Klinische Mikrofluidik-Chip-Plattform zur Isolierung vielseitig zirkulierender Tumorzellen

Zusammenfassung

Der klinische Mikrofluidik-Chip ist eine wichtige biomedizinische Analysetechnik, die die Vorverarbeitung klinischer Patientenblutproben vereinfacht und zirkulierende Tumorzellen (CTCs) in situ auf dem Chip immunfluoreszent färbt, was den schnellen Nachweis und die Identifizierung eines einzelnen CTC ermöglicht.

Zusammenfassung

Zirkulierende Tumorzellen (CTCs) sind für die Krebsprognose, -diagnose und -therapie von Bedeutung. Die CTC-Zählung ist für die Bestimmung der Patientenerkrankung von entscheidender Bedeutung, da CTCs selten und heterogen sind. CTCs lösen sich vom Primärtumor, gelangen in den Blutkreislauf und wachsen möglicherweise an entfernten Stellen, wodurch der Tumor metastasiert wird. Da CTCs ähnliche Informationen wie der Primärtumor enthalten, kann die CTC-Isolierung und die anschließende Charakterisierung bei der Überwachung und Diagnose von Krebs von entscheidender Bedeutung sein. Die Enumeration, Affinitätsmodifikation und klinische Immunfluoreszenzfärbung seltener CTCs sind leistungsfähige Methoden für die CTC-Isolierung, da sie die notwendigen Elemente mit hoher Sensitivität liefern. Mikrofluidische Chips bieten eine Flüssigbiopsiemethode, die für die Patienten schmerzfrei ist. In dieser Arbeit stellen wir eine Liste von Protokollen für klinische mikrofluidische Chips vor, eine vielseitige CTC-Isolierungsplattform, die eine Reihe von Funktionalitäten und Diensten enthält, die für die CTC-Trennung, -Analyse und -Frühdiagnose erforderlich sind, und so die biomolekulare Analyse und Krebsbehandlung erleichtern. Das Programm umfasst die Zählung seltener Tumorzellen, die klinische Vorverarbeitung des Patientenblutes, einschließlich der Lyse roter Blutkörperchen, sowie die Isolierung und Erkennung von CTCs in situ auf mikrofluidischen Chips. Das Programm ermöglicht die präzise Zählung von Tumorzellen oder CTCs. Darüber hinaus enthält das Programm ein Tool, das die CTC-Isolierung mit vielseitigen mikrofluidischen Chips und die Immunfluoreszenzidentifikation in situ auf den Chips umfasst, gefolgt von einer biomolekularen Analyse.

Einleitung

Zirkulierende Tumorzellen (CTCs) sind für die Krebsprognose, -diagnose und -therapie von Bedeutung. Die CTC-Zählung ist von entscheidender Bedeutung, da CTCs selten und heterogen sind. Die Enumeration, Affinitätsmodifikation und klinische Immunfluoreszenzfärbung seltener CTCs sind leistungsfähige Techniken für die CTC-Isolierung, da sie die notwendigen Elemente mit hoher Sensitivität bieten¹. Die seltene Anzahl von Tumorzellen, die mit normalem Blut vermischt sind, ahmt echtes Patientenblut sehr gut nach, da 2-3 ml echtes Patientenblut nur 1-10 CTCs enthalten. Um ein kritisches experimentelles Problem zu lösen, anstatt eine große Anzahl von Tumorzellen zu verwenden, die in PBS eingeführt oder mit normalem Blut vermischt wurden, liefert uns die Verwendung einer seltenen Anzahl von Tumorzellen eine geringe Anzahl von Blutzellen, was bei der Durchführung eines Experiments näher an der Realität ist.

Krebs ist die häufigste Todesursache weltweit². CTCs sind Tumorzellen, die vom ursprünglichen Tumor abgestoßen werden und im Blut- und Lymphkreislauf zirkulieren³. Wenn sich CTCs in eine neue überlebensfähige Umgebung bewegen, wachsen sie wie ein zweiter Tumor. Dies wird als Metastasierung bezeichnet und ist für 90 % der Todesfälle bei Krebspatienten verantwortlich⁴. CTCs sind entscheidend für die Prognose, die Frühdiagnose und das Verständnis der Mechanismen von Krebs. CTCs sind jedoch extrem selten und heterogen^{im Blut der} Patienten ^5,6.

Mikrofluidische Chips bieten eine flüssige Biopsie, die nicht in den Tumor eindringt. Sie haben den Vorteil, dass sie tragbar und kostengünstig sind und über eine auf die Zellen abgestimmte Waage verfügen. Die Isolierung von CTCs mit mikrofluidischen Chips wird hauptsächlich in zwei Arten eingeteilt: affinitätsbasiert, die auf der Antigen-Antikörper-Bindung beruht ^7,8,9 und die ursprüngliche und am weitesten verbreitete Methode der CTC-Isolierung ist; und physikalische Chips, die Größen- und Verformbarkeitsunterschiede zwischen Tumorzellen und Blutzellen 10,11,12,13,14,15 nutzen^, sind markierungsfrei und einfach zu bedienen. Der Vorteil von Mikrofluidik-Chips gegenüber alternativen Techniken besteht darin, dass der physikalisch basierte Ansatz von Mikrofiltern mit großen Ellipsen CTCs mit hoher Abscheideeffizienz fest einfängt. Der Grund dafür ist, dass Ellipsen-Mikropfosten in schmalen Tunneln mit Linien-Linien-Lücken organisiert sind. Die Linien-Linien-Lücken unterscheiden sich von den herkömmlichen Punkt-Punkt-Lücken, die von Mikropfosten wie Rauten-Mikropfosten gebildet werden. Die Wellenchip-basierte Erfassung von CTCs kombiniert sowohl eine auf physikalischen Eigenschaften basierende als auch eine affinitätsbasierte Isolierung. Der Wellenchip-basierte Einfang umfasst 30 wellenförmige Arrays, bei denen der Antikörper von Anti-EpCAM auf kreisförmigen Mikropfosten beschichtet ist. Die CTCs werden von den kleinen Lücken erfasst, und die großen Lücken werden genutzt, um die Durchflussrate zu beschleunigen. Die verpassten CTCs müssen die kleinen Lücken im nächsten Array passieren und werden von der affinitätsbasierten Isolierung erfasst, die in den Chip¹⁶ integriert ist.

Ziel des Protokolls ist es, die Zählung seltener Tumorzellen und die klinische Analyse von CTCs mit mikrofluidischen Chips zu demonstrieren. Das Protokoll beschreibt die CTC-Isolierungsschritte, die Gewinnung einer geringen Anzahl von Tumorzellen, die klinisch-physikalische Trennung von Small-Ellipse-Filtern, Big-Ellipse-Filtern und Trapezfiltern, die Affinitätsmodifikation und die Anreicherung¹⁷.

Protokoll

Die Blutproben der Patienten wurden vom Longhua Hospital geliefert, das der Shanghai Medical University angegliedert ist.Das Protokoll folgt den Richtlinien der Ethikkommission für Humanforschung des Dritten Krankenhauses der Universität Peking. Die Patienten erhielten eine Einverständniserklärung für die Verwendung der Proben zu Forschungszwecken.

1. Pre-Experiment zur Überprüfung der Einfangeffizienz mit kultivierten Tumorzellen

1. Kultivierung der Tumorzellen MCF-7, MDA-MB-231 und HeLa zur Bestimmung der Einfangeffizienz. Verdünnen Sie die Tumorzellsuspension, zählen Sie die Anzahl der Tumorzellen und wiederholen Sie den Vorgang, bis die gewünschte Anzahl von Zellen in 1 ml PBS erreicht ist.
   1. Kultivieren Sie die Zellen in einem Zellkulturkolben mit einer Ausgangszellzahl von ~ 1 x 10⁵ Zellen in 1 ml modifiziertem Eagle's Medium (DMEM) von Dulbecco, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin. Inkubieren in einer befeuchteten Atmosphäre bei 37 °C mit einer 5%igen CO_{2 -} Atmosphäre.
   2. Wenn die Zelllinien als adhärente Monoschichten zu 95 % Konfluenz wachsen, lösen Sie sie 2 Minuten lang mit 0,25%iger Trypsinlösung von den Kulturschalen, wie in Chen et ^al.16 beschrieben.
   3. Färben Sie die Tumorzellen mit Calcein AM. Geben Sie 3 μl Calcein AM in die Kulturschale und lassen Sie die Schale 30 Minuten lang im Inkubator. Dann verdauen Sie alle Zellen mit Trypsin.
   4. Zählen Sie die kultivierten Tumorzellen in PBS mit einer Zellzählkammer und verdünnen Sie, bis 100 Tumorzellen pro 1 ml PBS erhalten werden.
      HINWEIS: Um die Zellzahl genau zu zählen, nehmen Sie 50 μl der erhaltenen Zellsuspension, um mit einem Mikroskop zu sehen, ob die Anzahl der Tumorzellen darin fünf beträgt oder nicht. Bestimmen Sie das Volumen der Zellsuspension, das eingenommen werden muss, um 100 Tumorzellen zu erhalten, entsprechend der tatsächlichen Anzahl von Tumorzellen in 50 μl Zellsuspension.
2. Die Zellsuspension mit 100 Tumorzellen pro 1 ml PBS wird mit einer Spritze mit einer Spritzenpumpe mit unterschiedlichen Flussraten von 0,5 ml/h, 1 ml/h, 2 ml/h, 3 ml/h, 4 ml/h und 5 ml/h in den mikrofluidischen Chip eingeführt. Ermitteln Sie die Abscheideeffizienz für die verschiedenen Durchflussraten und bestimmen Sie die optimale Durchflussrate.
   1. Zählen Sie die Anzahl der Tumorzellen, die auf dem Chip erfasst wurden und aus dem Auslass herausfließen. Berechnen Sie die Erfassungseffizienz wie folgt:
      Erfassungseffizienz = Anzahl der erfassten Zellen/(Anzahl der erfassten Zellen + Anzahl der ausfließenden Zellen) × 100 %
   2. Wiederholen Sie den Vorgang, um die Einfangeffizienz für eine unterschiedliche Anzahl von Tumorzellen von 10 bis 100 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100) zu erhalten.
3. Testen und validieren Sie den Mikrofluidik-Chip auf eine seltene Anzahl von Tumorzellen. Injizieren Sie diese 10 Probensuspensionen in die Mikrofluidik-Chips mit einer Hohlnadel mit einem Mikropipettenzieher, um 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 und 10 Tumorzellen zu aspirieren, die in 1 ml PBS verdünnt sind. Erkennen und zählen Sie die Anzahl der Tumorzellen für jede Probe nach ihrer Erfassung auf dem Chip.
   HINWEIS: Die Hohlnadel ist ca. 3 cm lang und hat einen Außendurchmesser von 1 mm.
4. Führen Sie klinische Tests vor dem Experiment auf Tumorzellen durch, die in normale Blutproben gestochen wurden.
   1. Färben Sie die Tumorzellen mit Calcein AM und zählen Sie dann 100 Tumorzellen in 5 μl PBS. Spicken Sie diese Zellen in 1 ml vollwertige Blutproben. Führen Sie diese Zellen in den Chip ein und zählen Sie die Anzahl der auf dem Chip erfassten Tumorzellen mit grüner Immunfluoreszenz. Führen Sie eine In-vivo-Enumeration auf dem Chip durch, wie oben beschrieben, und berechnen Sie die Abscheideeffizienz nach der Abscheidung.
   2. Wiederholen Sie Schritt 1.4.1 für neun weitere Konzentrationen der Tumorzellzahl von 10 bis 90 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90).
   3. Zählen Sie 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 und 10 Tumorzellen wie in Schritt 1.3 beschrieben ohne Färbung auf, stechen Sie in 1 ml normales Vollblut, führen Sie diese Proben in den mikrofluidischen Chip ein und fangen Sie die Tumorzellen auf dem Chip ein.
   4. Färbung auf dem Chip mit Hoechst, CK-FITC und CD45-PE. Geben Sie 3-5 μl Fluoreszenzfarbstoff in 20-30 μl PBS und geben Sie diese Lösung dann mit einer Spritze auf den Mikrofluidik-Chip. Zählen Sie die Anzahl der auf dem Chip eingefangenen Tumorzellen mit blauer und grüner Immunfluoreszenz, um die Einfangeffizienz zu bestimmen.
5. Modifikation des Mikrofluidik-Chips für die affinitätsbasierte Erfassung von Anti-EpCAM.
   HINWEIS: Da der Wave-Chip sowohl affinitätsbasierte als auch auf physikalischen Eigenschaften basierende Isolierung kombiniert, modifizieren Sie den Chip mit Agenten.
   1. Die Oberfläche des Chips wird mit 100 μl 4% (v/v) 3-Mercaptopropyltrimethoxysilan in Ethanol bei Raumtemperatur für 45 Minuten modifiziert. Führen Sie diese Lösung vorsichtig und langsam in den Chip ein, falls sie die innere Struktur des Chips zerstört, insbesondere die Verklebung der Oberfläche und des Substratglases.
      HINWEIS: Die Chipoberfläche wird mit Mercaptosilan modifiziert. Die Wechselwirkungen, die auf dem Chip auftreten, werden durch chemische Bindungen bestimmt. Chemische Bindungen werden hergestellt, um die Bindung des mit dem Antigen modifizierten Antikörpers zu realisieren. Im Inneren des Chips werden verschiedene Reagenzien modifiziert, um chemische Bindungen herzustellen, die sich miteinander verbinden. Das letzte Reagenz, das modifiziert wird, ist ein antiepitheliales Adhäsionsmolekül (anti-EpCAM). Das Tumorzelloberflächenantigen von EpCAM wird mit Anti-EpCAM im Chip kombiniert, um den Einfang der CTCs zu realisieren.
   2. 3x mit Ethanol waschen. Geben Sie 100 μl des Haftvermittlers N-y-Maleimidobutyryloxysuccinimidester (GMBS, 1 μM) auf den Chip und lassen Sie ihn 30 Minuten lang interagieren.
   3. 3x mit PBS waschen. Verwenden Sie eine Spritze, um 1 ml PBS zum Waschen auf den Chip zu geben.
   4. Behandeln Sie den Chip mit 30-40 μl 10 μg/ml Neutravidin bei Raumtemperatur für 30 Minuten, was zu einer Immobilisierung der Zellen auf dem GMBS führt, und spülen Sie dann mit PBS, um überschüssiges Avidin zu entfernen.
   5. Modifizieren Sie den Chip mit 3 μl antibiotinyliertem EpCAM-Antikörper in einer Konzentration von 10 μg/ml in 100 μl PBS mit 1 % (w/v) BSA. Bewahren Sie dies über Nacht auf.

2. Klinisches Experiment auf dem Chip zur Zählung der zirkulierenden Tumorzellen (CTCs)

1. Verarbeiten Sie Blutproben von klinischen Krebspatienten mit einer RBCL-Lösung (Rote Blutkörperchenlyse) vor oder geben Sie 2-3 ml der Blutprobe mit einer Spritze direkt auf den Mikrofluidik-Chip.
   1. Führen Sie eine Vorverarbeitung durch, die etwa 30 Minuten dauert. Entnehmen Sie Vollblutproben in gerinnungshemmenden Röhrchen. 6-9 ml RBS-Lyselösung in 2-3 ml Blut geben. Bei 111 x g 5-8 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und die obere Schicht der roten klaren Flüssigkeit entsorgen.
2. Erfassen, färben, erkennen und zählen Sie die Zellen auf dem Chip wie unten beschrieben.
   1. Fangen Sie die Zellen auf dem Chip ein, wie in Schritt 1 beschrieben.Färben Sie den Chip für die CTCs, die mit Hoechst, CK-FITC und CD45-PE erfasst wurden. CK-FITC ist ein spezifischer Farbstoff für Tumorzellen und CD45-PE für weiße Blutkörperchen.
   2. Fügen Sie 3 μl CK-FITC zu 20 μl PBS hinzu. Führen Sie diese in die Spritze ein und pumpen Sie das verdünnte CK-FITC auf den Chip. 30 Min. einwirken lassen. Geben Sie 300 μl PBS auf den Chip, um den Chip zu waschen.
   3. Geben Sie 3 μl CD45-PE zu 20 μl PBS. Führen Sie diese in die Spritze ein und pumpen Sie das verdünnte CD45-PE auf den Chip. 30 Min. ziehen lassen. Geben Sie 300 μl PBS auf den Chip, um den Chip zu waschen.
   4. Identifizieren Sie die CTCs mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop mit 20- oder 40-facher Vergrößerung. CTCs emittieren sowohl blaue als auch grüne Fluoreszenz, und weiße Blutkörperchen (Leukozyten) emittieren sowohl blaue als auch rote Fluoreszenz. Identifizieren Sie die CTCs mit blauer und grüner Fluoreszenz und die Leukozyten mit blauer und roter Fluoreszenz.
   5. Zählen Sie anhand der Immunfluoreszenzbilder die Anzahl der auf dem Chip erfassten CTCs auf. Zählen Sie die CTCs als Hoechst+/CK-FITC+/CD45− und die Leukozyten als Hoechst+/CK-FITC−/CD45+ auf.
3. Reichern Sie die eingefangenen CTCs an, indem Sie mit PBS durch die Spritze in umgekehrter Richtung auf den Mikrofluidik-Chip spülen, um die auf dem Chip erfassten CTCs aus dem Einlass zu sammeln. Verwenden Sie eine Spritze mit 1 ml PBS, führen Sie sie aus dem Auslass ein, um die auf dem Chip erfassten CTCs innerhalb von 2-3 Minuten anzureichern, und sammeln Sie sie aus dem Einlass. Verwenden Sie 1 ml PBS für jeden Waschschritt und wiederholen Sie den Vorgang 3x.
4. Färben Sie die auf dem Mikrofluidik-Chip erfassten Tumorzellen oder CTCs wie unten beschrieben.
   1. Färben Sie mit Calcein AM. Man fügt 5 μl Calcein AM zu 20 μl PBS hinzu, färbt die Zellen 30 Minuten lang, zentrifugiert dann bei 111 x g für 2 Minuten bei Raumtemperatur, um Tumorzellen zu erhalten, und suspendiert in 1 ml PBS.
   2. Um die Zellkerne zu identifizieren, fügen Sie dem Chip 20 μl DAPI-Lösung (10 μl DAPI-Reagenz in 20 μl PBS) mit der optimalen Flussrate von 1 ml/h für Big-Ellipse-Mikrofilter und 1,5 mL/h für trapezförmige Mikrofilter hinzu. 20 μl Anti-Zytokeratin-Stammlösung (3 μl Anti-Zytokeratin-Antikörper in 20 μl PBS) durchlaufen, um 30 Minuten lang mit dem Chip zu reagieren.
   3. Färben Sie die auf dem Chip erfassten Leukozyten. Nachdem die CTCs auf dem Chip erfasst wurden, werden 25 μl Anti-CD45-Antikörperlösung (5 μl Anti-CD45-Lösung in 20 μl PBS) in den Chip gegeben und 30 Minuten lang gefärbt. Waschen Sie mit PBS und identifizieren Sie die Epithelzellen mit blauer und grüner Fluoreszenz.
5. Führen Sie die Immunfluoreszenzidentifikation mit Fluoreszenzmikroskopie wie unten beschrieben durch.
   1. Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop und regen Sie die Probe mit dem blauen Laser an. Finden Sie die Zellen, die blaue Fluoreszenz aussenden, bei denen es sich um kernhaltige Zellen handelt. Verwenden Sie eine der folgenden Vergrößerungen: 10x, 20x oder 40x. Finden Sie ein freies Feld für die Tumorzelle. Verwenden Sie für die blaue Laserquelle eine Anregungsplattenwellenlänge von 420-485 nm und eine Wellenlänge der Emissionsplatte von 515 nm.
   2. Verwenden Sie eine andere Laserquelle, ohne die Proben zu bewegen. Drehen Sie das Fluoreszenzmikroskop und regen Sie die Probe mit dem grünen Laser an. Finden Sie die Zellen, die grüne Fluoreszenz aussenden, was auf Tumorzellen hinweist. Nehmen Sie mit dieser grünen Laserquelle Bilder des gleichen Feldes mit der gleichen Vergrößerung auf. Die Zellen, die sowohl blaue als auch grüne Fluoreszenz aussenden, werden als Tumorzellen erkannt. Verwenden Sie für die grüne Laserquelle eine Anregungsplattenwellenlänge von 460-550 nm und eine Wellenlänge der Emissionsplatte von 590 nm
   3. Verwenden Sie eine andere Laserquelle, ohne die Proben zu bewegen. Drehen Sie das Fluoreszenzmikroskop und regen Sie die Probe mit dem roten Laser an. Finde die Zellen, die rote Fluoreszenz aussenden. Nehmen Sie mit dieser roten Laserquelle Bilder des gleichen Feldes mit der gleichen Vergrößerung auf. Die Zellen, die sowohl blaue als auch rote Fluoreszenz aussenden, werden als weiße Blutkörperchen erkannt.
   4. Speichern Sie das Bild, um es mit den oben genannten Laserquellen zu erhalten. Nehmen Sie mehrere Bilder desselben Feldes mit verschiedenfarbigen Lichtern auf.
   5. Verwenden Sie ultraviolettes Licht mit einer Anregungsplattenwellenlänge von 330-400 nm und einer Wellenlänge der Emissionsplatte von 425 nm. Verwenden Sie violettes Licht mit einer Anregungsplattenwellenlänge von 395-415 nm und einer Wellenlänge der Emissionsplatte von 455 nm.
6. Berechnen Sie die Abscheideeffizienz wie in Schritt 1.2.1 beschrieben.

Ergebnisse

Das gesamte Setup besteht aus einer Spritzenpumpe, einer Spritze und einem Mikrofluidik-Chip. Die Zellsuspension in der Spritze wird mit der Spritzenpumpe verbunden, und die Zellsuspension wird in den Mikrofluidik-Chip eingeführt, um die Zellen einzufangen. Die Erfassungseffizienz für alle verwendeten Mikrofluidik-Chips lag bei etwa 90 % oder mehr. Für den Wellenchip haben wir Mikrostrukturen mit unterschiedlichen Lücken entworfen. Die kleinen Lücken werden verwendet, um die CTCs zu erfassen, und die großen Lücken...

Diskussion

Die Prognose und Früherkennung von Krebserkrankungen haben einen signifikanten Einfluss auf die Krebsbehandlung¹. Die CTC-Isolierung mit mikrofluidischen Chips ermöglicht eine Flüssigbiopsie ohne Invasion. CTCs sind jedoch extrem selten und heterogen im Blut¹, was die Isolierung von CTCs erschwert. CTCs haben ähnliche Eigenschaften wie die ursprünglichen Tumorquellen, aus denen sie stammen. Somit spielen CTCs eine wichtige Rolle bei der Krebsmetastasierung

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calcein AM	BIOTIUM	80011
calibrated microcapillary pipettes	Sigma- Aldrich	P0799
CD45-PE	BD Biosciences	560975
CK-FITC	BD Biosciences	347653	cytokeratin monoclonal antibody
DMEM	HyClone	SH30081.05
fetal bovine serum (FBS)	GIBCO,USA	26140
Hoechst 33342	Molecular Probes, Solarbio Corp., China	C0031
penicillin-streptomycin	Ying Reliable biotechnology, China
Red blood cells lysis (RBCL)	Solarbio, Beijing	R1010