Optimiertes Protokoll zur Erzeugung funktioneller Insulin-sezernierender Zellen der Bauchspeicheldrüse aus humanen pluripotenten Stammzellen

Zusammenfassung

Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die gerichtete Differenzierung und funktionelle Analyse von β-zellähnlichen Zellen vor. Wir beschreiben optimale Kulturbedingungen und Passagen für humane pluripotente Stammzellen, bevor insulinproduzierende Pankreaszellen erzeugt werden. Die sechsstufige Differenzierung schreitet von der endgültigen Endodermbildung bis hin zu funktionellen β-Zell-ähnlichen Zellen fort, die Insulin als Reaktion auf Glukose absondern.

Zusammenfassung

Humane pluripotente Stammzellen (hPSCs) können sich in jede Art von Zelle differenzieren, was sie zu einer hervorragenden alternativen Quelle für menschliche β-Zellen der Bauchspeicheldrüse macht. hPS-Zellen können entweder embryonale Stammzellen (hES-Zellen) sein, die aus der Blastozyste stammen, oder induzierte pluripotente Zellen (hiPS-Zellen), die direkt aus somatischen Zellen durch einen Reprogrammierungsprozess erzeugt werden. Hier wird ein videobasiertes Protokoll vorgestellt, um die optimalen Kultur- und Passagebedingungen für hPSCs vor ihrer Differenzierung und anschließenden Erzeugung von insulinproduzierenden Pankreaszellen zu skizzieren. Diese Methodik folgt dem sechsstufigen Prozess der β-Zell-gerichteten Differenzierung, bei dem sich hPSCs in definitives Endoderm (DE), primitive Darmröhre, posteriores Vorderdarmschicksal, Pankreasvorläuferzellen, endokrine Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse und schließlich pankreatische β-Zellen differenzieren. Es ist bemerkenswert, dass diese Differenzierungsmethode einen Zeitraum von 27 Tagen benötigt, um menschliche β-Zellen der Bauchspeicheldrüse zu erzeugen. Das Potenzial der Insulinsekretion wurde durch zwei Experimente bewertet, die Immunfärbung und glukosestimulierte Insulinsekretion umfassten.

Einleitung

Humane pluripotente Stammzellen (hPSCs) haben die einzigartige Fähigkeit, sich in verschiedene Zelltypen zu differenzieren, was sie zu einer praktikablen Alternative zu menschlichen β-Zellen der Bauchspeicheldrüse^{macht 1}. Diese hPSCs werden in zwei Typen eingeteilt: embryonale Stammzellen (hESCs), die von der Blastozyste² abgeleitet sind, und induzierte pluripotente Zellen (hiPSCs), die durch direkte Reprogrammierung somatischer Zellen erzeugt^{werden 3}. Die Entwicklung von Techniken zur Differenzierung von hPSCs in β-Zellen hat wichtige Auswirkungen sowohl auf die Grundlagenforschung als auch auf d....

Protokoll

Vor Beginn der Differenzierung wird empfohlen, die erforderliche Anzahl von inselartigen Organoiden für experimentelle Zwecke zu bestimmen. In einer 6-Well-Platte besteht ein einzelner Well mit über 80 % Konfluenz typischerweise aus 2-2,3 Millionen hPSCs. Während eine genaue Vorhersage aufgrund von Variationen der hPSC-Linien und der Differenzierungseffizienz eine Herausforderung darstellt, ist eine grobe Schätzung das 1,5-fache der Anzahl der ersten Wells. Eine effektiv gerichtete Differenzierung ergibt in der Regel 1,6 bis 2 Millionen Zellen pro Well in Sechs-Well-Platten, die alle Zellen innerhalb der Cluster und nicht ausschließlich insulinproduzierende Zellen umf....

Diskussion

Die erfolgreiche Differenzierung von hPSCs in Pankreas-β-Zellen hängt von der Optimierung aller Aspekte der routinemäßigen Kultivierung und Passage der ausgewählten hPSCs ab. Dazu gehört die Sicherstellung, dass die Zelllinie einen normalen Karyotyp aufweist, negativ für eine Mykoplasmeninfektion ist und frei von Plasmid- oder viralen Vektorgenomen ist. Darüber hinaus ist es bei der Verwendung von hiPS-Zellen wichtig, die frühesten Passagen, die sich noch in der Umprogrammierung befinden, nicht für Pilotversuch.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL TubeOne Microcentrifuge Tube	Starlabs	S1615-5500
6-well Cell culture plate	ThermoFisher Scientific	165218
AggreWell 400 6-well plate	STEMCELL Technologies	34425
Anti-Glucagon	Sigma-aldrich	G2654-100UL
Anti-Insulin	Dako	A0564
Anti-NKX6.1	Novus Biologicals	NBP1-49672SS
Anti-PDX1	Abcam	ab84987
Aphidicolin	Sigma-Aldrich	A4487
B-27 Supplement (50X), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
Bovine Serum Albumin, fatty acid free	Sigma-Aldrich	A3803-100G
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3306
Calcium/Magnesium free D-PBS	Thermo Fisher Scientific	14190144
Cyclopamine-KAAD	Calbiochem	239804
D-(+)-Glucose,BioXtra	Sigma-Aldrich	G7528
Disodium hydrogen phosphate, anhydrous	Sigma-Aldrich	94046-100ML-
DMEM plus GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	10566016	For Washing Medium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS.
DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)	Thermo Fisher Scientific	10565-018
Epredi SuperFrost Plus Adhesion slides	Thermo Fisher Scientific	10149870
Ethanol	VWR	20821.33
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10270098
Gamma-Secretase Inhibitor XX	Thermo Fisher Scientific	J64904
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement	Thermo Fisher Scientific	A1413302	Geltrex 1:1 into cold DMEM/F-12 medium to provide a final dilution of 1:100.
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A-21435
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 647	Abcam	ab150187
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 633	Thermo Fisher Scientific	A-21052
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A-11011
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	H3375-500G
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Thermo Fisher Scientific	H1399
Human FGF-7 (KGF) Recombinant Protein	Thermo Fisher Scientific	PHG0094
Hydrogen chloride	Sigma-Aldrich	295426
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen	Agar Scientific	AGG4582
LDN193189	Sigma-Aldrich	SML0559-5MG
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M9272-500G
OCT Compound 118 mL	Agar Scientific	AGR1180
PBS Tablets, Phosphate Buffered Saline, Fisher BioReagents	Thermo Fisher Scientific	7647-14-5
Penicillin-Streptomycin (PS)	Thermo Fisher Scientific,	15070-063
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7
Recombinant Human EGF Protein	R&D Systems	236-EG-200
Rectangular cover glasses, 22×50 mm	VWR	631-0137
RepSox (Hydrochloride)	STEMCELL Technologies	72394
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	61870036	For Washing Medium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS.
Shandon Immu-mount	Thermo Fisher Scientific	9990402
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014-500G
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium dihydrogen phosphate anhydrous	Sigma-Aldrich	7558-80-7
STEMdiff Endoderm	STEMCELL Technologies	5110
StemFlex Medium	Thermo Fisher Scientific	A3349401	Thaw the StemFlex Supplement overnight at 4°C, transfer any residual liquid of the supplement bottle to StemFlex Basal Medium.
Stemolecule All-Trans Retinoic Acid	Reprocell	04-0021
Thyroid Tormone 3 (T3)	Sigma-Aldrich	T6397
Trypan Blue Solution, 0.4%	ThermoFisher Scientific	15250061
TrypL Express Enzyme (1X)	Thermo Fisher Scientific	12604013
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P2287-500ML
Ultra-Low Adherent Plate for Suspension Culture	Thermo Fisher Scientific	38071
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	10977015
Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL Technologies	72302
Zinc Sulfate	Sigma-Aldrich	Z4750