Echtzeit-Nachweis von Ferulasäure-Effekten auf den linken Ventrikel der Ratte mit einem Druck-Volumen-Leitfähigkeitskatheter

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Messung des linksventrikulären Drucks und Volumens unter Verwendung der Druck-Volumen-Leitfähigkeitstechnik. Diese Methode ermöglicht eine kontinuierliche Echtzeitüberwachung der Auswirkungen von Medikamenten auf das Herz.

Zusammenfassung

Eine verminderte Herzfunktion kann sich negativ auf andere Organe auswirken. Die linksventrikuläre Druck-Volumen-Beziehung gilt als valide Methode zur Beurteilung der Herzfunktion. Die Echtzeitüberwachung der Herzfunktion ist wichtig für die Arzneimittelbewertung. Unter geschlossenen Thoraxbedingungen tritt der Miniaturwandler, der ein wichtiger Bestandteil des Druckvolumenkatheters ist, durch die rechte Halsschlagader in den linken Ventrikel der Ratte ein. Das Gerät visualisiert die Veränderungen der Herzfunktion während des Experiments in Form einer Druck-Volumen-Schleife. Das tatsächliche Volumen des Ventrikels wird berechnet, indem die Leitfähigkeit des Blutes verändert wird, indem 50 μl einer 20%igen Natriumchloridlösung in die linke Halsvene der Ratte injiziert werden. Das tatsächliche Volumen der Ventrikelhöhle der Ratte wird berechnet, indem die Leitfähigkeit des Blutes in einem bekannten Volumen mit einem Druck-Volumen-Leitfähigkeitskatheter gemessen wird. Dieses Protokoll ermöglicht eine kontinuierliche Beobachtung der Auswirkungen von Medikamenten auf das Herz und wird die Begründung für den Einsatz von ethnischen Spezialmedikamenten bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen fördern.

Einleitung

Herz-Kreislauf-Erkrankungen haben die höchste Sterblichkeitsrate der Welt¹. Zu den Ursachen gehören Koronararterienstenose (Myokardischämie), Koronararterienblockade (Myokardinfarkt) und Ischämie-Reperfusionsschäden². Da sich das Herz in einem konstanten systolischen und diastolischen Zyklus befindet, ist es einer der energieintensivsten Teile des Körpers. Wenn die Koronararterien Schwierigkeiten haben, ausreichend Energie und Sauerstoff aufrechtzuerhalten, nimmt die Herzfunktion unweigerlich ab, was sich negativ auf andere Organe auswirkt ^3,4. Das Herz ist ein Kraftwerk im Kreislaufsystem, und die Herzfunktion muss rational beurteilt werden.

Die Beurteilung der Herzfunktion durch ventrikuläre Druck- und Volumenbeziehungen gilt als umfassende Methode⁵. Echtzeitänderungen des ventrikulären Drucks und des ventrikulären Volumens während des gesamten Herzzyklus bilden die Druck-Volumen-Schleife. Die ventrikuläre Druck-Volumen-Schleife ermöglicht die quantitative Analyse der Herzfunktion und der Reservekapazität in Bezug auf verschiedene Phasen und Energien des Ventrikels. Der normale Ventrikel hat ein kleines endsystolisches Volumen mit guter Schwebungsarbeit und Effizienz ^5,6,7.

Die Druck-Volumen-Leitungskathetertechnik ist eine invasive Methode zur Erkennung des Zustands des linken Ventrikels. Es kann verwendet werden, um eine kontinuierliche Echtzeit-Druck-Volumen-Schleife⁸ zu erhalten. Druckvolumetrische Leitfähigkeitskatheter sind leistungsstarke Werkzeuge, und solide Handhabungsverfahren sind für reproduzierbare und zuverlässige Ergebnisse unerlässlich, einschließlich der In-vivo-Analyse der parallelen Leitfähigkeit des Myokards während der Kochsalzkalibrierung und der In-vitro-Messung der Blutleitfähigkeit bei der Küvettenkalibrierung³.

Ferulasäure (FA), eine Phenolsäure, ist in Pflanzenreichen wie Avena sativa und Ligusticum chuanxiong hort ^9,10 weit verbreitet. Ferulasäure hat pharmakologische Wirkungen zur Senkung des Blutdrucks und von Herzrhythmusstörungen. FA ist ein bioaktives Naturprodukt mit mehreren Funktionen. FA kann oxidativen Schäden widerstehen, Entzündungsreaktionen reduzieren, die Thrombozytenaggregation hemmen und koronare Herzkrankheiten und Arteriosklerose verhindern¹¹. Die meisten Studien zu Ferulasäure haben sich jedoch auf einen Aspekt des Herzens konzentriert, und selten wurden die Auswirkungen von Ferulasäure im Kreislaufsystem untersucht 12,13,14,15. Hier beschreiben wir einen geschlossenen Brustansatz für die Isofluran-Anästhesie in Kombination mit Ketamin (50 mg/kg) mit Schwerpunkt auf der kardialen Reaktion auf Ferulasäurelösung während der Injektion der Halsvene.

Wir beschreiben das vollständige Verfahren für die Verwendung des Werkzeugs unter geschlossenen Thoraxbedingungen, einschließlich Lösungsvorbereitung, Vorbereitung des Schallkopfs, präexperimentelle Rattenvorbereitung, Kathetereinführung in die rechte Halsschlagader und Datenanalyse. Die Dauer des Experiments beträgt in der Regel weniger als 4 h und wird durch die verschiedenen Versuchsprotokolle bestimmt. In einem einzigen Experiment können wir detaillierte Herzinformationen wie linksventrikulären Druck, Volumen und Herzfrequenz erhalten.

Protokoll

Das Tierprotokoll wurde von der Ethikkommission für experimentellen Tierschutz der Universität Chengdu überprüft und genehmigt (Aktenzeichen 2023-04). Für die vorliegende Studie wurden männliche Sprague Dawley (SD)-Ratten (280 ± 20 g, 8-10 Wochen alt) verwendet. Die Ratten wurden in einer Tierkammer gehalten und durften frei trinken und essen.

1. Vorbereitung der Lösung

1. Bereiten Sie eine 0,9%ige NaCl-Lösung vor, die verwendet wird, um den Arbeitsbereich ausreichend feucht zu halten.
2. Um eine 20%ige hypertone NaCl-Lösung herzustellen, lösen Sie 2 g NaCl in 10 ml doppelt destilliertem Wasser (ddH₂O). Um die parallele Leitfähigkeit des Myokards zu bestimmen, ist es notwendig, die Leitfähigkeit der intraventrikulären Flüssigkeit zu verändern.
3. Bereiten Sie 1% ige enzymaktive Waschmittelpulverlösung vor. Verwenden Sie dies nach Abschluss des Experiments, um den elektrischen Druck-Volumen-Katheter 1-2 h lang in die Lösung zu tauchen.
4. Bereiten Sie die FA-Lösung vor, indem Sie 10 mg Ferulasäure in 20 ml ddH₂O lösen. Filtern Sie die Lösung durch eine 0,22-μm-Membran. Injizieren Sie der Ratte 1 ml/kg Ferulasäurelösung.

2. Vorbereitung des Sensors

1. Tauchen Sie den Druck-Volumen-Sensor vor Beginn des Experiments etwa 30-60 min lang in 0,9%ige NaCl-Lösung bei 37 °C, was die Stabilität der experimentellen Daten erleichtert.
2. Schließen Sie die Versuchsapparatur an. Das System zur Messung von Druck-Volumen-Schleifen besteht aus einem Druck-Volumen-Katheter, zwei Steuereinheiten, einer Aufzeichnungseinheit und einer computergesteuerten Software. Das Druck-Volumen-Schleifenmodul in der Software bietet ein experimentelles Referenzverfahren.
3. Drücken Sie die Start-Taste und die Software zeichnet automatisch die Überwachungsdaten des Druck-Volumen-Sensors auf.
4. Verwenden Sie die Miro-Tip Pressure Volume (MPVS) Software, um den Druck und die Leitfähigkeit zu kalibrieren.

3. Vorbereitung von Ratten vor dem Versuch

1. Verabreichen Sie den Ratten Ketamin (50 mg/kg) und Fentanyl (0,25 mg/kg) durch intramuskuläre Injektion⁵.
2. Kneifen Sie die Zehen der Ratten, um die Narkosetiefe durch das Fehlen von Reflexen zu überprüfen. Emotionen beeinflussen den physiologischen Zustand von Ratten und Schmerzen verursachen Veränderungen der Herzfunktion¹⁶. Verwenden Sie Kleintierrasierer und Enthaarungscremes, um Haare an Operationsstellen zu entfernen. Verwenden Sie Jodophor und 75% Alkohol, um die Haut abzuwischen, um die Sterilität zu erhalten.
3. Vollständig betäubte Ratten auf einer isothermen Heizplatte immobilisieren, wobei die Rückseite mit der Heizplatte in Kontakt ist.
4. Führen Sie einen mit Vaseline beschichteten Temperaturfühler in das Rektum der Ratte ein. Halten Sie die Körpertemperatur der Ratte bei 37 °C ± 0,5, indem Sie die Heizplatte einstellen.
   HINWEIS: Es ist notwendig, die Atemwege während des Experiments frei zu halten.

4. Kathetereinführung in die rechte Halsschlagader

1. Die Haut auf der rechten Seite der Mittellinie des Halses von Ratten in Längsrichtung einschneiden. Machen Sie einen 4 cm langen Schnitt und trennen Sie Muskel- und Bindegewebe mit einer Pinzette. Die Halsschlagader auf der rechten Seite der Luftröhre ist sichtbar. Die rechte Halsschlagader der Ratte ist dunkelrot, stark pulsierend und hat parallel dazu einen weißen Vagusnerv.
2. Trennen Sie die Halsschlagader mit einer Pinzette von anderen Geweben und Nerven. Platzieren Sie drei 5-0-Operationslinien unterhalb der sauberen Halsschlagader. Tropfen Sie sterile 0,9%ige Natriumchloridlösung auf den Operationsbereich, um die Befeuchtung der Halsschlagader aufrechtzuerhalten.
3. Schneiden Sie die Haut über dem linken Schlüsselbein ab und ziehen Sie das Gewebe um die Halsvene ab. Legen Sie dann einen 5-0-chirurgischen Faden unter die linke Halsvene.
4. Verwenden Sie arterielle Clips, um den Blutfluss proximal zu unterbrechen, und schneiden Sie mit einer Mikroschere einen Abschnitt im Gefäß ab, an dem der Blutfluss gestoppt wurde. Es ist normal, dass eine kleine Menge Blut im Wundquerschnitt auftritt. Wenn das Blut schnell und intermittierend aus dem Gefäß austritt, heben Sie die proximale chirurgische Leitung an und legen Sie die arterielle Klemme erneut an.
5. Führen Sie den Katheter aus dem Querschnitt entlang der Halsschlagader tief in die linke Herzkammer ein. Stellen Sie sicher, dass der niedrigste systolische Druckwert nach dem Eintritt in den linken Ventrikel nahe 0 mmHg liegt.
6. Um ein vernünftiges Druck-Volumen-Verhältnis zu erhalten, passen Sie den Druck-Volumen-Katheter in der Ventrikelkammer leicht an. Um einen massiven Blutverlust zu verhindern und zu verhindern, dass sich der Katheter aufgrund des Herzschlags ändert, ligieren Sie das proximale Ende der chirurgischen Leitung.
   Anmerkungen: Die Körpertemperatur, der Anästhesiepegel, das Drucksignal und das Leitwertsignal der Ratte sollten während dieses Vorgangs stabil bleiben. Die Atemwege der Ratte sollten offen gehalten werden.

5. Injektion von Medikamenten und Kalibrierung der Leitfähigkeit

1. Behalten Sie die Position des Druckvolumenkatheters in der Ventrikelkammer bei, nachdem sich die Daten stabilisiert haben, ligieren Sie die chirurgische Leitung distal der ligierten Jugularvene und injizieren Sie langsam bis zu 1 ml/kg Ferulasäurelösung. 5-10 min beobachten.
2. Injizieren Sie 50 μl 20% NaCl-Lösung aus der linken Halsvene, um die vom Myokard erzeugte parallele Leitfähigkeit zu entfernen. Der Volumenbereich des parallelen Leitwerts betrug ungefähr 130-280 μL⁵. Wiederholen Sie dies 3x im Abstand von 2 min.
3. Nach ventrikulären Druck- und Volumentests bei Ratten wird mit einer Blutentnahmenadel Blut aus der Bauchaorta der Ratte entnommen. Geben Sie das gesammelte Blut in ein Natriumheparin-Sammelröhrchen und drehen Sie es 2x auf und ab, um eine Blutgerinnung zu verhindern. Euthanasieren Sie die Versuchsratten, indem Sie 120 mg/kg Pentobarbital-Natrium durch die linke Halsvene injizieren.
4. Führen Sie die Umrechnung der gemessenen Leitfähigkeit in das tatsächliche Blutvolumen mit Hilfe von Rattenvolumen-Kalibrierröhrchen durch. Geben Sie mit Natriumheparin gemischtes Blut nacheinander in die Öffnungen des Kalibrierröhrchens, und der Katheter erkennt die Leitwerte des Blutes in den verschiedenen Öffnungen und zeichnet sie im Druck-Volumen-Überwachungsmodul auf.

6. Datenanalyse

1. Durch Hinzufügen des gemessenen Leitfähigkeitswerts eines bekannten Blutvolumens an der angegebenen Stelle zeichnet die Software automatisch die Kurve auf und extrapoliert die Leitfähigkeit des Blutes. Verwenden Sie mindestens drei Sätze von Blutleitfähigkeitswerten, um die Blutleitfähigkeit der zu testenden Ratte abzuleiten. Die Blutleitfähigkeit wird individualisiert. Führen Sie dieses Verfahren für jede getestete Ratte einzeln durch.
2. Hypertonische Kalibrierung: Durch Hinzufügen der Daten aus drei Injektionen von hypertoner Kochsalzlösung an einer bestimmten Stelle berechnet die Software parallele Leitwertmittelwerte und kalibriert automatisch die experimentellen Daten.
3. Verwenden Sie Regionen mit stabilen Blutdruck- und Leitwertwerten, um die linksventrikuläre Funktion von Ratten zu analysieren.
4. Klicken Sie auf Analysieren und die Software berechnet automatisch eine Vielzahl von Parametern basierend auf dem ausgewählten Bereich, einschließlich EF (linksventrikuläre Ejektionsfraktionen), SW (Schlaganfall) und CO (Herzzeitvolumen) usw.

Ergebnisse

Jeder Test (n = 3) basierte auf dem Eintritt eines Druck-Volumen-Leitfähigkeitskatheters in den linken Ventrikel. Es gibt signifikante Signaländerungen, wie z. B. eine deutliche Erhöhung des Druckbereichs, wenn der Katheter von der Halsschlagader in den linken Ventrikel eintritt (Abbildung 1). Die grafische Analyse der Druck-Volumen-Beziehung wird durch die Darstellung des Volumens (μL) auf der Y-Achse und des Drucks (mmHg) auf der X-Achse vervollständigt. Der linksventrikuläre Druck d...

Diskussion

Es ist wichtig, eine rationale Dosierungsstrategie für verschiedene Zustände der Herzfunktion zu verfolgen. Die Druck-Volumen-Leitfähigkeitskatheter-Technik ist die intuitivste Methode zur Untersuchung der linksventrikulären Funktion⁵. Diese Methode ermöglicht es, die Auswirkungen von Medikamenten auf die Herzfunktion aus einer Gesamtperspektive zu untersuchen. Wir beschreiben die verschiedenen Phasen des Experiments im Detail. Dies wird eine gewisse Erleichterung für die Untersuchung der He...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	Sartorius AG, Germany	-
Animal temperature maintainer	Rayward Life Technology Co., Ltd	69020
Dual Bio Amp	Millar, Inc., USA	DA-100
Enzyme-Active Powdered Detergent	Alconox Inc., USA	1104
Ferulic acid	Macklin Biochemical Co., Ltd,Shanghai, China	F900027
Mikro-Tip Catheter Transducers, SPR-838NR	Millar, Inc., USA	SPR-838NR
Millar Miro-Tip Pressure Volume (MPVS) Ultra	Millar, Inc., USA	SPR-869
Pet electric clippers	Jinyun County New Concept Home Supplies Co., Ltd.	-
Power Lab 8 / 35	Millar, Inc., USA	PL3508
Sodium Chloride, NaCl	Kelong Chemical Reagent, Chengdu, China	KX829463
Veet hair removal cream	Shanghai Songqi E-commerce Co., Ltd.	3226470