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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Oktanol-unterstützte Liposomenassemblierung (OLA), eine mikrofluidische Technik zur Erzeugung biokompatibler Liposomen. OLA produziert monodisperse, mikrometergroße Liposomen mit effizienter Verkapselung, die sofortige On-Chip-Experimente ermöglichen. Dieses Protokoll soll sich besonders für die synthetische Biologie und die synthetische Zellforschung eignen.

Zusammenfassung

Die Mikrofluidik ist ein weit verbreitetes Werkzeug, um Tröpfchen und Vesikel verschiedener Art kontrolliert und mit hohem Durchsatz zu erzeugen. Liposomen sind vereinfachte zelluläre Nachahmer, die aus einem wässrigen Inneren bestehen, das von einer Lipiddoppelschicht umgeben ist. Sie sind wertvoll für das Design synthetischer Zellen und das Verständnis der Grundlagen biologischer Zellen in vitro und sind wichtig für angewandte Wissenschaften, wie z. B. die Frachtlieferung für therapeutische Anwendungen. Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Arbeitsprotokoll für eine mikrofluidische On-Chip-Technik, die Oktanol-unterstützte Liposomenassemblierung (OLA), zur Herstellung monodisperser, mikrometergroßer, biokompatibler Liposomen. OLA funktioniert ähnlich wie das Blasblasen, bei dem eine innere wässrige (IA) Phase und eine umgebende lipidtragende 1-Oktanol-Phase durch tensidhaltige äußere Flüssigkeitsströme abgeklemmt werden. Dadurch entstehen leicht Doppelemulsionströpfchen mit hervorstehenden Oktanoltaschen. Wenn sich die Lipiddoppelschicht an der Tröpfchengrenzfläche zusammensetzt, löst sich die Tasche spontan ab, wodurch ein unilamellares Liposom entsteht, das für weitere Manipulationen und Experimente bereit ist. OLA bietet mehrere Vorteile, wie z. B. eine stetige Liposomenbildung (>10 Hz), eine effiziente Verkapselung von Biomaterialien und monodisperse Liposomenpopulationen, und erfordert sehr kleine Probenvolumina (~50 μl), was bei der Arbeit mit wertvollen Biologika entscheidend sein kann. Die Studie enthält Details zur Mikrofabrikation, Softlithographie und Oberflächenpassivierung, die für die Etablierung der OLA-Technologie im Labor erforderlich sind. Ein Proof-of-Principle-Anwendungsfall in der synthetischen Biologie wird auch gezeigt, indem die Bildung von biomolekularen Kondensaten in den Liposomen über den Transmembranprotonenfluss induziert wird. Es wird erwartet, dass dieses begleitende Videoprotokoll den Lesern die Einrichtung und Fehlerbehebung von OLA in ihren Laboren erleichtern wird.

Einleitung

Alle Zellen haben eine Plasmamembran als physikalische Grenze, und diese Membran ist im Wesentlichen ein Gerüst in Form einer Lipiddoppelschicht, die durch die Selbstorganisation amphiphiler Lipidmoleküle gebildet wird. Liposomen sind die minimalen synthetischen Gegenstücke biologischer Zellen; Sie haben ein wässriges Lumen, das von Phospholipiden umgeben ist, die eine Lipiddoppelschicht bilden, wobei die hydrophilen Kopfgruppen der wässrigen Phase zugewandt sind und die hydrophoben Schwänze nach innen vergraben sind. Die Stabilität von Liposomen wird durch den hydrophoben Effekt sowie die Hydrophilie zwischen den polaren Gruppen, die Van-der-Waals-Kräfte zwischen den hydrophoben Kohlenstoffschwänzen und die Wasserstoffbrückenbindung zwischen Wassermolekülen und den hydrophilen Köpfenbestimmt 1,2. Abhängig von der Anzahl der Lipiddoppelschichten können Liposomen in zwei Hauptkategorien eingeteilt werden, nämlich unilamellare Vesikel, die aus einer einzigen Doppelschicht bestehen, und mehrlamellare Vesikel, die aus mehreren Doppelschichten aufgebaut sind. Unilamelläre Vesikel werden weiter nach ihrer Größe klassifiziert. Sie sind in der Regel kugelförmig und können in einer Vielzahl von Größen hergestellt werden, darunter kleine unilamellare Vesikel (SUV, 30-100 nm Durchmesser), große unilamellare Vesikel (LUV, 100-1.000 nm Durchmesser) und schließlich riesige unilamellare Vesikel (GUV, >1.000 nm Durchmesser)3,4. Es wurden verschiedene Techniken zur Herstellung von Liposomen entwickelt, die grob in Bulk-Techniken5 und mikrofluidische Techniken6 unterteilt werden können. Zu den häufig praktizierten Bulk-Techniken gehören Lipidfilmrehydrierung, Elektroformation, invertierter Emulsionstransfer und Extrusion 7,8,9,10. Diese Techniken sind relativ einfach und effektiv, und dies sind die Hauptgründe für ihre weit verbreitete Verwendung in der Gemeinschaft der synthetischen Biologie. Gleichzeitig weisen sie jedoch große Nachteile in Bezug auf die Polydispersität in der Größe, die mangelnde Kontrolle über die Lamellenstruktur und die geringe Verkapselungseffizienzauf 7,11. Techniken wie Continuous Droplet Interface Crossing Encapsulation (cDICE)12 und Droplet Shooting and Size Filtration (DSSF)13 überwinden diese Einschränkungen bis zu einem gewissen Grad.

Mikrofluidische Ansätze haben in den letzten zehn Jahren an Bedeutung gewonnen. Die Mikrofluidik-Technologie bietet aufgrund der charakteristischen laminaren Strömung und des diffusionsdominierten Stofftransfers eine kontrollierbare Umgebung für die Manipulation von Fluidströmungen innerhalb benutzerdefinierter Mikrokanäle. Die daraus resultierenden Lab-on-a-Chip-Geräte bieten einzigartige Möglichkeiten für die raumzeitliche Kontrolle von Molekülen mit deutlich reduzierten Probenvolumina und Multiplexing-Fähigkeiten14. Zahlreiche mikrofluidische Methoden zur Herstellung von Liposomen wurden entwickelt, darunter das gepulste Jetting 15, das Doppelemulsions-Templating 16, der transiente Membranauswurf 17, der Tröpfchenemulsionstransfer 18 und die hydrodynamische Fokussierung 19. Diese Techniken erzeugen monodisperse, unilamellare Liposomen in Zellgröße mit hoher Verkapselungseffizienz und hohem Durchsatz.

Dieser Artikel beschreibt detailliert das Verfahren für die Oktanol-unterstützte Liposomenassemblierung (OLA), eine mikrofluidische On-Chip-Methode, die auf dem hydrodynamischen Pinch-off- und anschließenden Lösungsmittel-Entnetzungsmechanismus20 basiert (Abbildung 1). Man kann die Funktionsweise von OLA mit einem Blasenblasprozess in Verbindung bringen. Eine Sechs-Wege-Verbindung fokussiert die innere wässrige (IA) Phase, zwei lipidtragende organische (LO) Ströme und zwei tensidhaltige äußere wässrige (OA) Ströme an einer einzigen Stelle. Dies führt zu Wasser-in-(Lipiden + Oktanol)-in-Wasser-Doppelemulsionströpfchen. Wenn diese Tröpfchen stromabwärts fließen, führen die Minimierung der Grenzflächenenergie, die externe Scherströmung und die Wechselwirkung mit den Kanalwänden zur Bildung einer Lipiddoppelschicht an der Grenzfläche, wenn sich die Lösungsmitteltasche ablöst und so unilamellare Liposomen bilden. Abhängig von der Größe der Oktanoltasche kann der Entnetzungsprozess mehrere zehn Sekunden bis einige Minuten dauern. Am Ende des Austrittskanals schwimmen die weniger dichten Oktanoltröpfchen an die Oberfläche, während die schwereren Liposomen (aufgrund einer dichteren verkapselten Lösung) experimentierbereit auf den Boden der Visualisierungskammer sinken. Als repräsentatives Experiment wird der Prozess der Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) innerhalb von Liposomen demonstriert. Dazu werden die benötigten Komponenten in Liposomen bei einem sauren pH-Wert verkapselt, der LLPS verhindert. Durch die äußere Auslösung einer pH-Änderung und damit eines transmembranen Protonenflusses bilden sich phasengetrennte Kondensattröpfchen im Inneren der Liposomen. Dies unterstreicht die effektiven Verkapselungs- und Manipulationsmöglichkeiten des OLA-Systems.

Protokoll

1. Herstellung des Master-Wafers

  1. Nehmen Sie einen sauberen Siliziumwafer mit einem Durchmesser von 10 cm (4 Zoll) (siehe Materialtabelle). Reinigen Sie es weiter mit Druckluft, um Staubpartikel zu entfernen.
  2. Montieren Sie den Wafer auf einem Spin-Coater und geben Sie vorsichtig ~5 ml eines negativen Fotolacks (siehe Materialtabelle) in der Mitte des Wafers ab. Versuchen Sie, Luftblasen zu vermeiden, da diese den nachgelagerten Druckprozess des Wafers stören könnten.
  3. Um eine 10 μm dicke Fotolackschicht zu erhalten, schleudern Sie den Wafer 30 s lang bei 500 U/min mit einer Beschleunigung von 100 U/min für die anfängliche Spreizung, gefolgt von einem 60 s Spin bei 3.000 U/min mit einer Beschleunigung von 500 U/min. Falls eine andere Dicke gewünscht wird, ändern Sie die Spinnparameter gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  4. Die Waffel auf einer Heizplatte 2 min bei 65 °C und dann 5 min bei 95 °C backen.
  5. Sobald der Wafer abgekühlt ist, montieren Sie den Wafer in der Druckkammer des optischen Lithographiegeräts mit Direktbeschreibung (siehe Materialtabelle) und führen Sie das OLA-Design (Abbildung 2A, Supplementary Coding File 1) in die Software ein.
    HINWEIS: Das OLA-Design besteht im Wesentlichen aus zwei OA-Kanälen, zwei LO-Kanälen und einem IA-Kanal, die zu einer Sechs-Wege-Verbindung verschmelzen, die sich als Postproduktionskanal fortsetzt und im Experimentalbrunnen (EW) endet.
  6. Drucken Sie das/die OLA-Design(s) mit einem UV-Laser (siehe Materialtabelle) mit einer Dosis von 300 mJ/cm2 auf den beschichteten Wafer.
  7. Sobald das Design gedruckt ist, backen Sie die Waffel bei 65 °C für 1 Minute, gefolgt von 95 °C für 3 Minuten.
  8. Stellen Sie an dieser Stelle sicher, dass der Umriss des gedruckten Geräts auf dem Wafer erscheint und mit bloßem Auge sichtbar ist. Um den nicht ausgehärteten Fotolack abzuwaschen, tauchen Sie den Wafer in ein Glasbecherglas mit der Entwicklerlösung (siehe Materialtabelle), bis der nicht ausgehärtete Fotolack vollständig entfernt ist.
    HINWEIS: Eine übermäßige Entwicklerbehandlung kann sich auf die Designauflösung auswirken.
  9. Waschen Sie den Wafer nacheinander mit Aceton, Isopropanol und deionisiertem Wasser (DI) und schließlich mit Druckluft/N2 unter Verwendung einer Blaspistole.
  10. Brennen Sie den Wafer bei 150 °C für 30 min hart, um sicherzustellen, dass das gedruckte Design fest auf der Waferoberfläche haftet und sich im nachgelagerten Herstellungsprozess nicht ablöst. Der Master-Wafer ist dann bereit für die weitere Verwendung (Abbildung 2B).

2. Vorbereiten des mikrofluidischen Geräts

  1. Legen Sie den Master-Wafer auf ein quadratisches Stück Aluminium und wickeln Sie die Aluminiumfolie um den Wafer, um eine gut aussehende Struktur zu bilden (Abbildung 2C).
  2. 40 g Polydimethylsiloxan (PDMS) und 4 g Härter (10:1, Gewichtsverhältnis, siehe Materialtabelle) in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen abmessen und mit einem Spatel oder einer Pipettenspitze 2-3 Minuten lang kräftig mischen.
  3. Durch die kräftige Vermischung von PDMS und Härter werden Luftblasen in der Mischung eingeschlossen. Drehen Sie das Röhrchen bei 100 x g für 2-3 Minuten, um die meisten großen Luftblasen zu entfernen.
  4. Gießen Sie ca. 15-20 g der in Schritt 2.3 hergestellten Mischung über die Masterwaffel und entgasen Sie sie mit einem Exsikkator. Bewahren Sie die überschüssige Mischung auf, um PDMS-beschichtete Glasobjektträger herzustellen (Schritt 3).
  5. Die Assemblierung wird im Ofen bei 70 °C mindestens 2 h inkubiert.
  6. Die Masterwaffel aus dem Ofen nehmen und abkühlen lassen. Um den erstarrten PDMS-Block zu entfernen, entfernen Sie die Aluminiumfolie und ziehen Sie den PDMS-Block vorsichtig vom Rand des Wafers ab.
    Anmerkungen: Der Wafer ist zerbrechlich und kann brechen, daher ist es wichtig, diesen Vorgang sorgfältig durchzuführen.
  7. Sobald der PDMS-Block entfernt ist, halten Sie die gemusterte Struktur nach oben gerichtet und schneiden Sie mit einer scharfen Klinge oder einem Skalpell einzelne PDMS-Blöcke ab, die jeweils ein einzelnes mikrofluidisches Gerät enthalten.
  8. Legen Sie den PDMS-Block auf eine dunkle Fläche und stellen Sie die Lichtrichtung so ein (eine Tischlampe ist dafür praktisch), dass die gravierten Kanäle glänzend und dadurch sichtbar sind. Bohren Sie Löcher in die Einlässe und den Austrittskanal mit Biopsiestanzen von 0,5 mm bzw. 3 mm Durchmesser (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Verwenden Sie eine scharfe Biopsiestanze, um Risse im PDMS zu vermeiden, die später zu Undichtigkeiten führen können. Schieben Sie die Biopsiestanze vorsichtig durch den PDMS-Block und stellen Sie sicher, dass sie vollständig durch ihn hindurchgeht. Um die Biopsiestanze zu entfernen, ziehen Sie sie vorsichtig zurück, während Sie sie in andere Richtungen drehen. Der PDMS-Block mit dem eingravierten OLA-Design ist nun bereit für die Bindung an einen PDMS-beschichteten Objektträger.

3. Herstellen des PDMS-beschichteten Glasobjektträgers

  1. Nehmen Sie ein transparentes Glasdeckglas, gießen Sie ca. 0,5 ml PDMS (im Überschuss in Schritt 2.4 vorbereitet) auf die Mitte des Objektträgers und verteilen Sie es durch leichtes Kippen des Objektträgers auf dem Deckglas, um eine vollständige Abdeckung des Objektträgers mit PDMS zu gewährleisten.
  2. Montieren Sie den Objektträger auf dem Schleuderbeschichter, stellen Sie sicher, dass er mittig platziert ist (so dass sich die Mitte des Objektträgers mit der Mitte der Druckwelle überlappt), und drehen Sie den Objektträger 15 s lang mit 500 U/min (in Schritten von 100 U/min) und dann 30 s lang mit 1.000 U/min (in Schritten von 500 U/min).
  3. Legen Sie den PDMS-beschichteten Glasobjektträger (beschichtete Seite nach oben) auf eine erhöhte Plattform wie einen PDMS-Block (1 cm x 1 cm) in eine abgedeckte Petrischale und backen Sie ihn bei 70 °C 2 h lang.

4. Verklebung des mikrofluidischen Gerätes

  1. Reinigen Sie den PDMS-Block (vorbereitet in Schritt 2), indem Sie handelsübliches Klebeband (siehe Materialtabelle) zweimal aufkleben und entfernen. Achten Sie darauf, dass die gereinigte Seite bis zur Verwendung nach oben zeigt.
  2. Reinigen Sie den PDMS-beschichteten Objektträger mit Druckluft/N2 mit einer Blaspistole und halten Sie die saubere Seite nach oben.
  3. Legen Sie den PDMS-Block (gravierte Kanäle nach oben) und den PDMS-beschichteten Glasobjektträger (beschichtete Seite nach oben) in die Vakuumkammer des Plasmareinigers (siehe Materialtabelle).
  4. Schalten Sie das Vakuum ein und setzen Sie den Inhalt 15 s lang einem Luftplasma mit einer Radiofrequenz von 12 MHz (HF-Modus hoch) aus, um die Oberflächen zu aktivieren. Sauerstoffplasma ist in Form eines rosafarbenen Farbtons zu sehen.
  5. Legen Sie den PDMS-beschichteten Objektträger unmittelbar nach der Plasmabehandlung mit der PDMS-Seite nach oben auf eine saubere Oberfläche. Platzieren Sie den PDMS-Block vorsichtig so, dass das mikrofluidische Muster nun in Richtung des PDMS-beschichteten Objektträgers zeigt, damit sie sich verbinden können (Abbildung 2D).
    Anmerkungen: Das Entfernen der im Gerät eingeschlossenen Luft ist entscheidend, um eine gründliche Verklebung zu gewährleisten.
  6. Backen Sie die geklebten Geräte bei 70 °C für 2 h.

5. Oberflächenfunktionalisierung des mikrofluidischen Gerätes

Anmerkungen: Vor der Oberflächenfunktionalisierung ist es wichtig, die Druckpumpe gemäß dem Protokoll des Herstellers (siehe Materialtabelle) zu kalibrieren und den Schlauch zu montieren, um ihn mit dem mikrofluidischen Gerät zu verbinden.

  1. Anschluss des mikrofluidischen Geräts an die Druckpumpen
    1. Schließen Sie den druckgesteuerten Durchflussregler an eine externe Druckquelle (bis zu 6 bar) an. Es sind mindestens vier unabhängige Luftdruckkanäle erforderlich: drei Einzelmodule von 0-2 bar und ein Modul von −0,9-4 bar.
    2. Kalibrieren Sie die Druckpumpe gemäß dem Protokoll des Herstellers (siehe Materialtabelle).
    3. Schneiden Sie den Schlauch (1/16 Zoll Außendurchmesser x 0,02 Zoll Innendurchmesser) in vier gleich große Stücke mit einer Länge von ca. 20 cm.
    4. Setzen Sie 23 G Edelstahl-Verbinder mit 90° gebogenem Stahl (siehe Materialtabelle) an einem Ende jedes Stücks ein. Dieses Ende wird später in die drei Einlässe (OA, LO und IA) des mikrofluidischen Geräts eingeführt, und das vierte Ende wird verwendet, um überschüssige Lösung zu entfernen (Schritt 5.2.5).
    5. Führen Sie das andere Ende des Schlauchs in den Ständer des mikrofluidischen Reservoirs ein und verschließen Sie es mit mikrofluidischen Fittings, wobei Sie sicherstellen, dass der Schlauch lang genug ist, um den Boden des Reservoirs zu berühren (1,5-ml-Röhrchen, siehe Materialtabelle). Dadurch wird verhindert, dass unerwünschte Luftblasen während der PVA-Behandlung/Liposomenproduktion in das mikrofluidische Gerät gelangen.
  2. PVA-Behandlung des Austrittskanals
    HINWEIS: Vor der Liposomenbildung ist es wichtig, das Gerät stromabwärts der Produktionsstelle teilweise hydrophil zu machen. Dies geschieht durch die Behandlung dieser Kanäle mit einer 5%igen (w/v) Polyvinylalkohol (PVA)-Lösung. Die Herstellung der PVA-Lösung erfolgt durch Auflösen des PVA-Pulvers (siehe Materialtabelle) in Wasser bei 80 °C für 3 h unter ständigem Rühren unter Verwendung eines Magnetrührers. Filtern Sie die Lösung, bevor Sie sie für die Oberflächenbehandlung verwenden. Unmittelbar nach der Verklebung des Gerätes sind die mikrofluidischen Kanäle durch die plasmainduzierte Oberflächenaktivierung hydrophil und werden nach und nach wieder hydrophob. Es wird empfohlen, nach dem Backen (Schritt 4.6) 2 Stunden zu warten, bevor mit der PVA-Behandlung begonnen wird.
    1. Geben Sie 200 μl 5%ige w/v PVA-Lösung in ein 1,5-ml-Röhrchen und schließen Sie es an den mikrofluidischen Reservoirständer an. Führen Sie den Schlauch (den in Schritt 5.1.3 erwähnten) so ein, dass ein Ende in die PVA-Lösung eingetaucht ist und das andere Ende mit dem Einlass des OA-Kanals des mikrofluidischen Geräts verbunden ist.
      HINWEIS: Eine niedrigere PVA-Konzentration kann zu einer minderwertigen Oberflächenfunktionalisierung führen.
    2. Wiederholen Sie den obigen Schritt ohne PVA (leeres 1,5-ml-Röhrchen) und schließen Sie es an die LO- und IA-Kanäle an.
    3. Erhöhen Sie den Druck der OA-Phase auf 100 mbar, um die PVA-Lösung in die OA-Kanäle fließen zu lassen. Erhöhen Sie die Drücke der IA- und LO-Phasen auf 120 mbar, um den Rückfluss der PVA-Lösung in diesen Kanälen zu verhindern (Abbildung 2E).
      Anmerkungen: Passen Sie bei Bedarf die Drücke der einzelnen Kanäle an, um den Meniskus an der Produktionsstelle stabil zu halten.
    4. Lassen Sie die PVA-Lösung auf diese Weise ca. 5 Minuten lang fließen, um eine vollständige Funktionalisierung des Austrittskanals zu gewährleisten.
    5. Um die PVA-Lösung zu entfernen, lösen Sie den Schlauch vom OA-Einlass und erhöhen Sie sofort den Druck in den LO- und IA-Kanälen auf 2 bar. Verwenden Sie gleichzeitig einen Schlauch, der an einen Unterdruckkanal (−900 mbar) angeschlossen ist, um überschüssiges PVA zuerst aus dem Austrittskanal und dann aus dem OA-Einlass zu entfernen (Abbildung 2F).
    6. Backen Sie das Gerät 15 Minuten lang bei 120 °C und lassen Sie es vor Gebrauch abkühlen. Das Gerät kann mindestens 1 Monat unter Umgebungsbedingungen gelagert werden.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, 1 Tag (bei Raumtemperatur) zu warten, bevor Sie mit OLA fortfahren, um sicherzustellen, dass das unbehandelte PDMS nach der Plasmabehandlung seine Hydrophobie wiedererlangt.

6. Oktanol-unterstützte Liposomen-Assemblierung (OLA)

  1. Zubereitung des Lipidstocks
    HINWEIS: Hier wird ein Gemisch aus 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC) und 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(lissamin-rhodamin-B-sulfonyl) (Liss Rhod PE)-Lipiden (siehe Materialtabelle) als Beispiel verwendet; Anwender sollten die benötigte Lipidzusammensetzung auf ähnliche Weise vorbereiten.
    1. Geben Sie 76 μl DOPC (25 mg/ml) und 16,6 μl Liss Rhod PE (1 mg/ml) mit separaten Glasspritzen in einen Rundkolben ab.
    2. Halten Sie den Rundkolben aufrecht und verwenden Sie eine komprimierte N 2-Blaspistole, um einen sanften Stickstoffstrahl abzugeben, um das Chloroform zu verdampfen und einen getrockneten Lipidfilm am Boden des Kolbens zu bilden.
    3. Stellen Sie den Kolben für mindestens 2 h unter kontinuierliches Vakuum in den Exsikkator, um das restliche Chloroform zu entfernen.
    4. Geben Sie 100 μl Ethanol in den Rundkolben und pipettieren oder schütteln Sie ihn vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Lipide aufgelöst werden, um einen 10%igen (w/v) Lipidstock zu bilden.
      Anmerkungen: Falls eine bestimmte Lipidzusammensetzung nicht vollständig in Ethanol löslich ist, verwenden Sie ein Ethanol/Chloroform-Gemisch und halten Sie das Chloroformvolumen so gering wie möglich.
    5. Pipettieren Sie die Lösung in eine Durchstechflasche aus dunklem Glas. Spülen Sie die Durchstechflasche vorsichtig mit Stickstoff mit einer Blaspistole, um die Luft durch eine inerte Atmosphäre zu ersetzen. Verschließen Sie den Deckel mit Paraffinfolie und lagern Sie ihn bei −20 °C.
      HINWEIS: Die Stammlösung kann bis zu einigen Monaten verwendet werden. Ersetzen Sie jedes Mal, wenn die Durchstechflasche geöffnet wird, vorsichtig die Luft durch Stickstoff und verschließen Sie den Deckel wieder mit Paraffinfolie.
  2. Vorbereiten der OLA-Lösungen
    1. Stellen Sie Standardlösungen aus den unverzichtbaren Komponenten her: 20 mM Dextran (Mw 6.000); 60% (v/v) Glycerin; ein Puffer der Wahl. In diesem Fall wurde 5x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (0,68 M NaCl, 13,5 mM KCl, 50 mMNa2HPO4, 9 mMKH2PO4; pH 7,4) hergestellt (siehe Materialtabelle).
      Anmerkungen: Da reines Glycerin hochviskos ist, wird empfohlen, ein kleines Stück am Ende der Pipettenspitze schräg herauszuschneiden, um ein effektives Pipettieren zu gewährleisten.
    2. Bereiten Sie 100 μl IA-, OA- und Ausgangslösungsproben (ES, die gewünschte Lösung zum Befüllen des EW) vor. Zur leichteren Visualisierung wurde in diesem speziellen Fall gelb fluoreszierendes Protein (YFP) zur IA-Lösung hinzugefügt. Überprüfen Sie das osmotische Gleichgewicht zwischen IA und OA, indem Sie die Osmolarität der verkapselten Komponenten berechnen und bei Bedarf eine angemessene Menge Zucker oder Salz in die OA geben. Dies geschieht, um das Platzen oder Schrumpfen der Liposomen während der Produktion zu verhindern.
      HINWEIS: Die endgültigen Zusammensetzungen der drei Phasen lauten wie folgt:
      IA: 15% Glycerin, 5 mM Dextran (Mw 6.000), 5,4 μM YFP, 1x PBS
      OA: 15% Glycerin, 5% F68 Tensid, 1x PBS
      ES: 15% Glycerin, 1x PBS
      Eine geringere Konzentration des F68-Tensids wirkt sich negativ auf die Bildung von Doppelemulsionen aus.
    3. Bereiten Sie 80 μl der LO-Phase vor, indem Sie 4 μl Stammlipid in 76 μl 1-Oktanol pipettieren (siehe Materialtabelle). Die Endkonzentration von DOPC beträgt 5 mg/ml.
    4. Zentrifugieren Sie die Proben bei 700 x g für 60 s, um alle großen Aggregate zu entfernen, bevor Sie mit den mikrofluidischen Experimenten fortfahren. Dadurch wird verhindert, dass offensichtliche Verstopfungsfaktoren in den mikrofluidischen Chip gelangen.
  3. Liposomenproduktion
    1. Geben Sie die Lösungen (IA, LO, OA) in drei 1,5-ml-Röhrchen, setzen Sie sie zusammen (wie in Schritt 5.1 erwähnt) und verbinden Sie sie mit dem PVA-behandelten Mikrofluidik-Chip (Schritt 5.2.6).
    2. Üben Sie einen Überdruck auf die drei Kanäle aus: ~100 mbar auf den IA- und LO-Kanälen und ~200 mbar auf dem OA-Kanal.
      HINWEIS: Da der OA-Druck höher ist als bei den anderen, wird die OA-Lösung die erste sein, die bei EW eintrifft. Dies wird dringend empfohlen.
    3. Sobald die OA-Lösung EW erreicht hat, verringern Sie den OA-Druck auf 100 mbar und erhöhen Sie den LO auf 200 mbar.  Die LO-Lösung, die an der Produktionsstelle ankommt, führt wahrscheinlich zu Luftblasen, da Luft aus den LO-Kanälen verdrängt wird. Sobald die Luftblasen in den EW abgegeben wurden, stellen Sie den LO-Druck auf 100 mbar ein. Erhöhen Sie zum Schluss den IA-Druck auf 200 mbar und warten Sie, bis die gesamte Luft im IA-Kanal entfernt ist. Die ideale Reihenfolge der Ankunft am Übergang der drei Phasen ist also OA, LO und IA.
    4. Nachdem Sie die Luft aus den drei Kanälen entfernt haben, stellen Sie alle Kanaldrücke auf 50 mbar ein und pipettieren Sie 10 μl ES in die Austrittskammer. Setzen Sie nach dem Pipettieren des ES einen Abdeckschieber auf das Austrittsloch, um eine Verdunstung zu vermeiden. Falls der LO zurückgedrückt wird, erhöhen Sie den LO-Druck allmählich in Schritten von 1 mbar, bis er zum Diaphragma zu fließen beginnt.
    5. Sobald alle drei Phasen an der Verbindungsstelle mitfließen, stellen Sie sicher, dass die doppelte Emulsionsproduktion beginnt, und passen Sie sie entsprechend ihrer Qualität an (Abbildung 3A-C). Ändern Sie die Drücke schrittweise (in Schritten von 0,1 bis 1 mbar) und nicht abrupt, es sei denn, der Druck wird geändert, um eine unerwünschte Verstopfung im Kanal zu beseitigen.
      HINWEIS: Welche Kanäle angepasst werden müssen, hängt davon ab, was an der Kreuzung passiert. Zum Beispiel muss die IA verringert werden, wenn die Emulsionen zu groß sind; die OA muss erhöht werden, wenn sich doppelte Emulsionen bilden, aber platzen, anstatt abgeklemmt zu werden; und der LO muss verringert werden, wenn die Oktanoltasche zu groß ist.
    6. Prüfen Sie, ob die Tröpfchen der Doppelemulsion stromabwärts zu EW fließen. Während des Fließens treten die Oktanoltaschen immer stärker hervor und werden schließlich abgeklemmt, wodurch Liposomen gebildet werden (Abbildung 3D-F). Stellen Sie sicher, dass der Postproduktionskanal lang genug ist und dass die Migration der Doppelemulsionen langsam genug ist, um sie zu entnetzen.
      HINWEIS: Innerhalb von Minuten nach der anständigen Produktion verlassen Liposomen und Oktanoltröpfchen den Postproduktionskanal und gelangen in den EW. Infolgedessen schwimmen die Oktanoltröpfchen, da sie weniger dicht als Wasser sind, an die Oberfläche des ES. Durch die Zugabe von Dextran in der IA sind die Liposomen schwerer als ihre Umgebung und gehen zur Beobachtung und weiteren Manipulation auf den Boden der Kammer.

Ergebnisse

Diese Arbeit demonstriert als repräsentatives Experiment die Bildung membranloser Kondensate durch den Prozess der Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) in Liposomen.

Probenvorbereitung
Die IA-, OA-, ES- und Feed-Lösung (FS) werden wie folgt hergestellt:

IA: 12 % Glycerin, 5 mM Dextran, 150 mM KCl, 5 mg/ml Poly-L-Lysin (PLL), 0,05 mg/ml Poly-L-Lysin-FITC-markiert (PLL-FITC), 8 mM Adenosintriphosphat (ATP), 15 mM Citrat-HCl (pH 4)

...

Diskussion

Die zelluläre Komplexität macht es extrem schwierig, lebende Zellen zu verstehen, wenn sie als Ganzes betrachtet werden. Die Verringerung der Redundanz und Interkonnektivität von Zellen durch die Rekonstitution der Schlüsselkomponenten in vitro ist notwendig, um unser Verständnis biologischer Systeme zu verbessern und künstliche zelluläre Nachahmungen für biotechnologische Anwendungen zu schaffen22,23,24. Liposomen diene...

Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Wir bedanken uns bei Dolf Weijers, Vera Gorelova und Mark Roosjen für die freundliche Bereitstellung von YFP. S.D. bedankt sich für die finanzielle Unterstützung durch den niederländischen Forschungsrat (Fördernummer: OCENW. KLEIN.465).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1-OctanolSigma-AldrichNo. 297887
1.5 mL tubesFisher scientific10451043Eppendorf 3810X Polypropylene microcentrifuge tubes
ATPSigma-AldrichNo. A2383
Biopsy punchDarwin microfluidicsPT-T983-050.5 mm and 3 mm diameter
Citrate-baseSigma-AldrichNo. 71405
DextranSigma-AldrichNo. 31388Mr~6,000
Direct-write optical lithography machineDurham Magneto Optics LtdMicroWriter ML3 Babysetup and software
DOPC lipidAvantiSKU:850375C
F68Sigma-AldrichNo. 24040032
Glass cover slipCorning#1, 24 x 40 mm
GlycerolSigma-AldrichNo. G2025
Hydrochloric acidThermo Scientific AcrosNo. 124630010
Liss Rhod PE lipidAvantiSKU:810150C
ParafilmSigma-AldrichNo. P7793
PhotoresistMicro resist technology GmbHEpoCore 10
Photoresist developermicro resist technology GmbHmr-Dev 600
Plasma cleanerHarrick plasmaPDC-32G
PolydimethylsiloxaneDowSylgard 184PDMS and curing agent
Poly-L-lysineSigma-AldrichNo. P7890
Poly-L-lysine–FITC LabeledSigma-AldrichNo. P3543
Polyvinyl alcoholSigma-Aldrichno. P8136molecular weight 30,000–70,000, 87%–90% hydrolyzed
Pressure controllerElveflow OBK1 Mk3+Flow controller
Scotch tapeMagic Tape Invisible Matt Tape
Silicon waferSilicon Materials0620R16002
Spin coater Laurell Technologies CorporationModel WS-650MZ-23NPP
Stainless Steel 90° Bent PDMS CouplersDarwin microfluidicsPN-BEN-23G
Tris-baseSigma-AldrichNo. 252859
Tygon tubingDarwin microfluidics1/16" OD x 0.02" ID
UV laser 365 nm wavelength

Referenzen

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