Bestimmung der gerinnungsfördernden Aktivität extrazellulärer Vesikel (EV) mittels EV-aktivierter Gerinnungszeit (EV-ACT)

Zusammenfassung

Dieses Protokoll untersucht die Verwendung von extrazellulärem Vesikel (EV)-reichem Plasma als Indikator für die Gerinnungsfähigkeit von EV. EV-reiches Plasma wird durch einen Prozess der Differenzzentrifugation und anschließenden Rekalkifizierung gewonnen.

Zusammenfassung

Die Rolle extrazellulärer Vesikel (EV) bei verschiedenen Erkrankungen gewinnt zunehmend an Aufmerksamkeit, insbesondere aufgrund ihrer starken gerinnungsfördernden Wirkung. Es besteht jedoch ein dringender Bedarf an einem Test am Krankenbett, um die gerinnungsfördernde Aktivität von EV im klinischen Umfeld zu bewerten. In dieser Studie wird die Verwendung der Thrombinaktivierungszeit von EV-reichem Plasma als Maß für die prokoagulanziale Aktivität von EV vorgeschlagen. Standardisierte Verfahren wurden verwendet, um Natriumcitrat-Vollblut zu erhalten, gefolgt von einer Differenzzentrifugation, um EV-reiches Plasma zu erhalten. Das EV-reiche Plasma und Calciumchlorid wurden in den Testbecher gegeben, und die Änderungen der Viskoelastizität wurden in Echtzeit mit einem Analysator überwacht. Die natürliche Gerinnungszeit von EV-reichem Plasma, bezeichnet als EV-ACT, wurde bestimmt. Die Ergebnisse zeigten einen signifikanten Anstieg des EV-ACT, wenn EV aus dem Plasma gesunder Freiwilliger entfernt wurde, während es signifikant abnahm, wenn EV angereichert wurde. Darüber hinaus war EV-ACT in humanen Proben von Präeklampsie, Hüftfrakturen und Lungenkrebs erheblich verkürzt, was auf erhöhte Plasma-EV-Spiegel und die Förderung der Bluthyperkoagulation hindeutet. Mit seinem einfachen und schnellen Verfahren ist der EV-ACT ein vielversprechender Test am Krankenbett zur Beurteilung der Gerinnungsfunktion bei Patienten mit hohen EV-Plasmaspiegeln.

Einleitung

Thrombosen, die durch Hyperkoagulabilität verursacht werden, spielen eine bedeutende Rolle bei verschiedenen Erkrankungen, darunter Hirntrauma¹, Präeklampsie², Tumore³ und Frakturpatienten⁴. Der Mechanismus, der der Hyperkoagulabilität zugrunde liegt, ist komplex, und in jüngster Zeit wurde der Schwerpunkt auf die Rolle extrazellulärer Vesikel (EV) bei Gerinnungsstörungen gelegt. EVs sind vesikelartige Körper mit einer Doppelschichtstruktur, die sich von der Zellmembran lösen und einen Durchmesser von 10 nm bis 1000 nm haben. Sie sind mit einer Vielzahl von Krankheitsprozessen assoziiert, insbesondere mit Gerinnungsstörungen⁵. Mehrere Studien haben EVs als vielversprechenden Prädiktor für das Thromboserisiko identifiziert ^6,7. Die gerinnungsfördernde Aktivität von EVs hängt von der Expression von Gerinnungsfaktoren ab, vor allem von Tissue Factor (TF) und Phosphatidylserin (PS). EVs mit robuster prokoagulanziöser Aktivität verbessern signifikant die katalytische Effizienz von Tenase und Prothrombin-Komplex und fördern dadurch Thrombin-vermitteltes Fibrinogen und lokale Thrombosen⁸. Erhöhte Konzentrationen von EVs und ihr kausaler Zusammenhang mit der Hyperkoagulabilität wurden bei zahlreichen Erkrankungen beobachtet⁹. Folglich ist die Standardisierung der Detektion von Elektrofahrzeugen und die Berichterstattung über ihre gerinnungsfördernde Aktivität ein wichtiges Forschungsgebiet¹⁰.

Bisher gibt es nur wenige kommerzielle Kits zum Nachweis der gerinnungsfördernden Aktivität von Elektrofahrzeugen. Der MP-Activity-Assay und der MP-TF-Assay, die von einem kommerziellen Unternehmen hergestellt werden, sind funktionelle Assays, die zur Messung der prokoagulanziellen Aktivität von EV in Plasma¹¹ verwendet werden. Diese Assays verwenden ein ähnliches Prinzip wie enzymengebundene Immunosorbent-Assays, um PS und TF auf EVs nachzuweisen. Diese Kits sind jedoch teuer und auf wenige hochrangige Forschungseinrichtungen beschränkt. Der Prozess ist komplex und zeitaufwändig, was es schwierig macht, sie im klinischen Umfeld umzusetzen. Darüber hinaus mischt ein kommerziell entwickelter prokoagulanziöser Phospholipid-Assay (PPL) PS-freies Plasma mit Testplasma und misst die Gerinnungszeit, um PS-positive EVs quantitativ^{nachzuweisen12}. Diese Assays konzentrieren sich jedoch in erster Linie auf PS und TF bei Elektrofahrzeugen und übersehen andere Gerinnungswege, an denen zirkulierende Elektrofahrzeuge beteiligt sein können¹².

Das Plasma-Koagulationssystem ist kompliziert und besteht sowohl aus "unsichtbaren" als auch aus "sichtbaren" Komponenten, einschließlich Koagulanzien, Antikoagulanzien, fibrinolytischen Systemen und EVs, die im Plasma suspendiert sind. Physiologisch sorgen diese Komponenten für ein dynamisches Gleichgewicht. Bei pathologischen Zuständen tragen signifikant erhöhte EVs im Kreislauf zur Hyperkoagulabilität bei, insbesondere bei Patienten mit Hirntrauma, Präeklampsie, Frakturen und verschiedenen Krebsarten¹³. Derzeit umfasst die Bewertung des Gerinnungsstatus in klinischen Laboratorien in erster Linie die Beurteilung des Gerinnungssystems, des Antikoagulationssystems und der Fibrinolyse 14,15,16,17. Die Prothrombinzeit, die aktivierte partielle Thromboplastinzeit, die Thrombinzeit und das international normalisierte Verhältnis werden üblicherweise verwendet, um die Gerinnungsfaktorspiegel im Gerinnungssystem zu bewerten¹⁸. Neuere Studien haben jedoch gezeigt, dass diese Tests die Hyperkoagulabilität bestimmter Krankheiten nicht vollständig widerspiegeln¹⁹. Andere Testmethoden, wie die Thromboelastometrie (TEG), die Rotations-TEG und die Sonoklotenanalyse, messen viskoelastische Veränderungen im Vollblut^20,21. Da Vollblutproben zahlreiche Blutzellen und Blutplättchen enthalten, ist es wahrscheinlicher, dass diese Tests den Gerinnungsstatus der gesamten Probe anzeigen. Einige Forscher haben über die Rolle von Blutzellen und Blutplättchen bei der gerinnungsfördernden Aktivität berichtet^22,23. Eine kürzlich durchgeführte Studie ergab auch, dass frühere Gerinnungsfunktionstests Schwierigkeiten haben, Veränderungen in der prokoagulanziellen Aktivität von Mikropartikeln zu erkennen²⁴. Daher wurde die Hypothese aufgestellt, dass die prokoagulanziöse Funktion von EVs durch viskoelastische Messungen der aktivierten Gerinnungszeit (ACT) in EV-reichem Plasma bewertet werden kann.

Protokoll

Die Entnahme menschlicher Proben wurde von der medizinischen Ethikkommission des Allgemeinen Krankenhauses der Medizinischen Universität Tianjin genehmigt. Die Entnahme von menschlichem venösem Blut folgte streng der von der Nationalen Gesundheitskommission Chinas herausgegebenen Richtlinie, nämlich WS/T 661-2020 Guideline for Collection of Venous Blood Specimens. Kurz gesagt, Blut wurde von gesunden Personen mit informierter Zustimmung aus der vorderen Armvene entnommen, und die Proben wurden mit 3,2% Natriumcitrat-Antikoagulans in einem Verhältnis von 1:9 gemischt. Als nur Proben von Natriumcitrat-Antikoagulanzien gesammelt wurden, wurde das erste Sammelgefäß verworfen. Der Verarbeitungsablauf wurde innerhalb von 0,5 h nach der Probenentnahme eingeleitet. Erwachsene gesunde Probanden wurden nach Einholung der Einverständniserklärung für die Probenentnahme rekrutiert. Die Ausschlusskriterien der Patienten waren: (1) eine kürzlich aufgetretene intravaskuläre Thrombose, (2) Beeinträchtigung der Leber- und Nierenfunktion, (3) Bluthochdruck, Hyperlipidämie, Diabetes und andere chronische Krankheiten, (4) Behandlung mit Aspirin oder Antikoagulanzien, (5) Menstruation und Schwangerschaft.

1. Isolierung von EV-reichem Plasma

1. Zentrifugieren Sie die Proben bei 120 x g für 20 Minuten bei Raumtemperatur, um Blutzellen zu entfernen. Der Überstand ist plättchenreiches Plasma. Dann wird die obere Hälfte des Überstandes mit einer Pipette in ein neues Zentrifugenröhrchen überführt.
2. Zentrifugieren Sie das plättchenreiche Plasma bei 1500 x g für 20 Minuten bei Raumtemperatur, um die Blutplättchen zu entfernen. Der Überstand ist plättchenarmes Plasma. Anschließend wird das obere 1/2 des Überstandes in ein neues Zentrifugenröhrchen überführt.
3. Zentrifugieren Sie das plättchenarme Plasma bei 13000 x g für 2 min bei Raumtemperatur, um Zelltrümmer zu entfernen. Bei dem Überstand handelt es sich um EV-reiches Plasma. Übertragen Sie dann die obere Hälfte des Überstandes zur anschließenden Prüfung in ein neues Zentrifugenröhrchen.

2. Detektion von EV-ACT der Probe durch den Analysator

1. Schalten Sie den Gerinnselanalysator ein (siehe Materialtabelle) und heizen Sie das Gerät auf 37 °C vor. Installieren Sie die Einwegsonde und den Testbecher und starten Sie dann die Qualitätskontrolle der Maschine.
   HINWEIS: Wenn der Signalwert des viskosen Widerstands auf dem Bildschirm als gerade Linie angezeigt wird, bedeutet dies, dass die Erkennung nicht beeinträchtigt wird und die Qualitätskontrolle des Analysatorstatus qualifiziert ist. Das Testverfahren kann nach Qualifizierung des Selbsttests gestartet werden.
2. Geben Sie Probeninformationen in das System ein. Anschließend werden 200 μl EV-reiches Plasma in den Testbecher gegeben, gefolgt von 20 mM 170 μl Calciumchlorid. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start. Der magnetische Rührstab im Testbecher mischt die Probe und das Kalziumchlorid vollständig. Schließen Sie die Abdeckung, und die Sonde beginnt, die Änderung des Probenwiderstands zu erkennen.
   HINWEIS: Nachdem der Test abgeschlossen ist, gibt der Analysator automatisch die Meldung "Test abgeschlossen" aus. Die Uhrzeit von EV-ACT wird vom System angezeigt und aufgezeichnet. Das Ergebnis wird in der Zeiteinheit "Sekunde" ausgedrückt. Entsorgen Sie die Sonde und testen Sie den Becher.

3. Durchflusszytometrie-basierte Qualitätskontrolle der EV-reichen Plasmaprobe

1. EVs wurden zunächst anhand ihrer Größe (0,1-1 μm) identifiziert. Stellen Sie die Parameter des Durchflusszytometers im Voraus ein und stellen Sie das "Gate" von EV mit handelsüblichen Polystyrolkügelchen (0,5, 0,9 und 3,0 μm) ein (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Die Kügelchenmischung besteht aus fluoreszierenden Kugeln mit unterschiedlichen Durchmessern, die den Größenbereich von Mikrovesikeln (0,5 und 0,9 μm) und Blutplättchen (0,9 μm und 3 μm) abdecken.
2. Stellen Sie die Spannung der Durchlassstreuung und der Seitenstreuung ein und stellen Sie sicher, dass die 0,9 μm-Mikrokugeln in den entsprechenden Bereich fallen. Der EV-Bereich kann entsprechend dem Durchmesser der Mikrokugel gezeichnet werden.
3. 50 μl EV-reiches Plasma in das Durchflussrohr überführen, gefolgt von 450 μl filtrierter Phosphatpuffersalzlösung. Mischen Sie die Flüssigkeit im Durchflussrohr gründlich durch. Abschließend werden die Proben mittels Durchflusszytometrie²⁵ detektiert.
4. Verwenden Sie Ultra Rainbow Fluoreszenzpartikel (siehe Materialtabelle), um die Anzahl der EVs.In kurz zu quantifizieren, fügen Sie der Probe vor der Durchflussdetektion 10 μl der Partikel hinzu und berechnen Sie die EV-Konzentration nach Abschluss der Probendetektion mit der folgenden Formel: 10.120 * EV (#) / (Mikroperlen * Volumen) * Verdünnungsfaktor²⁶.

Ergebnisse

Die Thrombinaktivierungszeit von EV-reichem Plasma wurde mit einem viskoelastischen Methodenanalysator zur Messung der Plasmakoagulationszeit gemessen. Die Maschine besteht aus vier Hauptkomponenten: einem elektronischen Signalwandler, einer Sonde, einem Detektionsbehälter und einem Heizelement (Abbildung 1A,B). Die Sonde nutzt hochfrequente Schwingungen mit geringer Amplitude, um Änderungen der Plasmaviskosität zu erkennen. Die tägliche Qualitätskontrolle umfasst in er...

Diskussion

In dieser Studie wurde die Herstellung von EV-reichem Plasma beschrieben und die Rationalität der Methode mittels Durchflusszytometrie überprüft. Anschließend wurden die rekalzifizierten Plasmaproben für die ACT-Zeit unter Verwendung eines Gerinnselanalysators analysiert, der auf Viskoelastizitätsprinzipien²⁴ basiert. Wie in Abbildung 3A gezeigt, wurde festgestellt, dass die Konzentration von EVs, die durch Ultrazentrifugation erhalten wurden, die EV-ACT-Zeit ve...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles	3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USA		For quantitative detection of MP
Calcium chloride	Werfen (china)	0020006800	20 mM
Century Clot analyzer	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd		The principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method
Disposable probe and test cup	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd
LSR Fortessa flow cytometer	BD, USA		Used to detect MP
Megamix polystyrene beads	Biocytex, Marseille, France	7801	The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 µm, 0.9 µm and 3 µm.