnervs zu vermeiden. Schieben Sie die Haut des EAC vorsichtig weg, um das Tympanon (einschließlich der Gehörknöchelchenkette) und die runde Fensternische freizulegen (Abbildung 3A).
4. Belichten Sie die runde Fenstermembran. Entfernen Sie die runde Fensternische mit einem kleinen Diamantgrat, und führen Sie eine kontinuierliche Saugbewässerung durch, um die Basaldrehung der Cochlea und der runden Fenstermembran freizulegen (Abbildung 3B).
5. Reparieren Sie das Empfängerpaket. Trennen Sie den kranialen Parietalmuskel, um eine Tasche zu bilden, die gerade groß genug für den Empfänger ist. Legen Sie das interne Empfängerpaket in die Muskeltasche und fixieren Sie es mit einer Fixierungsnaht.
6. Führen Sie die Elektrodenanordnung, die mit einem in einer Muskeltasche befestigten Empfänger verbunden ist, ein, indem Sie die runde Fenstermembran mit einem scharfen mikrochirurgischen Messer öffnen und die Anordnung mit einer Mikrozange langsam, stetig und kontinuierlich in Bezug auf den Modiolus der Cochlea einführen (Abbildung 3C). Nähen Sie den chirurgischen Schnitt mit einer resorbierbaren Naht 2-0.
7. ECAP-Messungen
   HINWEIS: Das Setup besteht aus einem PC mit MAESTRO-Software, der über das Stimulationsgerät (MAX Programming Interface) und die CI-Spule mit dem Cochlea-Implantat (CI) des Patienten verbunden ist.
   1. Verbinden Sie die CI-Spule magnetisch mit dem CI-Empfänger durch die Haut. Bestätigen Sie die Integrität des CI und überprüfen Sie die Elektrodenimpedanz für alle Kanäle vor ECAP-Messungen mit der Telemetriefunktion des CI, die von MAESTRO Software automatisch durchgeführt wird (Abbildung 4A, B).
   2. Führen Sie die ECAP-Messungen wie zuvor beschrieben^{durch 19}. Wählen Sie das ECAP-Modul aus, wählen Sie alle 12 Elektroden für die Stimulation aus und warten Sie, bis die ECAP-Tests der Elektroden abgeschlossen sind. In der Materialtabelle finden Sie die Software und das Stimulationsgerät, die zur Messung von ECAP-Antworten verwendet werden. Stimulieren Sie alle 12 Elektroden für ECAP-Messungen mit biphasischen Stimuli von 30 μs Phasendauer, mit einem Wechselpolaritätsparadigma, durchschnittlich über 25 Iterationen und einer Stimulationsrate von 45,1 Pulsen / s.

3. Nachsorge

1. Überwachen Sie das Minischwein weiterhin, um Schäden durch unbewusste Bewegungen zu vermeiden, bis es wieder ausreichend Bewusstsein erlangt hat, um das sternale Liegen aufrechtzuerhalten. Legen Sie das Minipig auf das thermostatisch regulierte Heizkissen, um Unterkühlung zu vermeiden.
2. Setzen Sie das Mini-Schwein allein in seinen heimischen Käfig zurück.
3. Injizieren Sie Antibiotika, um eine postoperative Infektion für 7 Tage zu verhindern.
4. Überprüfen Sie das Mini-Schwein auf Symptome einer vestibulären Verletzung wie Nystagmus, Kreisen oder Überrollen.

4. Postoperativer CT-Scan

1. Minipig intramuskuläre Injektion von 3% Natriumpentobarbital 1 ml/kg und 0,1 ml/kg Sulforaphan verabreichen, um eine Anästhesie einzuleiten. Verwenden Sie eine 37°C warme Platte, um es warm zu halten. Nach 3 oder 5 Minuten kann ein CT-Scan durchgeführt werden.
2. Um die korrekte Position des Elektrodenarrays zu bestätigen, betäuben Sie das Mini-Schwein 1 Woche nach der Operation mit Tiletamin und Zolazepam. Führen Sie den CT-Scan und die 3D-Rekonstruktion²⁰ mit der 3D-Slicer-Bildverarbeitungsplattform durch (siehe Materialtabelle). Importieren Sie DICOM-Daten des CT und führen Sie das Volumen-Rendering-Modul durch, um 3D-Bilder des CI zu erhalten.

Ergebnisse

Die Integrität (Abbildung 4A) und Impedanzen (Abbildung 4B) des CI wurden von MAESTRO Software bestätigt. ECAP-Ergebnisse zeigten, dass alle 12 Elektroden gute neuronale Reaktionen zeigten (Abbildung 4C), was bedeutet, dass das Elektrodenarray gut mit der Cochlea-Achse verbunden war und den Hörnerv stimulierte. Abbildung 5 zeigt postoperative 3D-rekonstruierte Elektrodenspulen in der rechten Cochlea....

Diskussion

Etwa 15 % der Weltbevölkerung haben einen gewissen Grad an Hörverlust, und über 5 % haben einen behindernden Hörverlust²¹. Die CI-Versorgung ist die effizienteste Behandlung für erwachsene und pädiatrische Patienten mit schwerem und hochgradigem sensorineuralen Hörverlust. Als erster erfolgreicher implantierbarer Hirnnervenstimulator haben CIs in den letzten 2 Jahrzehnten Tausenden von Menschen mit Hörverlust die Möglichkeit geboten, in die Welt des Klangs zurückzukehren und sich (wieder...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mm diamond burr
1 mm diamond burr
5 mm diamond burr
2-0 suture silk
3D Slicer image computing platform			3D reconstruction of CT image
Alcohol
Bipolar cautery
Bipolar electrocoagulation			Stop bleeding
CI designed for human use (CONCERTO FLEX28)	MED-EL	Concerto F28
Dressing forceps
ECG monitor
Iodine tincture
Isoflurane			3.6 mL/h
Laryngoscope
MAESTRO Software	MED-EL		Measure ECAP responses
Micro forceps
Micro spatula
Mosquito forceps
Needle holder
Needle probe
Negative pressure suction device
Otological surgical instruments
Respiratory Anesthesia Machine
Scalpel with blade No. 15
Scissors
Shaver
Stimulation device (MAX Programming Interface)	MED-EL		Measure ECAP responses
Surgery microscope	Leica
Surgical drill
Surgical Power Device
Tiletamine and zolazepan			10-15 mg/kg
Tissue forceps
Trachea cannula