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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
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  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
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  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt eine neue Methode zur Untersuchung des Maus-Voiding-Verhaltens durch die Integration von Videoüberwachung in den konventionellen Void-Spot-Assay. Dieser Ansatz liefert zeitliche, räumliche und volumetrische Informationen über die Entleerungsereignisse und Details des Mausverhaltens während der hellen und dunklen Tagesphasen.

Zusammenfassung

Ein normales Entleerungsverhalten ist das Ergebnis der koordinierten Funktion der Blase, der Harnröhre und der Harnröhrenschließmuskeln unter der richtigen Kontrolle des Nervensystems. Um das freiwillige Entleerungsverhalten in Mausmodellen zu untersuchen, haben Forscher den Void Spot Assay (VSA) entwickelt, eine Methode, die die Anzahl und Fläche der Urinflecken misst, die sich auf einem Filterpapier ablagern, das den Boden des Käfigs eines Tieres auskleidet. Obwohl dieser Test technisch einfach und kostengünstig ist, weist er bei der Verwendung als Endpunkt-Assay Einschränkungen auf, einschließlich einer mangelnden zeitlichen Auflösung von Entleerungsereignissen und Schwierigkeiten bei der Quantifizierung überlappender Urinflecken. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir eine videoüberwachte VSA entwickelt, die wir Real-Time VSA (RT-VSA) nennen und die es uns ermöglicht, die Voiding-Frequenz zu bestimmen, das Void-Volumen und die Voiding-Muster zu beurteilen und Messungen über 6-Stunden-Zeitfenster sowohl während der dunklen als auch der hellen Tagesphase durchzuführen. Die in diesem Bericht beschriebene Methode kann auf eine Vielzahl von Studien an Mäusen angewendet werden, die die physiologischen und neurobehavioralen Aspekte der freiwilligen Miktion in Gesundheits- und Krankheitszuständen untersuchen.

Einleitung

Die Urinspeicherung und die Miktion werden von einem zentralen Schaltkreis (Zentralnervensystem) koordiniert, der über die Becken- und Hypogastricusnerven Informationen über den Blasenfüllstatus erhält. Das Urothel, das Epithel, das die Harnwege vom Nierenbecken bis zur proximalen Harnröhre auskleidet, bildet eine dichte Barriere gegen die im Urin vorhandenen Stoffwechselendprodukte und Krankheitserreger. Es ist ein integraler Bestandteil eines sensorischen Netzes, das den Füllzustand der Blase erkennt und an das darunter liegende Gewebe und die afferenten Nerven weitergibt 1,2. Eine Störung der Urothelbarriere oder Veränderungen der urothelialen Mechanotransduktionswege können zu einer Blasenentleerungsstörung zusammen mit Symptomen der unteren Harnwege wie Häufigkeit, Harndrang, Nykturie und Inkontinenz führen 3,4,5,6,7. Ebenso ist bekannt, dass Alterung, Diabetes, Infektionen der unteren Harnwege, interstitielle Zystitis und andere Krankheitsprozesse, die die Harnblase oder die zugehörigen Schaltkreise, die ihre Funktion steuern, betreffen, eine Blasenfunktionsstörung verursachen 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18,19. Ein besseres Verständnis des normalen und abnormen Entleerungsverhaltens hängt von der Entwicklung von Methoden ab, die zuverlässig zwischen verschiedenen Harnmustern unterscheiden können.

Traditionell wurde das freiwillige Entleerungsverhalten von Mäusen mit dem von Desjardins und Kollegen entwickelten Void-Spot-Assay (VSA) untersucht20, der aufgrund seiner Einfachheit, seiner geringen Kosten und seines nicht-invasiven Ansatzes weit verbreitet ist 8,21,22,23,24. Dieser Assay wird in der Regel als Endpunkt-Assay durchgeführt, bei dem eine Maus eine definierte Zeit in einem Käfig verbringt, der mit einem Filterpapier ausgekleidet ist, das anschließend analysiert wird, indem die Anzahl der Urinflecken gezählt und die Größe der Urinflecken beurteilt wird, wenn das Filterpapier unter ultraviolettes (UV) Licht gesetzt wird (die Urinflecken fluoreszieren unter diesen Bedingungen)20. Trotz dieser vielen Vorteile weist der traditionelle VSA einige große Einschränkungen auf. Da Mäuse oft in dieselben Bereiche urinieren, müssen die Forscher die Dauer des Tests auf einen relativ kurzen Zeitraum (≤4 h) beschränken25. Selbst wenn die VSA über kürzere Zeiträume durchgeführt wird, ist es fast unmöglich, kleine Void-Spots (SVS) aufzulösen, die über große Void-Spots fallen, oder SVS von der Verschleppung von Urin zu unterscheiden, der an Schwänzen oder Pfoten haftet. Es ist auch sehr schwierig zu unterscheiden, ob SVS eine Folge häufiger, aber individueller Blasenentleerungsereignisse sind (ein Phänotyp, der häufig als Reaktion auf eine Zystitis beobachtet wird 4,26) oder aufgrund von Tröpfeln nach der Miktion (ein Phänotyp, der mit einer Obstruktion des Blasenausgangs assoziiert ist 27). Darüber hinaus beschränkt der Wunsch, den Assay während der Arbeitszeit durchzuführen, gepaart mit Schwierigkeiten beim Zugang zu Wohneinrichtungen bei ausgeschaltetem Licht, diese Assays oft auf die Lichtperiode des 24-stündigen circadianen Zyklus. Daher verhindern diese Zeitbeschränkungen die Bewertung des Entleerungsverhaltens von Mäusen während ihrer aktiven Nachtphase und verringern die Fähigkeit, bestimmte Gene oder Behandlungen zu analysieren, die von circadianen Rhythmen gesteuert werden.

Um einige dieser Einschränkungen zu überwinden, haben Forscher alternative Methoden entwickelt, um das Entleerungsverhalten in Echtzeit zu bewerten 26,28,29,30,31,32. Einige dieser Ansätze beinhalten die Verwendung teurer Geräte, wie z. B. Stoffwechselkäfige 26, 28, 29 oder die Verwendung von Wärmebildkameras30; Aber auch diese haben ihre Grenzen. In Stoffwechselkäfigen neigt der Urin beispielsweise dazu, an den Drähten des Gitterbodens und an den Wänden des Trichters zu haften, wodurch die Menge an Urin, die gesammelt und gemessen wird, reduziert wird. Daher kann es schwierig sein, Daten über kleine Hohlräume genau zu sammeln. Darüber hinaus liefern Stoffwechselkäfige keine Informationen über die räumliche Verteilung der Entleerungsereignisse (d.h. Urinieren in den Ecken vs. in der Mitte der Kammer). Da die langwellige Infrarotstrahlung, die von den Wärmebildkameras verwendet wird, keine Festkörper durchdringt, muss die mittels Videothermografie bewertete Voiding-Aktivität in einem offenen System durchgeführt werden, was bei aktiven Mäusen eine Herausforderung darstellen kann, da sie mehrere Zentimeter in die Luft springen können. Ein weiteres System ist der automatisierte VSOP-Ansatz33 (Voided Stain on Paper), der aus gerolltem Filterpapier besteht, das sich mit konstanter Geschwindigkeit unter dem Drahtgeflechtboden eines Mäusekäfigs aufwickelt. Dieser Ansatz verhindert Papierschäden und die Überlappung von Urinflecken, die bei der klassischen VSA auftreten, und ermöglicht es dem Untersucher, Experimente über mehrere Tage durchzuführen. Es liefert dem Ermittler jedoch kein genaues Timing der Entleerungsereignisse, und es gibt keine Möglichkeit, das Verhalten und seine Korrelation mit Spotting zu untersuchen. Um diese Informationen zu erhalten, haben die Forscher Videoüberwachung in Blasenheitsassays integriert, ein Ansatz, der die gleichzeitige Beurteilung von Mausaktivität und Wasserlassen ermöglicht31,32. Ein Ansatz besteht darin, eine blaue Leuchtdiode (LED) und eine Videokamera mit einem grünen Fluoreszenzproteinfilter unter dem Versuchskäfig zu platzieren, um die Voiding-Ereignisse zu visualisieren, und eine Infrarot-LED und eine Videokamera über dem Käfig, um die Mausposition32 zu erfassen. Dieser Aufbau wurde verwendet, um das Voiding-Verhalten während der Durchführung von Faserphotometrie zu überwachen. Die hell erleuchtete Umgebung dieses Systems erforderte jedoch, dass die Forscher ihre Mäuse mit einem Diuretikum behandelten, um die Entleerung zu stimulieren. In einem anderen Versuchsdesign wurden Weitwinkelkameras über und unter dem Versuchskäfig platziert, um die motorische Aktivität der Maus bzw. das Urinieren zu visualisieren. In diesem Fall wurden Urinflecken, die sich auf einem Filterpapier abgelagert hatten, das den Boden des Käfigs auskleidete, durch Beleuchten des Filterpapiers mit UV-Lampen aufgedeckt, die unter dem Käfig31 angebracht waren. Dieser Aufbau wurde in kurzen Assays von 4 Minuten Dauer während der Lichtphase des Tages verwendet, um die Neuronen des Hirnstamms zu untersuchen, die am freiwilligen Entleerungsverhalten beteiligt sind31. Die Eignung dieses Systems für den Einsatz während der Dunkelphase oder für Zeiträume >4 min wurde nicht berichtet.

In diesem Artikel wird eine Methode beschrieben, die die traditionelle VSA erweitert, indem sie eine langfristige Videoüberwachung des Mausentleerungsverhaltens ermöglicht. Dieser kostengünstige Ansatz liefert zeitliche, räumliche und volumetrische Informationen über Leerungsereignisse über längere Zeiträume während der hellen und dunklen Tagesphasen sowie Details zum Mausverhalten 3,4,34. Es werden detaillierte Informationen für den Aufbau der Spülkammern, die Implementierung eines Echtzeit-VSA (RT-VSA) und die Analyse der Daten bereitgestellt. Der RT-VSA ist wertvoll für Forscher, die die physiologischen Mechanismen verstehen wollen, die die Funktion des Harnsystems steuern, pharmakologische Ansätze zur Kontrolle der Miktion zu entwickeln und die molekularen Grundlagen von Krankheitsprozessen zu definieren, die die unteren Harnwege betreffen.

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Protokoll

Urotheliale Piezo1/2 Double-Knockout-Mäuse (Pz1/2-KO , Genotyp: Piezo1 fl/fl; Piezo2 fl/fl; Upk2CRE+/-) und Kontrollen (Pz1/2-C, Genotyp: Piezo1 fl/fl; Piezo2 fl/fl; Upk2CRE-/-) wurden intern aus Elternstämmen aus den Jax-Labors (Piezo1 fl/fl Stamm # 029213; Piezo2 fl/fl Stamm # 027720; Upk2CRE+/- Dehnung # 029281). In den Experimenten wurden sowohl weibliche (1,5–3 Monate alt und 17–20 g schwer) als auch männliche (2–4 Monate alt und 23–29 g schwer) Mäuse verwendet. Für Cyclophosphamid-induzierte Zystitis-Experimente wurden Wildtyp-C57Bl/6J-Weibchen (3 Monate alt und ~20 g schwer) verwendet (die Jackson-Laboratorien, Stamm # 000664). Die Tiere wurden untergebracht und die Experimente wurden in der Tierpflegeeinrichtung der Universität von Pittsburgh mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee der Universität Pittsburgh durchgeführt. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften der Richtlinie des öffentlichen Gesundheitsdienstes zur humanen Pflege und Verwendung von Versuchstieren und des Tierschutzgesetzes durchgeführt.

1. Montage von Käfigen für Echtzeit-Void-Spot-Assay (RT-VSA)

  1. Das RT-VSA-Rig besteht aus einem UV-Stativ, das zwei UV-Glühbirnen und zwei Weitwinkelkameras (Bottom-Kameras) enthält, mit denen die Voiding-Aktivität während der Lichtphase des Tages aufgezeichnet wird. Ordnen Sie zwei Mauskammern so an, dass sie auf dem Ständer ruhen. Befestigen Sie Weitwinkelkameras (Top-Kameras) am Deckel jeder Mauskammer, um die Entleerungsaktivität während der Dunkelphase des Tages aufzuzeichnen (Abbildung 1A).
  2. Konstruieren Sie den Rahmen des UV-Ständers und der Mauskammern aus 1 in x 1 in T-geschlitzten Aluminiumprofilen. In Tabelle 1 finden Sie eine Liste der Komponenten, die für den Bau von zwei Mauskammern und dem UV-Stativ verwendet werden, und in Abbildung 1B–D finden Sie die verschiedenen Ansichten der montierten Komponenten und Abmessungen.
  3. Konstruieren Sie jede Mauskammer mit acht T-geschlitzten Aluminiumprofilen, die auf 10 Zoll und vier auf 14,75 Zoll geschnitten sind. Beginnen Sie mit der Montage des Bodens der Mauskammer und verwenden Sie Standard-Endbefestigungen (Tabelle 1), um die T-Nutenprofile gemäß Abbildung 1 zu montieren. Montieren Sie das 38,5 cm x 26,5 cm große, UV-durchlässige Acryl im Innenkanal der Profile, um den Boden der Mauskammern zu bauen.
    HINWEIS: Detaillierte Informationen zur Montage der T-Nutenprofile mit Standard-Endbefestigungen finden Sie auf der Website des Unternehmens.
  4. Bauen Sie die Wände der Mauskammer mit den restlichen Profilen. Montieren Sie die 38,5 cm x 21,5 cm und 26,5 cm x 21,5 cm großen, abriebfesten (AR) Polycarbonatplatten in den Profilen, um die Außenwände der Mauskammer zu montieren. Verwenden Sie die 37,5 cm x 23,9 cm und 24,4 cm x 23,9 cm großen AR-Polycarbonatplatten, um das Innere der Mauskammer zu bauen.
  5. Befestigen Sie die AR-Polycarbonatplatten mit der Standard-Endbefestigung 1/4-20 Lauffläche. Anweisungen zur Montage der Paneele in den Profilen auf der Webseite finden Sie im HINWEIS zu Schritt 1.3. Verwenden Sie handelsübliche Silikondichtungsmasse, um die Verbindungen zwischen den Innenplatten abzudichten.
  6. Verwenden Sie zwei 12-Zoll- und zwei 14,75-Zoll-T-Nutenprofile, um den Deckel des Käfigs wie in Abbildung 1B gezeigt zu montieren. Montieren Sie eine 38,5 cm x 26,5 cm große AR-Polycarbonatplatte in den Innenkanal der Profile, um den Deckel zu vervollständigen.
  7. Montieren Sie die 12-Zoll-Kameraprofilhalterung senkrecht zu den Längsachsen der Oberseite des Käfigs und sichern Sie sie mit zwei Lite-Übergangs-Inneneckhalterungen (in Abbildung 1B mit 3 gekennzeichnet). Verwenden Sie eine gerade flache Platte (mit 2 gekennzeichnet) als Halterung für die Webcam-Halterung und montieren Sie sie wie in Abbildung 1B gezeigt. Befestigen Sie die Kamera mit der Kamerabefestigungsschraube an der Halterung.
  8. Verwenden Sie die rechte Baugruppe des Standard-Abhebescharniers der Serie 10, um den Deckel am Gehäuse der Mauskammer zu befestigen (in Abbildung1 B mit 1 gekennzeichnet).
  9. Konstruieren Sie das UV-Stativ mit vier T-Nut-Profilen, die auf 40 Zoll geschnitten sind, vier T-Nut-Profilen, die auf 32 Zoll geschnitten sind, und vier T-Nut-Profilen, die auf 10 Zoll zugeschnitten sind, gemäß Abbildung 1C,D. Montieren Sie eine 82,5 cm x 26,5 cm große Acrylspiegelplatte in den Profilen, um den Boden der UV-Kammer zu bilden.
  10. Verwenden Sie die 82,5 cm x 30,5 cm und 26,5 cm x 30,5 cm große Acrylspiegelplatte, um die Wand des UV-Ständers zu konstruieren.
  11. Befestigen Sie die Fünf-Loch-T-Flachplatten der Serie 10 (in Abbildung 1 C mit 2 markiert), die Fünfloch-L-Flachplatten der Serie 10 (in Abbildung 1 C mit 3 gekennzeichnet) und die Fünf-Loch-T-Platten der Serie 10 (in Abbildung 1 C markiert), um den UV-Ständer zu befestigen.
  12. Montieren Sie die unteren Kameras in einem T-Nut-Profil, das auf 32 Zoll zugeschnitten ist, und befestigen Sie sie mit zwei leichten Übergangseckhalterungen an der Unterseite des Stativs, wie in Abbildung 1D gezeigt. Verwenden Sie gerade flache Platten, um die Webcams am T-Nutenprofil zu befestigen.
  13. Montieren Sie die UV-Lampen an der Innenseite, an der Vorder- und Rückseite und befestigen Sie sie an den geraden flachen Platten, wie in Abbildung 1D gezeigt.
  14. Schließen Sie die vier Webcams an die USB-Anschlüsse eines Computers an, auf dem eine Videoüberwachungssoftware ausgeführt wird.

2. Tierhaltung vor dem Versuch

  1. Halte experimentelle Mäuse, die entweder speziell gezüchtet oder von einem externen Standort bezogen wurden, in Vierergruppen. Wenn möglich, verwenden Sie für diese Experimente weibliche oder männliche Mäuse mit dem gleichen Alter. Wenn die Tiere von einer externen Quelle stammen, lassen Sie sie mindestens 7 Tage lang akklimatisieren, bevor Sie Versuchsverfahren durchführen.
  2. Unterbringen Sie die Tiere während ihrer gesamten Zeit in der Tiereinrichtung in Standardkäfigen, die Einstreu und Anreicherung enthalten (z. B. Plastik-Iglu, Rad, Papier zum Schreddern) und halten Sie sie unter einem 12-stündigen Tag-Nacht-Zyklus mit Zugang zu Wasser und trockenem Mäusefutter ad libitum.

3. RT-VSA-Aufnahmen während der Hell- und Dunkelphase des Tages

HINWEIS: Das folgende Protokoll beschreibt die Verwendung von RT-VSA zur Bewertung des Mausentleerungsverhaltens während der hellen und dunklen Tagesphasen. Die Tiere werden in einem 12 h hellen und 12 h dunklen Zyklus mit Zeitgeberzeit (ZT) = 0 um 07:00 Uhr gehalten. Die Aufnahmen beginnen zwischen 10:30 und 11:00 Uhr (ZT = 3,5–4,0) für die Lichtphasenexperimente und zwischen 18:00 und 18:30 Uhr (ZT = 11,0–11,5) für die Dunkelphasenexperimente. Wenn Tiere unter beiden Bedingungen getestet werden, werden die Versuche in der Regel an zwei verschiedenen Tagen durchgeführt, wobei zwischen den hellen und dunklen Tests mindestens 5 aufeinanderfolgende Tage liegen. Versuche sollten nicht an Tagen durchgeführt werden, an denen die Tierräume gereinigt oder die Käfige gewechselt werden, da dies zu Belastungen führen kann, die das Entleerungsverhalten beeinflussen. Alle Schritte sollten unter Bedingungen mit minimalem Stress für die Mäuse durchgeführt werden.

  1. Transportieren Sie die Versuchstiere von ihrem Stallstandort in den Behandlungsraum, in dem sich die RT-VSA-Ableitungskammern befinden.
  2. Vorbereitung der RT-VSA-Aufnahmekammer
    1. Legen Sie ein Stück Filterpapier (24,3 cm x 36,3 cm) in den Boden jedes RT-VSA-Aufnahmekäfigs. Verwenden Sie je nach Tageszeit dünnes (Hellphasenexperimente) oder dickes (Dunkelphasenexperimente) Filterpapier.
      HINWEIS: Während der aktiven Dunkelphase wird dickes Filterpapier verwendet, da es widerstandsfähiger gegen Schreddern ist als dünnes Filterpapier. Top-Kameras werden verwendet, um Urinflecken zu visualisieren, die sich während der Dunkelphase auf dickem Filterpapier abgelagert haben. Im Gegensatz dazu kommen während der Lichtphase die unteren Kameras zum Einsatz, da das Umgebungslicht verhindert, dass die oberen Kameras Urinflecken erkennen, die sich auf dem Filterpapier abgelagert haben. In diesem Fall wird dünnes Filterpapier verwendet. Wir haben festgestellt, dass die unteren Kameras bei der Erkennung kleiner Voiding-Ereignisse, die sich auf dickem Filterpapier abgelagert haben, unwirksam sind.
    2. Legen Sie auf das Filterpapier die folgenden Gegenstände: ein Plastik-Iglu (das einen Schlafplatz bietet), ein steriles 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zur Anreicherung und eine 60 mm x 15 mm große Plastikschale mit zwei oder drei Stücken Mäusetrockenfutter und 14–16 g Wasser in Form eines Gelpacks (nicht benetzendes Wassergel; Abbildung 2).
      HINWEIS: Die Verwendung von 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu Anreicherungszwecken war spezifisch für das in dieser Studie verwendete Gehäuse.
    3. Sobald die Aufnahmekammern fertig sind, legen Sie die Versuchsmäuse vorsichtig hinein, indem Sie sie sanft auf das Filterpapier legen. Achten Sie darauf, dass der Transfer der Tiere aus dem Stallkäfig in die Aufnahmekäfige mit minimalem Stress erfolgt.
    4. Sobald sich alle Versuchstiere mit geschlossenen Deckeln in ihren Aufnahmekäfigen befinden, decken Sie die Oberseite der Deckel mit einem saugfähigen Bank-Bluepad ab, um direkte Umgebungslichtreflexionen auf der Plexiglas-Deckeloberfläche zu minimieren.
    5. Schalten Sie die UV-Lampen in der unteren Kammer ein.
      HINWEIS: Die Tiere haben keinen direkten Kontakt mit dem UV-Licht. Das empfohlene UV-Licht ist im Abschnitt "Materialien" aufgeführt.
  3. RT-VSA-Aufnahmen
    1. Um Videos von der oberen und unteren Kamera aufzuzeichnen, verwenden Sie eine Videoüberwachungs-Aufzeichnungssoftware, die so konfiguriert werden kann, dass sie von mehreren Webcams oder Netzwerkkameras gleichzeitig aufzeichnet.
    2. Starten Sie nach dem Öffnen des Programms die Aufnahme, indem Sie im Programmfenster die Befehlstaste und R drücken. Führen Sie Videoaufnahmen mit einer Geschwindigkeit von 1 Bild pro Sekunde durch.
    3. Verlassen Sie unmittelbar nach Beginn der Aufnahmen den Raum und schließen Sie die Tür sanft. Stellen Sie sicher, dass der Raum während der gesamten Dauer des Experiments ruhig bleibt.
  4. RT-VSA-Aufnahmen beenden
    1. Rückkehr in den Behandlungsraum nach 7 h (Lichtphasenexperimente) bzw. am nächsten Morgen (Dunkelphasenexperimente).
    2. Stoppen Sie die Aufnahmen, indem Sie Befehlstaste und T drücken. Schalten Sie die UV-Lampen aus.
    3. Nach dem Stoppen der Aufnahme generiert die Software automatisch eine Filmdatei (im .m4v Format) für jede Kamera und speichert sie unter dem Namen der Kamera in einem zuvor ausgewählten Zielordner. Stellen Sie sicher, dass die Experimente in jedem Kameraordner nach Datum in Ordnern organisiert sind.
    4. Vergewissern Sie sich, dass in jedem Datums-/Experimentordner eine .m4v Datei und alle einzelnen .jpeg Dateien vorhanden sind, die den einzelnen Filmbildern entsprechen.
    5. HINWEIS: Die .jpeg Dateien können verwendet werden, um das Experiment wiederherzustellen, falls Filmdateien beschädigt werden.
    6. Erstellen Sie auf dem Desktop einen Ordner mit dem Namen und dem Datum des Experiments und übertragen Sie alle .m4v Dateien in diesen Ordner. Löschen Sie bei Bedarf die .jpeg Dateien, sobald die Filmdateien gespeichert und gesichert wurden.
    7. HINWEIS: Bei Lichtphasenexperimenten generiert die Software einen Film pro Kamera, während bei Dunkelphasenexperimenten zwei Filme für jede Kamera generiert werden. Dies liegt daran, dass nach Mitternacht eine neue .m4v Datei generiert wird, wenn sich das Datum ändert.
    8. Kopieren Sie den Ordner mit den Filmen auf ein Flash-Laufwerk, um ihn auf einem externen Computer zu analysieren. Dieser Schritt kann mehrere Minuten dauern und parallel zu den Schritten 3.5.1 bis 3.5.3 ausgeführt werden.
  5. Reinigung der Aufnahmekäfige und Rückführung der Versuchsmäuse in ihre Haltung
    1. Entfernen Sie das Bluepad, das die Deckel der Käfige bedeckt. Bringen Sie die Tiere aus den Aufnahmekäfigen in ihren Haltungskäfig.
    2. Entfernen Sie das Zubehör und die Lebensmittel in den Aufnahmekammern (z. B. Plastik-Iglus, Plastikröhrchen, Schale mit Resten von Chow und Wassergel und Filterpapier) und entsorgen Sie sie im biogefährlichen Abfall.
    3. Reinigen Sie die Käfige mit einem Handstaubsauger und entfernen Sie Futter und Kotpellets auf dem Boden des Käfigs. Besprühen Sie dann den Boden und die Innenwände des Käfigs mit 70% Ethanol und reinigen Sie den Innenraum mit einem weichen Tuch. Lassen Sie den Deckel der Käfige offen, damit sie an der Luft trocknen können.
    4. Stellen Sie den Stallkäfig mit den Tieren in einen zweiten Behälter und transportieren Sie die Tiere zurück an ihren Stallort.

4. Erstellung von Kalibrierkurven

Anmerkungen: Eine Kalibrierkurve ist erforderlich, um hohle Stellen in Urinvolumen umzuwandeln. Wenn Experimente während der hellen und dunklen Tagesphase durchgeführt werden, sollten zwei Kalibrierkurven erstellt werden, eine für jede verwendete Filterpapiersorte (dünnes und dickes Filterpapier). Kalibrierkurven werden doppelt erzeugt. Jede Wiederholung wird auf einem Filterpapier ausgeführt, das sich in einer RT-VSA-Aufnahmekammer befindet. Verwenden Sie aufgrund seiner komplexen Zusammensetzung und UV-Anregbarkeit Mäuseurin, um die Kalibrierungskurven zu erstellen.

  1. Sammlung von Mäuseurin
    1. Nehmen Sie ein Stück flexible transparente Folie (10 cm x 15 cm) und legen Sie es auf eine Bank.
    2. Schnappen Sie sich eine Maus am Schwanz und schrubben Sie sie. Massieren Sie sanft den Unterbauch, um das Wasserlassen zu induzieren. Sammeln Sie Urin auf der Oberfläche der transparenten Folie.
    3. Lassen Sie das Tier vorsichtig in seinem Käfig frei. Übertragen Sie den Urin mit einer Pipette von der Oberfläche der transparenten Folie in ein steriles 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie den Vorgang mit mehreren Mäusen, bis ~10 ml Mäuseurin gesammelt sind, sammeln Sie den Urin und lagern Sie ihn bei -20 °C.
      Anmerkungen: Insgesamt werden ~10 ml Mäuseurin benötigt, um doppelte Kalibrierungskurven für die helle und dunkle Phase zu erstellen. Um Versuchsmäuse nicht zu stressen, verwenden Sie keine Mäuse, die RT-VSA-Experimenten zur Urinentnahme unterzogen werden.
  2. Aufzeichnungen von Kalibrierkurven
    1. Tauen Sie den in Schritt 4.1 gesammelten Urin auf und mischen Sie ihn durch leichtes Vortexen für 10–15 s.
    2. Legen Sie je ein Stück dünnes Filterpapier (24,3 cm x 36,3 cm) in die beiden RT-VSA-Aufnahmekäfige.
    3. Pipettieren Sie die folgenden Urinvolumina (in μl) auf jedes der Filterpapiere: 2, 5, 10, 25, 50, 80, 100, 200, 300, 400, 500 und 750. Um eine Punktüberlappung durch Diffusion zu vermeiden, ordnen Sie die Punkte in ausreichendem Abstand zueinander zu.
    4. Schließen Sie den Deckel der Käfige und decken Sie sie mit Pads ab.
    5. Starten Sie die Aufnahme, indem Sie Befehlstaste und R drücken und dieselben Softwareparameter anwenden, die für die Aufzeichnung der Experimente verwendet werden (Schritt 3.3.).
    6. Registrieren Sie die Kalibrierkurve für 1 Stunde, um eine maximale Diffusion der Urinflecken zu ermöglichen. Drücken Sie die Befehlstaste und die Tastenkombination T , um die Aufnahme zu beenden.
    7. Erstellen Sie einen neuen Ordner auf dem Desktop, legen Sie die .m4v Dateien darin ab, und übertragen Sie die Daten dann zur anschließenden Analyse auf ein Flash-Laufwerk.
    8. Führen Sie ein ähnliches Verfahren durch, um doppelte Kurven mit dickem Filterpapier zu erzeugen. Fügen Sie in diesem Fall zusätzliche Schichten von Pads hinzu, um den Innenraum abzudunkeln und Dunkelphasenbedingungen zu simulieren.
  3. Analyse der Kalibrierkurvenaufzeichnungen
    1. Öffnen Sie die .m4v Dateien in einer Movie-Player-Software und maximieren Sie das Fenster, um den Bildschirm auszufüllen. Um die Kalibrierungskurven zu analysieren, die auf dickem Filterpapier durchgeführt wurden, verwenden Sie die Dateien, die mit den oberen Kameras erhalten wurden (Abbildung 3A). Um die Kalibrierungskurven zu analysieren, die auf dünnem Filterpapier durchgeführt wurden, verwenden Sie die Dateien, die mit den unteren Kameras erhalten wurden (Abbildung 3B).
    2. Spielen Sie die .m4v Datei ab, indem Sie den Zeitschieber vorwärts und rückwärts bewegen, um einen Überblick über den kompletten 1-Stunden-Kalibrierungskurvenfilm zu erhalten.
    3. Bestimmen Sie den Zeitraum, in dem die kleineren Urinflecken (<25 μl) die größte Intensität aufweisen und sich maximal ausgebreitet haben. Machen Sie innerhalb dieses Zeitraums einen Screenshot. Benennen Sie die Screenshot-Datei, und speichern Sie sie als .png-Datei (Abbildung 3A, oberer Bereich).
      HINWEIS: Screenshots werden durch Drücken der Taste F6 aufgenommen. Um F6 für die Screenshot-Erfassung einzurichten, wählen Sie: Systemeinstellungen > Tastatur > Tastenkombinationen und schreiben Sie F6 in das Feld rechts neben der Option Bild des Bildschirms als Datei speichern .
    4. Bestimmen Sie den Zeitraum, in dem die mittleren und großen Urinflecken (>50 μl) die maximale Fläche haben, und machen Sie einen Screenshot. Es ist möglich, dass einige der kleineren Urinflecken nicht mehr sichtbar sind, wenn die größeren Urinflecken eine maximale Diffusion aufweisen. Benennen Sie die Datei, und speichern Sie den Screenshot als .png Datei (Abbildung 3A, unteres Bild).
    6. Wählen Sie in der Symbolleiste das Symbol Polygonauswahl aus, und zeichnen Sie den Rand des Filterpapiers ab.
    7. Wählen Sie dann in der Menüleiste die Option Analysieren aus, wählen Sie im erweiterten Menü die Option Messungen festlegen aus, und wählen Sie im daraufhin angezeigten Fenster die Option Bereich aus. Klicken Sie auf OK. Dies ermöglicht es, Flächenwerte zu erhalten, wenn Schritt 4.3.8 ausgeführt wird.
    8. Wählen Sie als Nächstes in der Menüleiste erneut Analysieren aus, und wählen Sie Messen aus den erweiterten Optionen aus. Es öffnet sich ein Ergebnisfenster mit einem Spaltenbereich, der die Flächenwerte in Pixel2 anzeigt (Abbildung 4B–D).
    9. Wählen Sie in der Symbolleiste das Symbol Freihandauswahl aus und ziehen Sie damit eine Linie um den Umfang eines einzelnen Hohlraums. Messen Sie die Fläche wie in Schritt 4.3.8. Die Software aktualisiert die Ergebnistabelle, wenn neue Messungen durchgeführt werden. Der neue Zahlensatz wird unter den vorherigen angezeigt. Notieren Sie die Zahl, die unter dem Spaltenbereich des Ergebnisfensters für jeden analysierten Spot angezeigt wird (Abbildung 4E–G).
    10. Wiederholen Sie die Schritte 4.3.5 bis 4.3.7 für jeden der Replikatflecken.
    11. Stellen Sie die Gesamtfläche des Filterpapiers auf 100 % ein und berechnen Sie den Flächenanteil (% Fläche) für jeden Urinfleck. Diese Normalisierung korrigiert Fehler, die aufgrund von Unterschieden im Zoom oder in der Positionierung der Kameras auftreten können.
    12. Erstellen Sie eine neue XY-Tabelle in einem Grafikprogramm und fügen Sie die Werte des Urinvolumens (in μL) in die X-Spalte und die doppelten Werte der %-Fläche in die Y-Spalte ein.
    13. Wählen Sie dann Analyse > > XY-Analyse analysieren > Nichtlineare Regression (Kurvenanpassung) aus. Wählen Sie im angezeigten Parameterfenster Modell > Polynom > Polynom zweiter Ordnung (quadratisch) aus.
    14. Klicken Sie dann auf der Registerkarte Methode auf die folgenden Optionen, um die folgenden Auswahlmöglichkeiten zu markieren: Regression der kleinsten Quadrate, Keine Gewichtung und Betrachten Sie jeden Y-Wert als einzelnen Punkt.
    15. Wählen Sie auf der Registerkarte "Einschränkung" die Option "B0", "Einschränkungstyp" > "Konstante gleich" aus, und geben Sie in der Spalte "Wert" den Wert 0 ein. Klicken Sie auf OK.

5. Analyse der experimentellen Mäuseaufnahmen

  1. Öffnen Sie eine Filmdatei, die während der hellen Phase (untere Kamera) oder dunklen Phase (obere Kamera) zur Analyse aufgenommen wurde.
  2. Beurteilen Sie die Qualität der Filmdatei, indem Sie den Zeitscroller vorwärts und rückwärts bewegen und sicherstellen, dass das Filterpapier während des zu analysierenden Zeitfensters von 6 Stunden intakt bleibt (ohne zu reißen oder zu kauen). Wenn das Papier zerrissen ist, führen Sie keine weitere Analyse durch, da die Maus möglicherweise auf den freiliegenden Kunststoff uriniert hat, was nicht quantifiziert werden kann (Abbildung 5).
  3. Um Experimente zu analysieren, die in der Hell- oder Dunkelphase erfasst wurden, verwenden Sie den Befehl "Vorspulen" oder den Schieberegler der Zeitleiste, um zum gewünschten Zeitfenster zu wechseln. Die Blasenaktivität während der Lichtphase wird zwischen 11:00 und 17:00 Uhr (ZT = 4,0–10,0) und während der Dunkelphase zwischen Mitternacht und 06:00 Uhr (ZT = 17,0–23,0) aufgezeichnet.
  4. Spielen Sie den Film im Schnellvorlaufmodus ab, indem Sie auf das >> -Symbol klicken (oder manuell durch den Film scrollen), um nach Beweisen dafür zu suchen, dass die Maus ungültig wird. Der einfachste Weg, dies zu erkennen, besteht darin, nach dem plötzlichen Auftreten von hellen Urinflecken auf dem Filterpapier zu suchen. Ein weiterer Indikator besteht darin, nach Verhaltensänderungen zu suchen, einschließlich der Bewegung in die Ecken des Käfigs und einer kurzen Zeit der Inaktivität, wenn die Maus entleert wird.
    HINWEIS: Wenn man besser darin wird, Hohlräume zu erkennen, kann man die Geschwindigkeit des Scrollens oder des schnellen Vorlaufs erhöhen. Bei Mäusen mit bakterieller und chemisch induzierter Blasenentzündung, die eine sehr große Anzahl kleiner Hohlräumeaufweisen 4,34, kann man jedoch Blasenentleerungsereignisse übersehen, wenn man sich zu schnell durch den Film bewegt.
  5. Registrieren Sie den Zeitpunkt, zu dem die einzelnen Stornierungen auftreten. Üblicherweise wird die Zeit des Hohlraums beim ersten Anzeichen des Urinnachweises aufgezeichnet (Abbildung 6A,B).
  6. Um den Hohlraum zu messen, verwenden Sie zunächst die Bildlaufleiste, um sich in der Zeit vorwärts (oder rückwärts) zu bewegen, und suchen Sie nach dem Zeitpunkt, an dem die maximale Diffusion des Urinflecks stattgefunden hat. Halten Sie den Film an dieser Stelle an und machen Sie einen Screenshot, wie in Schritt 4.3.3 beschrieben. Platzieren Sie den Computermauspfeil an der zu analysierenden Stelle, sodass die gewünschte Stelle im Screenshot markiert ist (Abbildung 6C,D).
  7. Benennen Sie die Screenshot-Datei mit korrelativen Zahlen, um die Reihenfolge des Erscheinens im Film zu berücksichtigen.
  8. Fahren Sie mit der Analyse der Datei fort und wiederholen Sie die Schritte 5.5 und 5.7 für jede leere Stelle im Film. Nachdem alle Hohlräume analysiert wurden, wird die Gesamtfläche des Filterpapiers gemessen, indem ein Screenshot gemacht und die in 4.3.6 beschriebenen Schritte ausgeführt werden.
  9. Berechnen Sie die %-Fläche jedes Urinflecks, wie in Schritt 4.3.9 beschrieben. Wandeln Sie die Werte der %-Fläche in Urinvolumen (μL) für jeden Hohlraum um, indem Sie die in Schritt 4 generierten Kalibrierkurven und die Interpolationsfunktion in der Grafiksoftware verwenden.
    1. Öffnen Sie in der Grafiksoftware die XY-Tabelle mit den Daten der Kalibrierkurve und geben Sie die %-Flächenwerte in die Y-Spalte unterhalb des letzten Wertes der Kalibrierkurve ein (Abbildung 7A).
    2. Klicken Sie auf die Registerkarte Ergebnistabelle , und wählen Sie auf der Registerkarte Modell die Option Unbekannte aus Standardkurve interpolieren aus , und drücken Sie OK. Eine Registerkarte mit dem Namen Interpolierte X-Mittelwerte wird neben der Registerkarte Ergebnistabelle angezeigt. Diese Registerkarte enthält eine Tabelle mit den interpolierten Werten, die dem Urinvolumen in μl für jeden Hohlraum entsprechen. (Abbildung 7A,B).
  10. Wiederholen Sie die Schritte 5.1 bis 5.9, um alle Versuchsmäuse zu analysieren.
  11. Erstellen Sie eine Arbeitsmappendatei, die die Daten aus den Schritten 5.5 bis 5.10 enthält, indem Sie eine Tabelle pro Maus verwenden (Abbildung 7C). Erstellen Sie eine Datei für die Experimente mit der hellen Phase und eine weitere für die Experimente mit der dunklen Phase. Diese Stammdaten enthalten alle Rohdaten und notwendigen Berechnungen, die für weitere Analysen verwendet werden.

6. Analyse des Urinmusters von Versuchsmäusen

  1. Generieren Sie primäre und sekundäre Hohlraumprofile (Abbildung 8A, B und Abbildung 9).
    HINWEIS: Laut Häufigkeitsverteilungsstudien 23 machen Hohlraumflecken mit einer Größe von ≥20 μl in der Regel >95 % des gesamten Hohlraumvolumens aus und gelten als primäre Hohlraumflecken (PVS)8,23,35. Void-Spots mit einer Größe von ≤20 μl werden als sekundäre oder kleine Void-Spots (SVS) bezeichnet. Es hat sich gezeigt, dass die Unterscheidung zwischen PVS und SVS ein nützlicher Ansatz zur Charakterisierung von Voiding-Phänotypen ist. Eine erhöhte Anzahl von SVS deutet auf eine Blasenentleerungsdysfunktion hin35.
    1. Klassifizieren Sie die Spots anhand ihres Volumens anhand ihres Volumens als PVS, wenn ihr Volumen ≥20 μl beträgt, oder als SVS, wenn ihr Volumen <20 μl beträgt.
    2. Zählen Sie die Anzahl und berechnen Sie das durchschnittliche entleerte Volumen und das Gesamtvolumen für die PVS. Zählen Sie die Anzahl und berechnen Sie das Gesamtvolumen für die SVS.
    3. Generieren Sie einen Diagrammbalken, der die Kontrolle mit den behandelten Mäusen für jeden der berechneten Parameter vergleicht: Anzahl der PVS, ungültiges Volumen der PVS, Gesamtvolumen der PVS, Anzahl der SVS, Gesamtvolumen der SVS.
  2. Optional: Generieren Sie ein Diagramm des kumulativen Hohlraumvolumens (Treppenfunktion), um das Hohlraumverhalten im Zeitverlauf darzustellen (Abbildung 10 und Abbildung 11).
    1. Öffnen Sie die Masterdatei der Arbeitsmappe, und konvertieren Sie die Zeit des Stornierens, die in Stunden, Minuten und Sekunden ausgedrückt wird, in die Dezimalform. Berechnen Sie das kumulative Urinvolumen (in μl) für jeden Zeitpunkt.
    2. Generieren Sie in der Grafiksoftware eine XY-Tabelle mit der Zeit in Dezimalform in der X-Spalte und den kumulativen Urinvolumina in der Y-Spalte. Kopieren Sie die Zeit- und Urinvolumendaten in die Tabelle. Fügen Sie (0; 0) und (6; Maximalwert) Datenpunkte hinzu. Diese Punkte sind notwendig, um die horizontalen Linien des Diagramms zu Beginn des Experiments (Zeit: 0 h) zu vervollständigen, wenn das entleerte Volumen Null ist (0; 0), und am Ende des Experiments (Zeit: 6 h), wenn der kumulative Wert des entleerten Urins gleich dem Wert ist, der für das letzte Entleerungsereignis (6; Maximalwert) erhalten wurde.
    3. Doppelklicken Sie auf das Diagramm. Das Fenster Diagramm formatieren sollte angezeigt werden. Wählen Sie die Registerkarte Darstellung aus, deaktivieren Sie die Schaltfläche für Symbole anzeigen, und klicken Sie, um Verbindungslinie/Kurve anzeigen auszuwählen. Klicken Sie auf die Option Stil und wählen Sie Überleben.

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Ergebnisse

Entleerungsverhalten von urothelialen Piezo1/2 Knockout-Mäusen

Es wird angenommen, dass das Urothel während der Speicherphase des Miktionszyklus die Spannung des in der Blase angesammelten Urins wahrnimmt und diesen mechanischen Reiz in zelluläre Reaktionen wie die serosale ATP-Freisetzung umwandelt 1,3. Wir konnten bereits zeigen, dass mechanisch aktivierte PIEZO1- und PIEZO2-Kanäle im Mausurothel exprimi...

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Diskussion

Die Integration von Videoüberwachung ist eine kostengünstige Modifikation, die mehrere Vorteile gegenüber dem klassischen VSA bietet. Beim klassischen VSA, der typischerweise als Endpunkt-Assay verwendet wird, ist es schwierig, überlappende Void-Spots zu unterscheiden. Dies ist kein triviales Problem, da Mäuse dazu neigen, mehrmals in denselben Bereich zu urinieren, wenn der Test über mehrere Stunden verlängert wird, typischerweise in den Ecken ihres Käfigs. Der erste Vorteil von RT-VSA besteht also darin, dass d...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch einen NIH-Zuschuss R01DK119183 (an G.A. und M.D.C.), einen Pilotprojektpreis durch P30DK079307 (an M.G.D.), einen Karriereentwicklungspreis der American Urology Association und einen Zuschuss der Winters Foundation (an N.M.) sowie durch die Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores des Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307) unterstützt.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 10 inches80/201010Amount: 20
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 12 inches80/201010Amount: 6
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 40 inches80/201010Amount: 4
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 14.75 inches80/201010Amount: 12
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 32 inches80/201010Amount: 5
1/4-20 Double Slide-in Economy T-Nut80/203280Amount: 16
1/4-20 Triple Slide-in Economy T-Nut80/203287Amount: 18
10 & 25 Series 2 Hole - 18mm Slotted Inside Corner Bracket with Dual Support80/2014061Amount: 6
10 Series 3 Hole - Straight Flat Plate80/204118Amount: 8
10 Series 5 Hole - "L" Flat Plate80/204081Amount: 8
10 Series 5 Hole - "T" Flat Plate80/204080Amount: 8
10 Series 5 Hole - Tee Flat Plate80/204140Amount: 2
10 Series Standard Lift-Off Hinge - Right Hand Assembly80/202064Amount: 2
10 to 15 Series 2 Hole - Lite Transition Inside Corner Bracket80/204509Amount: 6
24”-long UV tube lightsADJ Products LLCT8-F20BLB24Amount: 2
20W bulb – 24” Wavelength: 365nm
Acrylic Mirror SheetProfesional PlasticsAmount: 1
82.5 cm x 26.5 cm
Acrylic Mirror SheetProfesional PlasticsAmount: 2
26.5 cm X 30.5 cm
Acrylic Mirror SheetProfesional PlasticsAmount: 2
82.5 cm x 30.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance)80/2065-2641Amount: 2
4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 26.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance)80/2065-2641Amount: 4
4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance)80/2065-2641Amount: 4
4.5mm Thick, Clear, 26.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance)80/2065-2641Amount: 4
4.5mm Thick, Clear 37.5 cm x 23.9 cm
AR polycarbonate (UV resistance)80/2065-2641Amount: 4
4.5mm Thick, Clear , 24.4 cm x 23.9 cm
Chromatography paper (thin paper) Thermo Fisher Scientific57144
Cosmos blotting paper (thick paper)Blick Art Materials10422-1005
ExcelMicrosoft Corporation
GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersion 9.4.0graphing and statistics software
ImageJ FIJINIH
ParafilmMercktransparent film
Quick Time Player 10.5 software Applemultimedia player
Security spyBen softwarevideo surveillance software system
Standard End Fastener, 1/4-2080/203381Amount: 80
UV transmitting acrylicSpartechPolycast Solacryl SUVTAmount: 2
38.5 cm x 26.5 cm 
Water gel: HydroGelClearH2O  70-01-5022(https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/)
WebcamLogitechC930eAmount: 4

Referenzen

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