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  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Campylobacter ist weltweit die Hauptursache für bakterielle lebensmittelbedingte Gastroenteritis. Obwohl Betriebe Maßnahmen ergreifen, um die Prävalenz in ihren Einrichtungen zu reduzieren, erreichen kontaminierte Produkte durchweg die Verbraucher. Die in den letzten zwölf Jahren entwickelte Technik adressiert die Grenzen bestehender Methoden zur Isolierung und zum Nachweis von Campylobacter spp. aus rohem Fleisch.

Zusammenfassung

Dieser Artikel stellt ein schnelles und dennoch robustes Protokoll zur Isolierung von Campylobacter spp. aus rohem Fleisch vor, wobei der Schwerpunkt auf Campylobacter jejuni und Campylobacter coli liegt. Das Protokoll baut auf etablierten Methoden auf und gewährleistet die Kompatibilität mit den vorherrschenden Techniken, die von Aufsichtsbehörden wie der Food and Drug Administration (FDA) und dem US-Landwirtschaftsministerium (USDA) in den USA sowie der Internationalen Organisation für Normung (ISO) in Europa verwendet werden. Im Mittelpunkt dieses Protokolls steht das Sammeln eines Rinsats, das in Bolton-Bouillon-Medien, die Pferdeblut enthalten, konzentriert und resuspendiert wird. Dieses Medium erleichtert nachweislich die Rückgewinnung von gestressten Campylobacter-Zellen und reduziert die erforderliche Anreicherungsdauer um 50%. Die angereicherten Proben werden dann auf Nitrozellulosemembranen auf Brucellaplatten übertragen. Um die Sensitivität und Spezifität der Methode zu verbessern, wurden 0,45 μm und 0,65 μm porengroße Filtermembranen evaluiert. Die Daten zeigten eine 29-fache Steigerung der Zellrückgewinnung mit dem 0,65-μm-Porengrößenfilter im Vergleich zum 0,45-μm-Porengrößenfilter ohne Beeinträchtigung der Spezifität. Die hochbeweglichen Eigenschaften von Campylobacter ermöglichen es den Zellen, sich aktiv durch die Membranfilter in Richtung des Agarmediums zu bewegen, was eine effektive Isolierung reiner Campylobacter-Kolonien ermöglicht. Das Protokoll beinhaltet einen quantitativen Multiplex-Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktions-Assay (mqPCR), um die Isolate auf Speziesebene zu identifizieren. Diese molekulare Technik bietet ein zuverlässiges und effizientes Mittel zur Artbestimmung. Untersuchungen, die in den letzten zwölf Jahren mit Fleisch im Einzelhandel durchgeführt wurden, haben gezeigt, dass diese Methode die Rückgewinnung von Campylobacter aus natürlich kontaminierten Fleischproben im Vergleich zu aktuellen Referenzmethoden verbessern kann. Darüber hinaus zeichnet sich dieses Protokoll durch eine reduzierte Vorbereitungs- und Verarbeitungszeit aus. Damit stellt es eine vielversprechende Alternative für die effiziente Rückgewinnung von Campylobacter aus Fleisch dar. Darüber hinaus kann dieses Verfahren nahtlos in DNA-basierte Methoden integriert werden, was ein schnelles Screening positiver Proben sowie eine umfassende Analyse der Gesamtgenomsequenzierung ermöglicht.

Einleitung

Campylobacter spp. sind weltweit die Hauptursache für bakterielle lebensmittelbedingte Gastroenteritis mit geschätzten 800 Millionen Fällen pro Jahr1. Als wichtiges zoonotisches Bakterium besiedelt Campylobacter auf natürliche Weise den Magen-Darm-Trakt einer Vielzahl von Tieren, darunter Wildvögel, Nutztiere und Haustiere2. Bei der Schlachtung oder Lebensmittelverarbeitung kontaminieren Campylobacter spp. häufig Schlachtkörper oder Fleischerzeugnisse3. Campylobacteriose ist in der Regel mit dem Verzehr von ungekochtem Geflügel oder einer Kreuzkontamination anderer Lebensmittel durch rohe Geflügelsäfte verbunden2. Es kann schwerwiegende Komplikationen wie das Guillain-Barré-Syndrom, reaktive Arthritis und Septikämie bei immungeschwächten Personen verursachen4. Der Nachweis und die Isolierung von Campylobacter aus Lebensmittelquellen, insbesondere Geflügelprodukten, ist für die Überwachung der öffentlichen Gesundheit, die Untersuchung von Ausbrüchen und die Risikobewertung unerlässlich.

Konventionelle kulturbasierte Methoden sind die traditionellen und Standardmethoden für den Campylobacter-Nachweis 5,6. Es gibt jedoch mehrere Einschränkungen, darunter lange Inkubationszeiten (48 Stunden oder mehr), geringe Empfindlichkeit (bis zu 50 %), die nicht für alle Stämme gelten (einige gestresste Campylobacter-Zellen wachsen möglicherweise nicht gut oder gar nicht in den Medien)7. Molekulare Methoden wie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) sind schneller und empfindlicher als kulturbasierte Methoden, liefern jedoch keine lebensfähigen Isolate für die weitere Charakterisierung 8,9.

Immunologische Methoden sind alternative und ergänzende Methoden zum Campylobacter-Nachweis . Diese sind schnell, einfach und vielseitig, haben aber auch mehrere Einschränkungen, darunter Kreuzreaktivität (einige Antikörper können an Nicht-Campylobacter-Bakterien oder andere Substanzen binden, die ähnliche Antigene aufweisen), geringe Spezifität (einige Antikörper binden möglicherweise nicht an alle Campylobacter-Stämme oder -Serotypen) und Anforderungen an die Probenvorbereitung (immunologische Methoden erfordern häufig eine Vorbehandlung der Proben, um störende Substanzen zu entfernen und die Bindung der Antikörper zu verbessern)10.

Innerhalb der Gattung Campylobacter verursachen C. jejuni und C. coli die meisten Campylobacter-Infektionen beim Menschen (81 % bzw. 8,4 %)11. Beide sind spiralförmige, mikroaerophile und thermophile Bakterien, die ein unipolares Flagellum oder bipolare Flagellen enthalten. Die Rotation eines Flagellums an jedem Pol gilt sowohl als primäre Antriebskraft für seine charakteristische Korkenziehermotilität als auch als entscheidend für seine Pathogenese, da es dem Bakterium ermöglicht, durch die viskose Schleimhaut des Magen-Darm-Trakts des Wirts zu schwimmen. Die Motilität von Campylobacter wird durch sein chemosensorisches System gesteuert, das es den Zellen ermöglicht, sich in günstige Umgebungen zu bewegen12,13. Basierend auf der Zellmorphologie und den physiologischen Eigenschaften von Campylobacter wurde in einigen Studien die Membranfiltration zur Isolierung von Campylobacter spp. aus Kot- und Umweltproben verwendet 14,15,16.

Diese Studie stellt ein schnelles und robustes Protokoll für die Isolierung und den anschließenden Nachweis von C. jejuni und C. coli aus rohem Fleisch vor, das die Nachteile der bestehenden Methoden überwindet und mehrere Vorteile bietet. Vorläufige Kolonien können mit einer Vielzahl von Methoden wie Mikroskopie, biochemischen Tests (z. B. Katalase- und Oxidase-Aktivitätsassays) oder molekularen Methoden als Campylobacter spp. bestätigt werden6. Die Methode identifiziert die Isolate auf Speziesebene mit einem Multiplex-Real-Time-PCR-Assay (mqPCR), der auf Gene abzielt, die für C. jejuni und C. coli einzigartig sind. Diese Methode ist relativ kostengünstig, schnell und selektiv, wodurch sie für den Einsatz in einer Vielzahl von Umgebungen geeignet ist, einschließlich lebensmittelverarbeitender Einrichtungen, klinischer Labors und Forschungslabors.

Protokoll

Alle Arbeiten im Zusammenhang mit diesem Protokoll sollten in einer biologischen Sicherheitswerkbank (BSC) durchgeführt werden, um aseptische Bedingungen aufrechtzuerhalten und das Risiko einer Probenkontamination oder einer Exposition des Bedieners gegenüber mikrobiellen Krankheitserregern zu minimieren. Verwenden Sie beim Übertragen von Proben außerhalb des BSC versiegelte Behälter, um ein Verschütten im Falle eines versehentlichen Herunterfallens zu verhindern und die Integrität der Probe zu erhalten. Vorzugsweise sollten während des gesamten Verfahrens Einwegkomponenten verwendet werden, um die Möglichkeit einer Kreuzkontamination zu verringern. In Fällen, in denen Einwegartikel nicht möglich sind, stellen Sie sicher, dass alle Geräte und Materialien vor der Verwendung steril sind. Eine ordnungsgemäße Abfallentsorgung ist entscheidend; Alle gebrauchten Einwegkomponenten sollten als biologisch gefährlicher Abfall entsorgt werden. Autoklavieren Sie Materialien vor der Entsorgung, um eine ordnungsgemäße Sterilisation zu gewährleisten und die Eindämmung potenziell gefährlicher Materialien zu vermeiden. Die Einhaltung dieser Vorsichtsmaßnahmen schützt nicht nur die Probenintegrität, sondern minimiert auch das Risiko einer Exposition des Bedieners gegenüber mikrobiellen Krankheitserregern. Abbildung 1 zeigt den Arbeitsablauf der Probenvorbereitung, selektiven Anreicherung, filterbasierten Isolierung und mqPCR-Differenzierung von Campylobacter-Spezies . Ergänzende Datei 1 zeigt einen detaillierteren Arbeitsablauf und Bilder während des gesamten Prozesses.

1. Vorbereitung von Fleischproben

  1. Gewinnung von Fleischproben
    1. Erwerben Sie verschiedene Frischfleischpakete, darunter Hähnchenschenkel, Flügel, Trommelstöcke und Lebern von lokalen Einzelhändlern.
    2. Alle Proben werden bei 4 °C gelagert und innerhalb von 24 Stunden nach Erhalt verarbeitet.
      HINWEIS: Die Lagerung der frischen Proben bei niedrigeren Temperaturen, z. B. unter dem Gefrierpunkt, wirkt sich auf die Genesung aus.
  2. Verarbeitung von Fleischproben
    1. Befolgen Sie das in der FSIS-Probenahmerichtlinie 6,17 vorgeschriebene Verhältnis der Komponenten.
    2. Schneiden Sie 450 g Hähnchenstücke aus jeder Packung und legen Sie sie in einen Magenbeutel (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Stomacher-Beutel werden empfohlen, da sie eine ausreichende mechanische Festigkeit aufweisen, um die nachgelagerten Prozesse zu gewährleisten, und nicht reißen oder auslaufen.
    3. Bereiten Sie gepuffertes Peptonwasser (BPW) vor.
      1. 20 g des Pulvers (siehe Materialtabelle) in 1 l gereinigtem Wasser auflösen. Autoklavieren Sie die Lösung bei 121 °C für 15 min. Verdünnen Sie die Lösung in sterilem Wasser auf eine Konzentration von 0,1%.
    4. 200 ml 0,1 % BPW in den Magenbeutel mit dem Huhn geben.
    5. Massieren/ertasten Sie die Probe 2 Minuten lang manuell von der Außenseite des Magenbeutels.
    6. Sammeln Sie die gesamte Hühnerspülung von der gefilterten Seite des Beutels mit einer motorisierten Pipettierhilfe (siehe Materialtabelle).
    7. Geben Sie die Hühnerspülung in sterile Zentrifugenflaschen ab. Zentrifugieren Sie bei 10.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur.
    8. Entnehmen Sie den Überstand vorsichtig mit einer motorisierten Pipettierhilfe mit einer serologischen 25-ml-Einwegpipette aus serologischem Kunststoff. Vermeiden Sie es, das Pellet zu stören.
    9. Wiederholen Sie den Vorgang nach Bedarf, um sicherzustellen, dass der gesamte Überstand entfernt wird.
    10. Entsorgen Sie den gesammelten Überstand.

2. Selektive Anreicherung von Campylobacter aus rohem Fleisch

  1. Zubereitung von Bolton-Bouillon mit Nahrungsergänzungsmitteln
    1. 13,8 g Pulver (siehe Materialtabelle) in 500 ml gereinigtem Wasser auflösen. Die Brühe wird sterilisiert, indem sie 15 Minuten lang bei 121 °C autoklaviert.
    2. Geben Sie 25 ml lakiertes Pferdeblut (siehe Materialtabelle) in die sterilisierte 500 ml Bolton-Brühe.
      HINWEIS: Die Zugabe von Pferdeblut wirkt als Sauerstofflöschmittel, um die Wiederherstellung verletzter Campylobacter-Zellen aus der Nahrungsmatrix zu unterstützen.
    3. Rekonstituieren Sie 1 Durchstechflasche mit Antibiotikapräparat (Cefoperazon, Cycloheximid, Trimethoprim und Vancomycin, siehe Materialtabelle) in 5 ml 50% Ethanol.
    4. Fügen Sie das rekonstituierte antibiotische Präparat der Bolton-Brühe hinzu.
  2. Verfahren zur Anreicherung
    1. Resuspendieren Sie das Pellet in 50 ml Bolton-Bouillon mit Pferdeblut und Antibiotika.
    2. Legen Sie die Proben (mit gelösten Kappen) in einen verschlossenen Behälter, der ein Gasgemisch von 85 % N2, 10 % CO2 und 5 % O2 enthält.
      1. Stellen Sie sicher, dass die Kappe locker ist, aber der Behälter dicht verschlossen ist, um die mikroaerophilen und thermophilen Wachstumsanforderungen von Campylobacter zu erfüllen.
        HINWEIS: Gaspakete, die eine Atmosphäre von 85 % N2, 10 % CO2 und 5 % O2 aufrechterhalten, können verwendet werden, wenn keine Klimakammern verfügbar sind.
      2. Die Proben werden 24 Stunden lang bei 42 °C inkubiert.

3. Isolierung und Reinigung von C. jejuni und C. coli aus rohem Hühnerfleisch

  1. Herstellung von Brucella-Agarplatten
    1. 28 g Brucella-Pulver (siehe Materialtabelle) in 1 l gereinigtem Wasser auflösen. 15 g Agar in der Brucella-Lösung auflösen.
    2. Sterilisieren Sie den Brucella-Agar durch 15-minütiges Autoklavieren bei 121 °C. Die Medium-Agar-Mischung in einem 55 °C warmen Wasserbad abkühlen lassen.
    3. Gießen Sie 20 ml Brucella-Agar in jede Petrischale mit 100 mm Durchmesser.
  2. Filtermethode und Koloniekultivierung
    1. Bewerten Sie die Wirkung von Feuchtigkeit auf Campylobacter , die durch Filter strömt, indem Brucella-Agarplatten mit geöffneten Deckeln in einer Biosicherheitswerkbank für 0 h, 1 h, 2 h und 3 h getrocknet werden.
    2. Bereiten Sie eine filterlose Kontrolle vor, indem Sie 80 μl der Probe direkt auf der Brucella-Agarplatte verteilen.
  3. Platzieren Sie einen Celluloseacetatfilter (0,45 μm oder 0,65 Porengröße, siehe Materialtabelle) in der Mitte einer Brucella-Agarplatte.
  4. Pipettieren Sie 4 Tropfen/Filter und 20 μl/Tropfen angereicherte Probe auf den Filter.
    1. Platzieren Sie die Tropfen in der Nähe der Mitte des Filters, um sicherzustellen, dass die Flüssigkeit, die die Platte erreicht, durch den Filter und nicht um den Filter herum gelangt.
    2. Platzieren Sie die Tropfen so, dass sie sich nicht ausbreiten und aggregieren.
  5. Tropfen 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und die Filter vorsichtig entfernen.
    HINWEIS: Dieser Schritt gibt den Campylobacter-Zellen genügend Zeit, um die Membran zu durchqueren und das Agarmedium ohne übermäßige Trocknung zu erreichen.
  6. Die Platten werden bei 42 °C ca. 24 h unter den oben beschriebenen mikroaeroben Bedingungen inkubiert.
  7. Wählen Sie charakteristische Campylobacter-Kolonien mit spezifischen Merkmalen aus.
    HINWEIS: Campylobacter-Kolonien sind typischerweise rund mit glatten Kanten, glitzernder und durchscheinender gelblicher oder rosafarbener Farbe6.
  8. Streifen Sie die Kolonien zur Reinigung auf Brucella-Agarplatten. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis Platten mit einer einzigen einheitlichen Koloniemorphologie erhalten sind.
  9. Bereiten Sie die Proben für die Langzeitlagerung vor.
    1. Bereiten Sie Bolton-Brühe wie zuvor beschrieben zu. Fügen Sie eine Kolonie von der Platte mit einheitlicher Koloniemorphologie hinzu.
    2. Wachsen Sie über Nacht (24 h) unter den oben beschriebenen mikroaerophilen Bedingungen. 900 μl der Übernachtkultur in ein 2-ml-Kryofläschchen mit 100 μl DMSO geben.
    3. Im Trockeneis-Ethanol-Bad (ca. -72 °C) 10 Min. schnell abkühlen lassen. Zur Langzeitlagerung in einen -80 °C-Gefrierschrank umfüllen.

4. Identifizierung der Arten C. jejuni und C. coli

  1. Führen Sie die Identifizierung von C. jejuni und C. coli auf Speziesebene mit einem zuvor entwickelten Multiplex-qPCR-Assay (mqPCR) durch18,19.
    1. Führen Sie eine schnelle Zelllyse und genomische DNA-Extraktion in einem 96-Well-Plattenformat durch.
      HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, die Verwendung kommerzieller Kits (siehe Materialtabelle) in Betracht zu ziehen, um sicherzustellen, dass die Probe ausreichend frei von bekannten PCR-Inhibitoren ist.
      1. Dispergieren Sie gereinigte Campylobacter-Kolonien in 100 μl Extraktionslösung.
      2. Die Proben werden 10 Minuten lang bei 99 °C lysiert und anschließend 2 Minuten lang in einem Thermocycler auf 20 °C abgekühlt.
      3. Die Platte bei 8.000 x g 10 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Für den mqPCR-Assay werden 2 μl Aliquots des Überstands entfernt.
      4. Bereiten Sie ein 20-μl-Reaktionsgemisch vor, das aus 10 μl 2x Master Mix, 2,0 μl DNA-Probe, 104 Kopien der IAC-Vorlage (Internal Amplification Control) und 200 nM jedes Primers und jeder Sonde besteht (siehe Materialtabelle).
        HINWEIS: Die Primer und Sonden von hipO und cdtA sind die exklusiven Zielgene für C. jejuni bzw . C. coli. Die IAC besteht aus einem 79-bp-DNA-Segment des humanen Adenovirus und ist als Positivkontrolle enthalten, um eine konsistente Aktivität der DNA-Polymerase in allen Proben zu gewährleisten.
    2. Laden Sie alle Proben in dreifacher Ausführung in eine optische 96-Well-Platte, die mit einer optischen Folie bedeckt ist, und legen Sie sie in ein Real-Time-PCR-System (siehe Materialtabelle).
      1. Initiieren Sie eine Hot-Start-Aktivierung der DNA-Polymerase bei 95 °C für 10 min. Anschließend 40 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 15 s und Glühen/Verlängern bei 60 °C für 1 min.

5. Zellsuspensionen aufzählen

  1. Zählen Sie Zellsuspensionen mit einem 6 x 6-Fallplattenverfahren20 auf. Siehe Zusatzdatei 1 für Bilder, die die 6 x 6-Fallplattenmethode darstellen.
  2. Brucella-Agarplatten mit geschlossenem Deckel in einer Laminar-Flow-Haube 45 Minuten lang an der Luft trocknen.
  3. Geben Sie 200 μl Bakteriensuspension in sechs Reihen (A-F) in die erste Spalte einer 96-Well-Platte.
  4. 180 μl Brucella-Medium auf sechs Reihen der verbleibenden Spalten (2-12) verteilen.
  5. Bereiten Sie zehnfache serielle Verdünnungen mit 20-μl-Transfers vor.
    1. Übertragen Sie beispielsweise 20 μl Probe von Spalte eins in Spalte zwei. Wiederholen Sie diesen Vorgang für mindestens 6 Spalten.
    2. Reflux mischen Sie jede Suspension zehnmal mit der Pipette und wechseln Sie die Spitzen zwischen jedem Transfer.
  6. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 7 μl-Tropfen aus sechs Reihen einer Säule auf die Oberfläche einer Brucella-Agarplatte zu legen.
  7. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um ein 6 x 6-Array zu erstellen, und stellen Sie sicher, dass die Zeilen spaltenübergreifend technisch repliziert werden.
  8. Trocknen Sie die Platten 5 Minuten lang an der Luft und drehen Sie die Platte dann um. Inkubieren Sie die Platten bei 42 °C für 24 h.
  9. Zählen Sie die Anzahl der Kolonien in jeder repräsentativen Verdünnung.

Ergebnisse

Einfluss von Feuchtigkeit in Brucella-Agarplatten zur passiven Filtration von Campylobacter
Campylobacter hat ein kleines Genom und es fehlen mehrere Stressreaktionsgene, die häufig in anderen Bakterien wie E. coli O157:H7 und Salmonellen vorkommen. Daher reagiert es empfindlicher auf verschiedene Umweltbelastungen und verträgt keine Austrocknung oder Sauerstoffgehalte in der Umgebung. Umgekehrt kann ein zu feuchtes Agarmedium den Filter überfluten. Dies führt nicht nur zu einer Diffusion der Probe nach außen des Filters, sondern verlängert auch die Einwirkzeit gegenüber Sauerstoff21.

Um die geeigneten Bedingungen für die filterbasierte Isolierung von Campylobacter zu bestimmen, wurden Brucella-Agarplatten mit entfernten Deckeln für 0 h, 1 h, 2 h und 3 h in einer biologischen Sicherheitswerkbank getrocknet und auf die Effizienz von Campylobacter-Zellen beim Durchlaufen eines 0,65 μm porengroßen Filters untersucht. Vier 20-μl-Aliquots von C. jejuni S27-Kulturen in den Konzentrationen 1,53 x 104 und 1,53 x 105 KBE/ml wurden auf jede Filtermembran pipettiert, die auf eine Brucella-Platte gelegt worden war. Nach 15 Minuten Penetration wurden die Filter entfernt und die Platten über Nacht für das Zellwachstum inkubiert.

Die Zellen von 5 replizierten Platten wurden dann gezählt und in Tabelle 1 notiert. Die Ergebnisse zeigten, dass die Agarplatten, die 2 h und 3 h getrocknet wurden, mit einer nahezu gleichen Anzahl von Zellen, die aus der passiven Filtration gewonnen wurden, ähnlich funktionierten. Auffällig ist, dass die Platten, die unter diesen Bedingungen für 0 h und 1 h getrocknet wurden, es den Zellen nicht erlaubten, die Membran innerhalb des verwendeten Zeitraums von 15 Minuten vollständig zu durchqueren.

Vergleich verschiedener porengroßer Filtermembranen zur Isolierung von Campylobacter aus Hühnerleber
Unter Berücksichtigung der Campylobacter-Zellgrößen (0,5-5 μm Länge und 0,2-0,9 μm Breite) und eines breiten Spektrums an Lebensmittelpartikelgrößen wurden Celluloseacetatfilter mit 0,45 μm und 0,65 μm Porengrößen auf die Effizienz der Campylobacter-Passage bei einer Inkubationszeit von 15 Minuten getestet. Für das Experiment wurden Lebensmittelproben verwendet, die aus 450 g Hühnerleber bestanden, die mit 153 KBE von C. jejuni versetzt und dann über Nacht angereichert wurden. Als filterlose Kontrolle wurde parallel eine direkte Plattierung der Anreicherungsprobe einbezogen. Die Ergebnisse (Abbildung 2) von 5 Replikationsplatten zeigten übereinstimmend, dass der 0,65-μm-Porengrößenfilter mehr Zellen durchqueren ließ als die 0,45-μm-Porengrößenfilter, was zu einer Zunahme von ~29-fach mehr erhaltenen Zellen führte. Der 0,45 μm Porenfilter hielt zu viele Zellen auf der Oberseite des Filters zurück, was zu einer deutlich geringeren Rückgewinnung von Campylobacter aus Lebensmitteln im Vergleich zum 0,65 μm Porenfilter führte. Wie erwartet wuchs auf den filterlosen Kontrollplatten ein Rasen mit verschiedenen Hintergrundorganismen.

Anwendung der passiven Filtration bei der Campylobacter-Isolierung von Hühnern im Einzelhandel
Aufgrund der ungewöhnlichen Motilität von Campylobacter-Zellen wurde die passive Filtrationstechnik für die Isolierung von C. jejuni und C. coli aus Fleischprodukten im Einzelhandel gewählt, die typischerweise mit zahlreichen Hintergrundorganismen kontaminiert sind. Zwischen den Jahren 2014-2023 wurden insgesamt 79 Rohfleischpakete, darunter verschiedene Teile von Hühnerfleisch, Hühnerleber, Rinderleber und Kälberleber, in verschiedenen lokalen Supermärkten gesammelt. Von jeder Packung wurden 450 g für die Isolierung von Campylobacter spp. beprobt. Durch die Kombination der selektiven Anreicherung von Campylobacter in bluthaltiger Bolton-Bouillon und der passiven Filtration der Zellen durch einen 0,65 μm porengroßen Celluloseacetatfilter direkt auf eine Brucella-Agarplatte konnten 49 Campylobacter-Stämme erfolgreich aus 79 Fleischproben isoliert werden (Tabelle 2). Abbildung 3 zeigt das Ergebnis der Isolierung eines neuen Campylobacter-Stammes aus Hühnerleber. Die Methode hat sich wiederholt als sensitiv, spezifisch und kostengünstig erwiesen.

Identifizierung und Differenzierung von C. jejuni- und C. coli-Isolaten
Um die Gattung zu verifizieren und die Spezies von Campylobacter-Isolaten aus rohem Fleisch zu unterscheiden, wurde ein Multiplex-qPCR-Assay zur Amplifikation der spezifischen Genziele (hipO und cdtA) für C. jejuni und C. coli und eine interne Amplifikationskontrolle (IAC) eingesetzt. Der IAC wurde als falsch-negativer Indikator in die gleichzeitige Amplifikation mehrerer Gene einbezogen. Der Assay wurde in einem 96-Well-Format mit schneller Zelllyse und DNA-Extraktion unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Reagenzes implementiert (siehe Materialtabelle). Tabelle 2 fasst das Ergebnis der Speziesidentifizierung der Stämme C. jejuni und C. coli zusammen. Als zusätzliche Überprüfung bestätigten die Ergebnisse der Gesamtgenomsequenzierung die Spezies aller Isolate (Daten nicht gezeigt).

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Abbildung 1: Ein Workflow-Diagramm für die Isolierung und Identifizierung von Campylobacter-Arten aus Fleisch im Einzelhandel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Der Einfluss der Filtergröße auf die Rückgewinnung von Campylobacter. Die Ergebnisse zeigen, dass der 0,65-μm-Filter durchschnittlich 900 ± 138 Kolonien zurückgewinnen kann, während der 0,45-μm-Filter 31 ± 7 Kolonien zurückgewinnt. Die Ergebnisse wurden aus N = 20 (5 Platten mit 4 Tropfen/Platte) generiert, und ein Student's t-Test zeigt an, dass die Mittelwerte statistisch unterschiedlich sind (p < 0,0001). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Isolierung von Campylobacter durch passive Filtration von angereicherten Geflügelproben. (A) Zeigt die vier 20-μl-Tropfen der angereicherten Probe, die auf dem Nitrozellulosemembranfilter abgeschieden sind. Das Bild wurde während der 15-minütigen passiven Filterung aufgenommen. (B) Zeigt die Platte nach dem Entfernen des Nitrozellulosefilters. Die vier Punkte zeigen an, wo die angereicherte Probe die Membran durchquert hat. (C) Zeigt die Platte nach 24 Stunden Inkubation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Der Einfluss der Trocknungszeit von Brucella-Agarplatten auf die passive Filtration von C. jejuni. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: C. jejuni- und C. coli-Stämmeisoliert aus rohem Fleisch. Im Zeitraum von 2008 bis 2023 wurden 36 C. jejuni - und 13 C. coli-Stämme aus 79 Fleischverpackungen in 24 einzigartigen Einzelhandelsprodukten isoliert. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Bilder während der Isolations- und Aufzählungsprozesse. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Bedeutung des Protokolls
C. jejuni und C. coli waren die beiden wichtigsten Campylobacter-Arten, die bei Geflügel22 und Tierlebern23,24 vorkamen. In dieser Studie wurden die Fleischproben von Hühnerteilen (Beine, Flügel und Oberschenkel), Hühnerleber und Rinderleber nach dem Zufallsprinzip in verschiedenen Zeiträumen und von verschiedenen Einzelhandelsgeschäften und Herstellern zur Isolierung von Campylobacter spp. gesammelt. Von den insgesamt 49 isolierten Campylobacter-Stämmen wurden 36 als C. jejuni und 13 als C. coli identifiziert, wobei keine anderen Campylobacter-Arten gefunden wurden, was mit anderen Berichtenübereinstimmt 25.

Der Assay basiert auf der spiralförmigen Zellmorphologie und der charakteristischen korkenzieherartigen Motilität von Campylobacter spp. Eine einfache, aber effektive, passive Filtrationstechnik26,27, die seine spiralförmige Zellmorphologie (lang, schlank, 0,2-0,9 x 0,5-5 μm) und seine starke Korkenziehermotilität ausnutzte, wurde verwendet, um Campylobacter von einer Mischung von Hintergrundorganismen zu trennen. Die hohe Motilität von Campylobacter ermöglichte es den Zellen, die Membranfilter zu passieren und sich zu günstigen Bedingungen im Agarmedium zu bewegen, während andere Hintergrundmikroorganismen aus den Fleischprodukten nicht passieren konnten. Diese Methode ist relativ kostengünstig, schnell und selektiv, wodurch sie für den Einsatz in einer Vielzahl von Umgebungen geeignet ist, einschließlich lebensmittelverarbeitender Einrichtungen, klinischer Labors und Forschungslabors.

Ein oft zitierter Pionierartikel besagt, dass der 0,45-μm-Filter so gut funktionierte, dass 0,65 μm nicht ausgewertet wurden28. Die Ergebnisse dieser vorliegenden Studie zeigen, dass der Filter mit einer Porengröße von 0,65 μm signifikant besser abschneidet als der Porenfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm, was zu einer 29-fachen Erhöhung der Anzahl der aus der Anreicherung gewonnenen Zellen führt. Dies ist wichtig, da die ausgewählten Filter keine reduzierte Selektivität aufweisen, wie zuvor berichtet29. Da bekannt ist, dass die Filterung die Menge an Campylobacter im Vergleich zur direkten Beschichtung30 signifikant reduziert, verbessert die Vergrößerung der Pore die Rückgewinnung des Mikroorganismus, was mit den zuvor berichteten Ergebnissen übereinstimmt21. Dies ist von Bedeutung, da alle Zellen, die die Filter durchliefen, gleichmäßige Campylobacter-Kolonien bildeten, was darauf hindeutet, dass beide Filter ausreichten, um den Durchgang anderer Mikroflora und Nahrungspartikel zu verhindern. Darüber hinaus weist das FSIS-Flussdiagramm7 auf das Potenzial für eine verlängerte Ergebnisproduktion aufgrund von erneuten Streifen von Isolaten auf Campy-Cefex-Platten, die Antibiotika enthalten, hin. Im Gegensatz dazu hat das in diesem Manuskript beschriebene Protokoll, das die Verwendung von Filtration und selektiver Anreicherung mit Cefoperazon, Cycloheximid, Trimethoprim und Vancomycin kombiniert, kein erneutes Streifen erforderlich.

Die derzeit angewandte Methode steht im Einklang mit den aktuellen FSIS-Probenahme- und Verifizierungsprogrammen17. Da der Grad der Campylobacter-Kontamination gering sein kann (153 KBE/450 g Huhn), wird die Spülung zentrifugiert, um die Probe um den Faktor vier zu konzentrieren, was die Empfindlichkeit des Assays erhöht. Nach der Konzentration des Rinsats um den Faktor 4x werden die Proben 48 Stunden lang angereichert und mit dem Molecular Detection System (MDS) gescreent, um die von FSIS-Labors verwendete Methode zu replizieren (Daten nicht gezeigt). Insbesondere konnte die beschriebene Methode noch keine positiven Stämme innerhalb von 24 Stunden identifizieren, die vom Molecular Detection System mit 48 Stunden Anreicherung nachgewiesen wurden (Daten nicht gezeigt). Schließlich besteht ein zusätzlicher Vorteil dieses Protokolls darin, dass es Informationen zu den Bakterienarten liefern und feststellen kann, ob es sich bei Campylobacter um C. coli, C. jejuni oder C. lari handelt, während das in MLG 41.07 übernommene MDS nur eine binäre positive/negative Reaktion auf Campylobacter liefern kann.

Kritische Schritte
Das Protokoll für die Isolierung und Identifizierung von Campylobacter erfordert Präzision bei der Zentrifugation, Filtration und molekularen Analyse. Genaue Verdünnungen, richtige Inkubationsbedingungen und die sorgfältige Einhaltung der qPCR-Assay-Bedingungen sind entscheidend für eine zuverlässige Speziesidentifizierung.

Als mikroaerophiles Bakterium ist Campylobacter sehr zerbrechlich und empfindlich gegenüber verschiedenen Umweltbelastungen und erfordert einzigartige anspruchsvolle Bedingungen für das Wachstum 31,32,33. In Lebensmittelproben, die typischerweise längere Transport- und Lagerzeiten durchlaufen, befinden sich viele Campylobacter-Zellen möglicherweise in einem Ruhezustand oder einem subletalen/tödlichen Verletzungszustand34,35. Daher ist es wichtig, die gestressten Zellen aus ihren Nahrungsmatrizen zu gewinnen und sie zu einer höheren Konzentration zu züchten. Im ersten Schritt des Verfahrens verwendeten wir Bolton-Bouillon, ergänzt mit Pferdeblut und Antibiotika zur selektiven Anreicherung von Campylobacter aus der Nahrung. Das Zusatzblut diente als Sauerstofflöschmittel, um die nachteiligen Auswirkungen freier Sauerstoffradikale zu überwinden36. Die Antibiotika wurden verwendet, um das Wachstum der Hintergrundmikroflorazu hemmen 37.

Um die Expositionszeit von Campylobacter gegenüber Umgebungssauerstoff zu minimieren, wurde eine Inkubationszeit von 15 Minuten gewählt, damit die Zellen den Filter durchlaufen können. Auch die Feuchtigkeit der Brucella-Agarplatte unter dem Filter spielte eine wichtige Rolle bei der Durchgangsgeschwindigkeit. Insbesondere die Ergebnisse der Tests von Agarplatten, die 0 h, 1 h, 2 h und 3 h getrocknet wurden, deuteten darauf hin, dass ein hoher Feuchtigkeitsgehalt im Filter das Passieren von Zellen verhinderte. Ebenso entscheidend ist die präzise Platzierung von Filtern und Tropfen auf den Platten und Filtern, die beide den Erfolg der Isolierung von Zellen beeinflussen.

Mögliche Fallstricke und Einschränkungen
Obwohl ein strukturierter Ansatz zur Isolierung und Identifizierung von Campylobacter-Arten aus rohen Hühnerproben vorgestellt wird, verdienen mehrere Einschränkungen dieses Protokolls Beachtung. Externe Verunreinigungen, unzureichend getrocknete Platten, Verstopfung der Filter, die die mikrobielle Bewegung behindern, Einschluss der Mikroorganismen im Pellet, unvollständige Abdichtung der atmosphärischen Kammer und Tropfen, die sich über die Filtergrenzen hinaus ausbreiten, gehören zu den Hauptfallstricken.

Eine unzureichende Trennung der Mikroorganismen von den Lebensmitteloberflächen oder ihr Einschluss in der Masse der Probe kann ihre Isolierung mit dieser Methode behindern. Darüber hinaus stellt die Abhängigkeit von der mikrobiellen Motilität für den Durchgang durch passive Filter eine bemerkenswerte Einschränkung dar. Es ist möglich, dass die Filtermembranen einige weniger bewegliche Campylobacter-Stämme zurückhielten, da sich gezeigt hat, dass Filter die Abscheidungseffizienz mikrobieller Krankheitserreger in Lebensmitteln verringern können38. Weitere Einschränkungen umfassen die Chargennatur von Zentrifugations- und Filtrationsprozessen, die Anfälligkeit für Filterverstopfungen und die Ineffizienz bei der Dispergierung des gebildeten Pellets, was sich auf die Genauigkeit der mikrobiellen Belastungen auswirkt. Diese Einschränkungen unterstreichen zusammen die Notwendigkeit von Vorsicht und ergänzenden Methoden, um eine umfassende Analyse zu gewährleisten, insbesondere wenn es um verschiedene Probentypen geht oder Hochdurchsatzfähigkeiten angestrebt werden.

Vorschläge zur Fehlerbehebung
Um potenziellen Problemen vorzubeugen, stellen Sie zunächst sicher, dass alle Materialien den erforderlichen Qualitätsstandards entsprechen und nicht abgelaufen sind. Beheben Sie verstopfte Filter, indem Sie möglicherweise eine zusätzliche Filtration einsetzen, um große Verunreinigungen zu entfernen, die den Durchgang des Campylobacters durch die Nitrozellulosemembran einschränken könnten. Wenn eine Kontamination beobachtet wird, stellen Sie sicher, dass die Tropfen nicht zu nahe am Rand des Filters platziert wurden und die Flüssigkeit den Agar erreichen konnte, indem sie um den Filter herum und nicht durch die Poren gingen. Wenn nach der Anreicherung kein ausreichendes Wachstum vorhanden ist, überprüfen Sie, ob die Dichtungen der atmosphärischen Behälter dicht und undicht sind.

Mögliche Verfeinerung und Erweiterung
Die Erforschung alternativer Filtermaterialien kann die mikrobielle Durchquerung verbessern und es ermöglichen, dieses Protokoll für die Isolierung anderer beweglicher Mikroorganismen aus heterogenen Gemischen wie Lebensmitteln zu erweitern. Es ist ratsam, Kontrollen zu identifizieren, die weniger bewegliche Campylobacter-Varianten beibehalten, ohne die Spezifität negativ zu beeinflussen. Während der in dieser Studie verwendete Multiplex-qPCR-Assay nachweislich in der Lage ist, C.lari nachzuweisen, können18 andere Campylobacter-Spezies von Interesse in diesen Assay aufgenommen werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass durch die Bewertung verschiedener Parameter und Einstellungen die geeigneten Bedingungen für die filterbasierte Isolierung und die Identifizierung von C. jejuni und C. coli auf Speziesebene aus Lebensmitteln geschaffen wurden. Die Methode hat sich als empfindlich, spezifisch, robust und kostengünstig erwiesen. Durch die Anwendung auf echte Lebensmittelproben konnte das Protokoll 36 C. jejuni - und 13 C. coli-Stämme aus 79 Fleischverpackungen isolieren.

Das Protokoll steht im Einklang mit der FSIS-Richtlinie 10,250.117, die das Verfahren für die Probenahme von rohen Hühnerteilen beschreibt, und MLG 41.076 zur Isolierung und Identifizierung von Campylobacter. Die Daten deuten darauf hin, dass eine 4-fache Konzentration der Probe und deren Anreicherung für 24 Stunden, gepaart mit Filtration und Plattierung, isolierte, bestätigte Kolonien innerhalb von 48 Stunden im Gegensatz zu 96 Stunden ergibt. Das Protokoll ist mit DNA-basierten Methoden wie der Genomsequenzierung kompatibel, um eine umfassende Charakterisierung von Campylobacter-Stämmen zu ermöglichen, einschließlich ihrer antimikrobiellen Resistenzprofile, Virulenzvorhersagen und phylogenetischen Beziehungen. Das Protokoll stellt eine vielversprechende Alternative für die effiziente Rückgewinnung und Isolierung von Campylobacter spp. aus rohem Geflügel dar, die epidemiologische Studien und Interventionen im Bereich der öffentlichen Gesundheit erleichtern kann.

Offenlegungen

Alle Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

Diese Forschung wurde vom US-Landwirtschaftsministerium, Agricultural Research Service (USDA-ARS), National Program 108, Current Research Information System Nummern 8072-42000-093 und 8072-42000-094-000-D unterstützt. Die Erwähnung von Handelsnamen oder Handelsprodukten in diesem Artikel dient ausschließlich dem Zweck der Bereitstellung spezifischer Informationen und impliziert keine Empfehlung oder Billigung durch das US-Landwirtschaftsministerium. USDA ist ein Anbieter und Arbeitgeber für Chancengleichheit.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Agar - Solidifying Agent (Difco)Becton, Dickinson and Company (BD)281230
Analytical BalanceMettler ToledoJL602-G/LEquipment 
Analytical BalanceMettler ToledoAB54-SEquipment 
Antibiotic supplements cefoperazone, cycloheximide, trimethoprim, vancomycinOxoid Ltd.SR0183E
Atmosphere Control Gas Pak  (Campy, 85% N2, 10% CO2, and 5% O2)Becton, Dickinson and Company (BD)260680
Atmosphere Control Vessel,  GasPak EZ CampyPak container system Becton, Dickinson and Company (BD)260678
Autoclave - Amsco Lab250, Laboratory Steam SterilizerSteris plcLV-250Equipment 
Biological Safety Cabinet, Type A2, Purifier Logic+Labconco Corporation302411101Equipment 
Bolton broth Oxoid Ltd.CM0983
Brucella broth (Difco)Becton, Dickinson and Company (BD)211088
Buffered Peptone WaterBio-Rad Laboratories Inc.3564684
Centrifuge Microcentrifuge 5424Eppendorf5424Equipment
Centrifuge, Avanti J-25Beckman Coulter, Inc. Equipment
Chicken thighs, wings, drumsticks, liversLocal retailers
DNA Extraction - PreMan Ultra Sample Preparation Reagent Thermo Fisher Scientific Inc. 4318930
FAM probe for hipO (Sequence 5'-TTGCAACCTCACTAGCAAAATCC
ACAGCT-3')		Integrated DNA Technologies
Filter - 0.45 µm sterile cellulose acetate filter Merck-Millipore LTDDAWP04700
Filter - 0.65 µm sterile cellulose acetate filter Merck-Millipore LTDHAWG04700
forward primer for cdtA (Sequence 5'-TGTCAAACAAAAAACACCAAGCT
T-3' ')		Integrated DNA Technologies
forward primer for hipO (Sequence 5'-TCCAAAATCCTCACTTGCCATT-3')Integrated DNA Technologies
forward primer for IAC (Sequence 5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3')Integrated DNA Technologies
HEX probe for cdtA (Sequence 5'-AAAATTTCCCGCCATACCACTTG
TCCC-3')		Integrated DNA Technologies
Incubator - Inova 4230 refrigerated incubator shakerNew Brunswick Scientific4230Equipment 
Inoculating Loop - Combi Loop  10µL and 1µL Fisher Scientific International, Inc22-363-602
Internal Amplification Control (IAC) DNA fragment (Sequence 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTAT
GTGGTGGCATTGTCTTCTCCC
GTTGTAACTATCCACTGAGATG
TGTTAGGCGCGCC-3')		Integrated DNA Technologies
Laked horse blood Remel Inc.R54072
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+Mettler Toledo17014382Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+Mettler Toledo17014384Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+Mettler Toledo17014388Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+Mettler Toledo17014391Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+Mettler Toledo17014392Equipment
Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+Mettler Toledo17013805Equipment
Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-20XLS+Mettler Toledo17013803Equipment
Media Storage Bottle -PYREX 1 L Square Glass  Bottle, with GL45 Screw CapCorning Inc.1396-1LEquipment
Media Storage Bottle -PYREX 2 L Round Wide Mouth Bottle, with GLS80 Screw CapCorning Inc.1397-2LEquipment
Microtiter plate, 96 well plate, flat bottom, polystyrene, 0.34 cm2, sterile, 108/csMilliporeSigmaZ707902
Mixer - Vortex Genie 2Scientific Industries Inc.SI-0236Equipment
Motorized pipette controller, PIPETBOY2INTEGRA Biosciences Corp.Equipment
PCR Mastermix 2× TaqMan Gene Expression Thermo Fisher Scientific Inc. 4369542
Petri Dish Rotator -  bioWORLD Inoculation TurntableFisher Scientific International, Inc3489E20Equipment
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15mm)Fisher Scientific International, IncFB0875713
Pipette Tips GP LTS 1000µL S 768A/8Mettler Toledo 30389273
Pipette Tips GP LTS 20µL 960A/10Mettler Toledo30389270
Pipette Tips GP LTS 200µL F 960A/10Mettler Toledo30389276
Reagent Reservoir, 25 mL sterile reservoir used with multichannel pipettorsThermo Fisher Scientific Inc. 8093-11
Realtime PCR - 7500 Real-Time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA)Equipment
reverse primer for cdtA (Sequence 5'-CCTTTGACGGCATTATCTCCTT-3')Integrated DNA Technologies
reverse primer for hipO (Sequence 5'-TGCACCAGTGACTATGAATAACG
A-3')		Integrated DNA Technologies
reverse primer for IAC (Sequence 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTA
-3')		Integrated DNA Technologies
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (10 mL)Thermo Fisher Scientific Inc. 170356N
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (2 mL)Thermo Fisher Scientific Inc. 170372N
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (25 mL)Thermo Fisher Scientific Inc. 170357N
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (50 mL)Thermo Fisher Scientific Inc. 170376N
Spreader - Fisherbrand L-Shaped Cell SpreadersFisher Scientific International, Inc14-665-230
Stomacher bag, Nasco Whirl-Pak Write-On Homogenizer Blender Filter BagsThermo Fisher Scientific Inc. 01-812
TAMRA probe for IAC (Sequence 5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGCC
ACCA-3')		Integrated DNA Technologies
Thermocycler (GeneAmp PCR system 9700)Applied BiosystemsEquipment
Water Filtration - Elga Veolia Purelab Flex Elga LabWaterPF2XXXXM1-USEquipment

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