De-novo-Verfolgung von Lipiden mittels stabiler Isotopenmarkierung LC-TIMS-TOF MS/MS

Zusammenfassung

Hier wird eine Methode zum Screening von Lipidstrukturen durch Markierung stabiler Isotope unter Verwendung ihrer Retentionszeit, Mobilität und Fragmentierung vorgestellt.

Zusammenfassung

Lipide sind sehr vielfältig, und kleine Veränderungen in der Lipidstruktur und -zusammensetzung können tiefgreifende Auswirkungen auf kritische biologische Funktionen haben. Die Markierung stabiler Isotope (SIL) bietet mehrere Vorteile für die Untersuchung der Lipidverteilung, -mobilisierung und des Metabolismus sowie für die De-novo-Lipidsynthese . Die erfolgreiche Implementierung der SIL-Technik erfordert die Entfernung von Interferenzen durch endogene Moleküle. In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir ein analytisches Hochdurchsatzprotokoll für das Screening von SIL-Lipiden aus biologischen Proben; Es werden Beispiele für die De-novo-Identifizierung von Lipiden während der Entwicklung der Eierstöcke von Mücken gezeigt. Der Einsatz von komplementärer Flüssigkeitschromatographie, Mobilitätsspektrometrie für gefangene Ionen und Massenspektrometrie ermöglicht die Trennung und Zuordnung von Lipiden aus einer einzelnen Probe in einem einzigen Scan (<1 h). Der beschriebene Ansatz nutzt die jüngsten Entwicklungen in der datenabhängigen Erfassung und der datenunabhängigen Erfassung, indem er parallele Akkumulation in der Mobilitätsfalle verwendet, gefolgt von sequentieller Fragmentierung und kollisionsinduzierter Dissoziation. Die Messung von SIL auf der Ebene der Fettsäurekette zeigt Veränderungen in der Lipiddynamik während der Entwicklung der Eierstöcke von Mücken. Die De-novo-Strukturen der Lipide werden basierend auf ihrer Retentionszeit, Mobilität und ihrem Fragmentierungsmuster sicher zugeordnet.

Einleitung

Bei der Analyse von Lipiddaten ist die Markierung stabiler Isotope (SIL) eine effektive Methode, um Stoffwechselwege in lebenden Organismen zu beurteilen. Bei dieser Methode werden Atome innerhalb eines Analyten durch stabile Isotope ersetzt, die ¹³C oder ²H enthalten. Diese Isotope werden weiter in Vorläufer eingebaut, die später in die Fettsäuren eingebettet werden und die Bereiche markieren, in denen sie sich befinden. Mit diesen Isotopen ist man in der Lage, die Verteilung und den Stoffwechsel von Lipiden zu identifizieren, da sie sich vom unmarkierten Hintergrund^{abheben 1}. Gängige Massenspektrometrie-Plattformen sind ....

Protokoll

1. Vorbereitung der Probe

1. Insekten-Dissektion
   1. Präparieren Sie die Eierstöcke der Aedes aegypti-Mücke im Alter von 7 Tagen in einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung mit Mikronadeln.
   2. Sammeln Sie acht Eierstöcke aus phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit Mikronadeln und lagern Sie sie in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen bei -80 °C.
   3. Sammeln Sie Eierstöcke in biologischen Replikaten.
2. Extraktion von Lipiden
   1. Geben Sie 10 μl internen Standard (ISTD) in einer Konzentration von 1 ppm in die acht entnommenen Eierstöcke. Das ISTD ist ein markiertes Lipidgemisch mit sieben Deuterium von ....

Diskussion

Bei der Bewertung der Anwendung dieses Protokolls ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Parameter DIA-PASEF und MS/MS auf die betreffenden Triglyceride anwendbar sind. Insbesondere sollten die Mobilitätsfenster und die Fensterbreite dem Muster der Triglyceride folgen. Dies kann mit einem vorherigen Lauf mit der DDA-Methode ermittelt werden. Bei der Verfolgung der Triglyceride im internen Standard sollten die Fenster für die DIA-Einrichtung alle vorab identifizierten Moleküle von Interesse abdecken. Die Fenster sol.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accucore C30 colum	Thermo Fisher Scientific	27826-252130
Bruker Compass Data Analysis	Bruker Daltonics Inc	2363525870	Version 5.2
d-Glucose-13C6	Sigma-Aldrich	389374
eppendorf tubes	Fisher Scientific	14-282-300
EquiSplash Lipidomix	Avanti Polar Lipids	330731-1EA
glass vials	Thermo Fisher Scientific	11-417-236
heavy water (2H2O)	Sigma-Aldrich	1.13366
polypropylene pestles	Fisher Scientific	BAF199230001
Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph	Shimadzu	L20234651907
silanized glass inserts	Thermo Fisher Scientific	03-251-826
Sucrose-13C12	Sigma-Aldrich	605417
timsTOF	Bruker Daltonics Inc	1.84443E+11
Tuning Mix Calibration Standard	Agilent Technologies	36