Produktion und Optimierung von LTE, einem von Leishmania tarentolae abgeleiteten zellfreien Proteinexpressionssystem für die rekombinante Proteinproduktion

Zusammenfassung

Leishmania Translational Extract (LTE) ist ein eukaryotisches zellfreies Proteinexpressionssystem, das aus dem einzelligen Parasiten Leishmania tarentolae gewonnen wird. Dieses optimierte Protokoll macht LTE einfach und kostengünstig in der Herstellung. Es eignet sich für verschiedene Anwendungen, die sich auf die multiparallele Expression und Untersuchung komplexer eukaryotischer Proteine und ihrer Wechselwirkungen konzentrieren.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Produktion und Optimierung eines eukaryotischen zellfreien Proteinexpressionssystems (CFPS), das aus dem einzelligen Flagellaten Leishmania tarentolae gewonnen wird, der als Leishmania Translational Extract oder LTE bezeichnet wird. Obwohl sich dieser Organismus ursprünglich als Parasit der Geckos entwickelt hat, kann er einfach und kostengünstig in Kolben oder Bioreaktoren kultiviert werden. Im Gegensatz zu Leishmania major ist es für den Menschen nicht pathogen und erfordert keine besonderen Laborvorsichtsmaßnahmen. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von Leishmania bei CFPS besteht darin, dass die Zugabe eines einzelnen Antisense-Oligonukleotids zum CFPS, das auf eine konservierte Spleißleader-Sequenz am 5'-Ende aller proteinkodierenden RNAs abzielt, die endogene Proteinexpression unterdrücken kann. Wir bieten Verfahren für den Zellaufschluss und die Lysatverarbeitung an, die im Vergleich zu früheren Versionen vereinfacht und verbessert wurden. Diese Verfahren beginnen mit einfachen Kolbenkulturen. Darüber hinaus erklären wir, wie genetische Informationen mithilfe von Vektoren eingeführt werden können, die speziesunabhängige Translationsinitiationsstellen (SITS) enthalten, und wie eine einfache Chargenoptimierung und Qualitätskontrolle durchgeführt werden kann, um eine gleichbleibende Proteinexpressionsqualität zu gewährleisten.

Einleitung

In den 1960er Jahren spielten zellfreie Proteinexpressionssysteme eine entscheidende Rolle bei der Aufdeckung des genetischen Codes¹. Prokaryotische zellfreie Proteinexpressionssysteme, die hauptsächlich auf E. coli basieren, dominieren derzeit jedoch sowohl im Labor als auch in der kommerziellen Anwendung. Während E. coli-basierte Systeme Vorteile wie Kosteneffizienz, Skalierbarkeit und hohe Expressionsausbeuten bieten, stehen sie vor Herausforderungen bei der Herstellung von Multi-Domain-Proteinen in ihren aktiven Formen und der Erleichterung des Zusammenbaus von Proteinkomplexen ^2,3

Protokoll

Dieses Protokoll enthält detaillierte Medienrezepte und -schritte, die das Kultivieren, Zentrifugieren, Messen der GFP-Fluoreszenz mit einem Multimode-Plattenleser, Messen des Kultur-OD_{600 nm} und Beurteilen des Lysats Abs_{280 nm} umfassen. Es behandelt auch den Aufbau und die Bildgebung von SDS-PAGE-Proteingelen. Die für dieses Protokoll erforderlichen oder vorgeschlagenen Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt. Es ist wichtig zu beachten, dass typische Laborressourcen wie Medienkomponenten, Zentrifugen, Röhrchen, Spektralphotometer und Gelelektrophorese-Setups wahrscheinlich austauschbar verwendet werd....

Diskussion

Protokolle zur Schaffung von LTE wurden in den letzten zehn Jahren veröffentlicht⁷ und regelmäßig aktualisiert^25,34. Neueinsteiger in die Technik stoßen jedoch oft auf eine steile Lernkurve, was zu Verzögerungen beim Erreichen einer qualitativ hochwertigen und ertragreichen Proteinexpression führt. Ähnliche Herausforderungen wurden von anderen Forschungsgruppen, die mit LTE³⁵.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
PD-10 SuperDex 25 Columns	Cytiva	17085101	Gel filtration columns
Nitrogen Cavitation cell disrupter	Parr Industries	4635 or 4639	Cell Disrupter
Bovine derived Hemin	Sigma-Aldrich	H5533	Culture additive
Penicillin/Streptomycin 10000U/ml	Thermo-Fisher	15140122	Antibiotic mix
Optiplate 384	Perkin-Elmer	6007290	Multiwell plate for 10ul expressions
Oligonucleotide	IDT synthesis		Oligo with sequence CAATAAAGTACAGAAACTGATAC TTATATAGCGTT
Creatine Phosphokinase	Sigma-Aldrich	9001-15-4	Enzyme
Tecan Spark	Tecan		or similar Multimode Platereader
Chemidoc MP Imager	Biorad		or similar SDS-PAGE gel Imager
4-12% Bis-Tris Gels	Invitrogen	NW04125	SDS-PAGE gels
Biophotometer	Eppendorf		or similar Cuvette Specrophotometer
Nanodrop One	Thermofisher		Nanodrop spectrophotometer
Avanti JXN-26 centrifuge	Beckman Coulter		or similar centrifuge, with rotors/tubes rated 10K and 50K g
5424R microcentrifuge	Eppendorf		or similar microcentrifuge, with 1.5ml microcentrifuge tubes
Flask Incubator Inova S44i	Eppendorf		or similar flask incubator shaker suitable for 5L Flasks
5L glass culture flasks			Baffled glass flasks for culture growth
Bactotryptone	BD	211705	Growth medium
Yeast Extract	Merck	VM930053	Growth medium
Glycerol			Any analytical grade
Glucose			Any analytical grade
KH2PO4			Any analytical grade
K2HPO4			Any analytical grade
UltraPure water	Invitrogen	10977-015	Or output from any MilliQ-type water dispenser