Isolierung des Hirnsekretoms aus ex vivo Hirnschnittkulturen

Zusammenfassung

Das Hirnsekretom spielt eine zentrale Rolle für die Entwicklung und normale Funktion des Zentralnervensystems. In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung des Hirnsekretoms aus ex vivo Hirnschnittkulturen zur Verfügung.

Zusammenfassung

Das Gehirnsekretom besteht aus Proteinen, die entweder aktiv sezerniert oder durch proteolytische Spaltung in der extrazellulären Matrix des Nervensystems von der Zelloberfläche abgestoßen werden. Zu diesen Proteinen gehören unter anderem Wachstumsfaktorrezeptoren und Transmembranproteine, die ein breites Spektrum an Rollen bei der Entwicklung und normalen Funktion des Zentralnervensystems abdecken. Das derzeitige Verfahren zur Extraktion des Sekretoms aus der Zerebrospinalflüssigkeit ist kompliziert und zeitaufwändig, und es ist schwierig, diese Proteine aus experimentellen Tiergehirnen zu isolieren. In dieser Studie stellen wir ein neuartiges Protokoll zur Isolierung des Gehirnsekretoms aus Schnittkulturen des Mausgehirns vor. Zunächst wurden die Gehirne isoliert, in Scheiben geschnitten und ex vivo kultiviert. Das Kulturmedium wurde dann filtriert und konzentriert, um die Proteine nach einigen Tagen durch Zentrifugation zu isolieren. Schließlich wurden die isolierten Proteine mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgelöst und anschließend zur Reinheitscharakterisierung mittels Western Blot untersucht. Dieses Isolierungsverfahren des Hirnsekretoms aus ex vivo Hirnschnittkulturen kann verwendet werden, um die Auswirkungen des Sekretoms auf eine Vielzahl von neurologischen Entwicklungskrankheiten, wie z.B. Autismus-Spektrum-Störungen, zu untersuchen.

Einleitung

Die extrazelluläre Matrix des Nervensystems besteht aus Proteinen, die entweder aktiv sezerniert oder von der Zelloberfläche abgestoßen werden, das sogenannte "Sekretom". Das Hirnsekretom enthält Proteine wie Wachstumsfaktorrezeptoren und Transmembranproteine¹, die ein breites Spektrum an Rollen bei der Entwicklung und normalen Funktion des Zentralnervensystems umfassen. Eine große Anzahl von Proteinen, die von den Gliazellen sezerniert werden, darunter insbesondere Mikroglia und Astrozyten, spiegeln eine Vielzahl von Gliaerkrankungen wider, einschließlich der Neuroinflammation im zentralen Nervensystem². Es wurde gezeigt, dass das Proteinsekretom sowohl neuroprotektive als auch neurotoxische Wirkungen hat. Zum Beispiel wurde festgestellt, dass Gene, die für Neuroligin kodieren, ein Transmembranprotein, das an Postsynapsen vorhanden ist und die Struktur und Funktion der synaptischen Verbindungen^{reguliert 3}, ein Risikofaktor für Autismus-Spektrum-Störungen sind. Neuroligin durchläuft einen Prozess, der als Ektodomänenablösung bezeichnet wird, bei dem die Ektodomänen von Transmembranproteinen von der Zelloberfläche freigesetzt werden, indem sie sich in Form eines Sekretoms von der Membran trennen ^4,5.

Viele Proteine im Sekretom im Gehirn können in der Zerebrospinalflüssigkeit nachgewiesen werden; Daher kann die proteomische Analyse dieser Flüssigkeit dazu beitragen, neue physiologische und pathologische Mechanismen und Biomarker für neurologische Erkrankungen zu identifizieren ^6,7. Viele der physiologischen Funktionen von Sekretomproteinen des Gehirns sind noch unbekannt und bedürfen weiterer Forschung. Die Etablierung eines wirksamen Verfahrens zur Extraktion des Hirnsekretoms ist für diese Studien von entscheidender Bedeutung. Das derzeitige Verfahren zur Extraktion des Sekretoms aus der Zerebrospinalflüssigkeit ist jedoch kompliziert und zeitaufwändig, und es ist schwierig, diese Proteine aus experimentellen Tiergehirnen zu isolieren⁸. In diesem Artikel stellen wir ein neues Protokoll zur Isolierung des Sekretoms aus Hirnschnitten von Mäusen vor.

In vitro kultivierte Hirnschnitte enthalten die gleichen Zelltypen und die gleiche dreidimensionale Zellstruktur wie das Hirngewebe, wobei normale und intakte synaptische Schaltkreise, Rezeptorverteilung, Transmitterübertragung und andere physiologische Funktionen erhalten bleiben. Das Modell ahmt das Wachstum und die Funktion von Nervenzellen in Mäusen nach, wenn Gehirnschnitte in ein geeignetes Kulturmedium gelegt werden, um ein nachhaltiges Zellwachstum und Überleben zu gewährleisten. In dieser Studie sezernierten die Schnitte des Mausgehirns weiterhin neurosekretorische Proteine⁹, und das isolierte Gehirn wurde präpariert und unter sterilen Bedingungen auf einen Filtereinsatz gelegt. Die Filtereinsätze wurden in 6-Well-Platten mit dem Nährmedium eingesetzt. Da Proteine, die von Neuronen und Gliazellen sezerniert werden, die Membran des Einsatzes, nicht aber die Zellen durchdringen können, kann das Gehirnsekretom somit aus dem bedingten Kulturmedium entnommen werden.

Dieser Artikel beschreibt die grundlegenden Verfahren für (i) die Isolierung von Hirnschnitten, (ii) die Entnahme von Hirnschnitten, (iii) die Entnahme von Hirnschnittkulturen aus bedingtem Medium, (iv) Western-Blot-Analysen und (v) die proteomische Analyse (Abbildung 1).

Protokoll

Dieses Protokoll wurde genehmigt und folgt den Tierhaltungsrichtlinien, die vom Animal Care and Use Committee der Southern University of Science and Technology (SUSTech-JY202112006) festgelegt wurden. In dieser Studie wurden adulte männliche und weibliche C57BL/6J-Mäuse (6-8 Wochen alt, 22-30 g) verwendet. Die Mäuse wurden bei 22-25 °C in einem zirkadianen Zyklus von 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit untergebracht, mit ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser. Die Schritte des Protokolls sind wie folgt aufgelistet.

1. Isolierung von Hirnschnitten

1. Bereiten Sie die chirurgischen Instrumente vor: ophthalmische Biegepinzette, Becher (250 mL, 500 mL), Filterpapier, Schere, Rasierklinge, einseitige Klinge und Bürstenstift. Legen Sie diese Werkzeuge zum Abkühlen in eine mit zerstoßenem Eis gefüllte Schaumstoffbox.
2. Das Ventil für das Mischgas mit 95 % O₂ und 5 % CO₂ öffnen. Reinigen Sie den Gasleitungskopf, indem Sie ihn in ein Becherglas mit Reinstwasser legen.
3. Bereiten Sie den eiskalten Dissektionspuffer mit den folgenden Komponenten vor: 225 mM Saccharose, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH₂PO₄, 26 mM NaHCO₃, 11 mM D-Glucose, 5 mM L-Ascorbinsäure, 3 mM Natriumpyruvat, 7 mM MgSO4 und 0,5 mM CaCl₂. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,3-7,4 ein.
4. Bereiten Sie die Kulturlösung mit den folgenden Komponenten vor: 122 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH₂PO₄, 26 mM NaHCO₃, 11 mM D-Glucose, 7 mM MgSO4 und 0,5 mM CaCl₂. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,3-7,4 ein, filtrieren Sie dann und geben Sie 10% Penicillin-Streptomycin-Lösung (P/S) in die Kulturlösung.
5. Die Kulturlösung und die Sezierlösung 30 Minuten lang mit Sauerstoff anreichern, bevor die Mäuse geopfert werden. Brechen Sie die Rasierklinge, um die Hälfte der Scheibe zu nehmen, und montieren Sie sie dann auf den Hobel. Setzen Sie die Basis und den Werkzeughalter des Slicers ein.
6. Opfern Sie die Mäuse durch Zervixluxation oder durch Verwendung von 2%-3% Isofluoran zur Anästhesie.
   1. Schneide mit einer Schere den Schädel am Hals ab. Schneide die Haut in der Mitte des Schädels, um den ganzen Schädel freizulegen.
   2. Schneide den Schädel mit einer Augenschere entlang der Mittellinie und mit einer gebogenen Augenzange auseinander.
   3. Verwenden Sie schließlich eine gebogene Pinzette, um die Schädelbasis zu erreichen und den Basisnerv abzuschneiden. Das gesamte Gehirn kann nun entnommen werden.
7. Legen Sie das Gehirn schnell in einen eiskalten Dissektionspuffer. Verwende eine scharfe, sterilisierte, einseitige Klinge, um überschüssige Teile des Gehirns abzuschneiden, einschließlich des unteren Teils.
8. Kleben Sie das Hirngewebe mit geeignetem Kleber in den Tank. Gießen Sie die Schnittlösung in den Tank, stellen Sie sicher, dass das Hirngewebe bedeckt ist, und versorgen Sie sie weiterhin mit Sauerstoff.
9. Passen Sie die Parameter des Vibratoms an, um das Gewebe in 300 μm dicke Abschnitte zu schneiden. Die Geschwindigkeit und Frequenz des in dieser Studie verwendeten Slicers betrugen 0,3 mm/s bzw. 70 Hz.
10. Nehmen Sie mit einem Pinsel die Gehirnscheiben heraus und legen Sie sie in eine Schale mit der Kulturlösung. Übertragen Sie dann zwei bis vier Scheiben auf jeweils 30 mm und 0,4 μm porengroßen Gewebekultureinsatz in 6-Well-Platten mit 1,5 ml der Kulturlösung in einem Abstand, der es den Scheiben nicht erlaubt, ineinander zu wachsen.
11. Inkubieren Sie das Gewebe 14 Stunden lang bei 37 °C, 5 % CO₂ und 95 % Luftfeuchtigkeit.

2. Sammlung von Gehirnscheiben

1. Aspirieren Sie das Nährmedium aus dem Deckglas und übertragen Sie die Gehirnscheibe vorsichtig mit einer Bürste in das 1,5-ml-Röhrchen.
2. Geben Sie 200-400 μl Hanks' ausgewogene Salzlösung (HBSS) mit 1 mmol/l Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) in das Röhrchen. Streng oszillieren und mit einem Tissueschleifer zu einer homogenen Lösung mischen. Die in dieser Studie verwendete Frequenz und Zeit betrug 800 Hz bzw. 60 s.
3. Die Suspension wird bei 700 x g 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Sammeln Sie dann den Überstand in einem neuen 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen.
4. 20-40 μl 20 % Triton X-100 in den Überstand geben und die Probe mit einem Wippshaker 1 h lang bei 4 °C drehen.
5. Die Suspension bei 13.000 x g für 20 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand auffangen. Normalisieren Sie alle Hirnschnittproben mit einem Bicinchoninsäure (BCA)-Protein-Assay-Kit auf eine Proteinkonzentration von 2 μg/μl.
6. Mischen Sie den Überstand mit 5x Natriumdodecylsulfat (SDS)-Ladepuffer (10 % SDS, 10 mM Dithiothreitol [DTT], 250 mM Tris-HCl [pH 6,8], 30 % [v/v] Glycerin und 0,05 % [w/v] Bromphenolblau-Farbstoff) und kochen Sie die Probe 5 Minuten lang bei 95 °C.
7. Frieren Sie die vorbereiteten Proben bei -20 °C ein. Anschließend werden sie mittels Elektrophorese und Western-Blotting-Verfahren detektiert.

3. Entnahme von konditioniertem Medium (CM) in Gehirnschnittkulturen

1. Aspirieren Sie das Kulturmedium nach 14 h und filtrieren Sie das CM mit einem 0,22-μm-Filter.
2. Das konditionierte Medium wird mit einem 10 kDa Ultrafiltrationszentrifugenröhrchen bei 9.000 x g für 50 min bei 4 °C auf bis zu 100 μl konzentriert. Normalisieren Sie alle Mediumproben auf eine Proteinkonzentration von 0,8 μg/μl mit dem BCA-Protein-Assay-Kit.
3. Das konditionierte Medium in 5x SDS-Ladepuffer eluieren und 5 min bei 95 °C kochen lassen.
4. Frieren Sie die vorbereiteten Proben bei -20 °C ein. Anschließend werden sie mittels Elektrophorese und Western-Blotting-Verfahren detektiert.

4. Western-Blot-Analysen

1. Bereiten Sie Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Gel (SDS-PAGE) wie zuvor beschrieben^{vor 10}. Laden Sie die Gehirnscheibe und die mittlere Probe auf vorgefertigte SDS-PAGE-Gele. Die Proben werden zunächst 30 min lang bei einer konstanten Spannung von 80 V und dann 70 min lang bei einer konstanten Spannung von 120 V getrennt.
2. Übertragen Sie die Proteine auf Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membranen und blockieren Sie sie mit 5 % Rinderserumalbumin (BSA) in Tris-gepuffertem Kochsalzlösung-Tween 20 (TBST; 150 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,1 % Tween-20, pH 7,4) für 1 h.
3. Geben Sie primäre Antikörper wie folgt in das TBST ein: Maus-Anti-sAPP-α (Antikörperverdünnungsverhältnis von 1:5.000), Kaninchen-Anti-Clusterin (Antikörperverdünnungsverhältnis von 1:5.000), Maus-Anti-MAP2 (Antikörperverdünnungsverhältnis von 1:5.000), Maus-Anti-GAPDH (Antikörperverdünnungsverhältnis von 1:5.000) und Maus-Anti-Aktin (Antikörperverdünnungsverhältnis von 1:5.000) und Inkubation über Nacht bei 4 °C auf einer Wippe.
4. Waschen Sie die Membran dreimal mit TBST für jeweils 15 Minuten.
5. Geben Sie einen geeigneten Sekundärantikörper in TBST-Puffer wie folgt hinzu: m-IgGκ BP-HRP (Verdünnung 1:5.000), Maus-Anti-Kaninchen-IgG-HRP (Sekundärantikörper-Verdünnungsverhältnis von 1:5.000). 1-2 h inkubieren.
6. Waschen Sie die Membran dreimal mit TBST für jeweils 15 Minuten.
7. Scannen und abbilden Sie die Membranen mit einem geeigneten Bildgebungssystem.

5. Proteomische Analyse

1. In dieser Studie wird das Kulturmedium (CM) gemäß Schritt 3.1 entnommen und anschließend mit einem 3-kDa-Konzentrationsröhrchen bei 9.000 x g für 40 min bei 4 °C auf ein Endvolumen von 80 μl konzentriert. Lagern Sie die CM-Probe auf Eis und warten Sie auf die massenspektrometrische Analyse.
2. Durchführung der proteomischen Nachweis- und Analysemethoden für Proben gemäß den Protokollen, wie in früheren Arbeiten^{11, 12, 13} beschrieben.

Ergebnisse

Um die Sekretion extrazellulärer Proteine in Hirnschnitten zu quantifizieren, untersuchten wir die Proteinkonzentrationen der Hirnschnittproben und konditionierten Medienproben durch BCA-Assay-Experimente. Hirnschnittproben und konditionierte Mediumproben wiesen alle hohe Proteinkonzentrationen auf (Tabelle 1 und Abbildung 2). Wir fanden heraus, dass eine große Anzahl extrazellulärer Proteine in das Medium sezerniert wurd...

Diskussion

Das Gehirnsekretom bezieht sich auf die Sammlung von Signalmolekülen, die als Neurosekretor- oder Neuropeptidprodukte bekannt sind und von Neuronen oder Gliazellen in die extrazelluläre Umgebung abgegeben werden. Das Hirnsekretom hat wichtige Funktionen bei vielen biologischen und physiologischen Prozessen im Nervensystem ^17,18. Das Verständnis des Hirnsekretoms und seiner Funktionen ist wichtig, um Einblicke in die Mechanisme...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm Non-Sterile Millex Syringe Filters with PES Membrane	Millipore	SLGPR33RB
1,4-Dithio-DL-threitol (DTT)	Merck (Sigma Aldrich)	DTT-RO
6-well plates	CORNING	3516
Actin antibody	Cell Signaling Technology	#3700
APP Antibody	Cell Signaling Technology	2452
BioRad Mini-Protean TGX precast gels	BioRad	#1610185
Bovine serum albumin (BSA)	Merck (Sigma Aldrich)	10735094001
Bromophenol Blue	Merck (Sigma Aldrich)	B0126
Brush pen	Deli	1.00008E+11
CaCl2	Merck (Sigma Aldrich)	C1016
CF3COOH	Merck (Sigma Aldrich)	302031
CH3CN	Merck (Sigma Aldrich)	34851
Clusterin antibody	Cell Signaling Technology	#42143
D-Glucose	Merck (Sigma Aldrich)	G8270
Easy-nLC1200	Thermo Fisher Scientific	Easy-nLC1200
Filter paper	ROHU	ROHU-DLLZ00105
GAPDH antibody	Cell Signaling Technology	# 5174S
Glycerol	Merck (Sigma Aldrich)	G5516-100ML
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Invitrogen (Gibco)	14175095
Human/Rat NLGN2 Antibody	R&D Systems	AF5645
ICH2CONH2	Merck (Sigma Aldrich)	I6125
Immun-Blot PVDF membranes	BIO-RAD	#1620177
KCl	Merck (Sigma Aldrich)	P3911
L-Ascorbic Acid	Merck (Sigma Aldrich)	A92902
Map2 antibody	Cell Signaling Technology	# 4542S
MgSO4	Merck (Sigma Aldrich)	M7506
m-IgGκ BP-HRP	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY	sc-516102
Millicell-CM 0.4 μm	Millipore	PIHP03050
Millipore AmiconUltra-0.5ML	Millipore	UFC5010
mouse anti-rabbit IgG-HRP	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY	sc-2357
NaH2PO4	Merck (Sigma Aldrich)	S0751
NaHCO3	Merck (Sigma Aldrich)	S5761
NH4HCO3	Merck (Sigma Aldrich)	A6141
Parenzyme	Thermo Fisher Scientific	R001100
Penicillin-Streptomycin Solution(P/S)	Invitrogen (Gibco)	15070063
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23225
QEactive	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGAAPFALGMAZR
Rabbit Anti-Goat IgG (H&L)-HRP Conjugated	Easybio	BE0103-100
Razor blade	BFYING EAGLE	HX-L146-1H
Sodium chloride NaCl	Merck (Sigma Aldrich)	S6150
Sodium dodecylsulfate (SDS)	Merck (Sigma Aldrich)	V900859
Sodium Pyruvate	Merck (Sigma Aldrich)	P2256
SpeedVac SRF110 Refrigerated Vacuum Concentrator (German)	Thermo Fisher Scientific	SRF110P2-115
Sucrose	Merck (Sigma Aldrich)	G8270
Tissue grinder	SCIENTZ	SCIENTZ-48
Tris (Hydroxymethyl)	Merck (Sigma Aldrich)	TRIS-RO
TritonX-100	Merck (Sigma Aldrich)	T8787
Tween-20	Merck (Sigma Aldrich)	P1379
Vibratory slicer	Leica	Leica VT 1000S