Rekonstitution des bakteriellen Glutamatrezeptorkanals durch Verkapselung eines zellfreien Expressionssystems

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt das invertierte Emulsionsverfahren, das zur Verkapselung eines zellfreien Expressionssystems (CFE) in einem riesigen unilamellären Vesikel (GUV) zur Untersuchung der Synthese und des Einbaus eines Modellmembranproteins in die Lipiddoppelschicht verwendet wird.

Zusammenfassung

Zellfreie Expressionssysteme (CFE) sind leistungsfähige Werkzeuge in der synthetischen Biologie, die die Biomimikry zellulärer Funktionen wie Biosensorik und Energieregeneration in synthetischen Zellen ermöglichen. Die Rekonstruktion einer Vielzahl zellulärer Prozesse erfordert jedoch die erfolgreiche Rekonstitution von Membranproteinen in die Membran synthetischer Zellen. Während die Expression löslicher Proteine in gängigen CFE-Systemen in der Regel erfolgreich ist, hat sich die Rekonstitution von Membranproteinen in Lipiddoppelschichten synthetischer Zellen als schwierig erwiesen. In dieser Arbeit wird ein Verfahren zur Rekonstitution eines Modellmembranproteins, des bakteriellen Glutamatrezeptors (GluR0), in riesigen unilamellären Vesikeln (GUVs) als synthetische Modellzellen auf der Grundlage der Verkapselung und Inkubation der CFE-Reaktion in synthetischen Zellen demonstriert. Unter Verwendung dieser Plattform wird der Effekt der Substitution des N-terminalen Signalpeptids von GluR0 durch das Proteorhodopsin-Signalpeptid auf die erfolgreiche cotranslationale Translokation von GluR0 in Membranen von hybriden GUVs demonstriert. Mit dieser Methode steht ein robustes Verfahren zur Verfügung, das die zellfreie Rekonstitution verschiedener Membranproteine in synthetischen Zellen ermöglicht.

Einleitung

Die synthetische Bottom-up-Biologie hat in den letzten zehn Jahren als aufstrebendes Gebiet mit zahlreichen Anwendungsmöglichkeiten in der Biotechnologie, der Wirkstoffverabreichung und der regenerativen Medizin zunehmend an Interesse gewonnen ^1,2. Insbesondere die Entwicklung synthetischer Zellen als Eckpfeiler der synthetischen Bottom-up-Biologie hat aufgrund der vielversprechenden Anwendungen synthetischer Zellen sowie ihrer zellähnlichen physikalischen und biochemischen Eigenschaften, die biophysikalische In-vitro-Studien erleichtern, ein breites Spektrum an wissenschaftlichen Gemeinschaften angez....

Protokoll

Die für diese Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Bulk-CFE-Reaktionen in Gegenwart von kleinen unilamellären Vesikeln (SUVs)

1. SUV-Vorbereitung
   HINWEIS: Dieser Schritt muss in einem Abzug gemäß den Sicherheitshinweisen für die Arbeit mit Chloroform durchgeführt werden.
   1. Bereiten Sie 5 mM 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholin (POPC) SUVs in einem Glasfläschchen vor, indem Sie 76 μl 25 mg/ml POPC-Stammlösung, gelöst in Chloroform, umfüllen.
   2. Während Sie das Glasfläschchen vorsichtig drehen, blasen Sie einen sanften Argonstrahl i....

Diskussion

Praktisch jeder zelluläre Prozess, der von der Übertragung von Molekülen oder Informationen über die Zellmembran abhängt, wie z. B. die Zellsignalisierung oder die Zellanregung, erfordert Membranproteine. Daher ist die Rekonstitution von Membranproteinen zum Hauptengpass bei der Realisierung verschiedener synthetischer Zelldesigns für unterschiedliche Anwendungen geworden. Die traditionelle Detergenzien-vermittelte Rekonstitution von Membranproteinen in biologischen Membranen erfordert GUV-Erzeugungsmethoden wie sa.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 nm polycarbonate filter	STERLITECH	1270193
96 Well Clear Bottom Plate	ThermoFisher Scientific	165305
BioTek Synergy H1M Hybrid Multi-Mode Reader	Agilent	11-120-533
Creatine phosphate	Millipore Sigma	10621714001
CSU-X1 Confocal Scanner Unit	Yokogawa	CSU-X1
Density gradient medium (Optiprep)	Millipore Sigma	D1556	Optional to switch with sucrose in inner solution
Filter supports	Avanti	610014
Fisherbrand microtubes (1.5 mL)	Fisher Scientific	05-408-129
Folinic acid calcium salt hydrate	Millipore Sigma	F7878
Glucose	Millipore Sigma	158968
HEPES	Millipore Sigma	H3375
iXon X3 camera	Andor	DU-897E-CS0
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate	Millipore Sigma	G1501
Light mineral oil	Millipore Sigma	M5904
Magnesium acetate tetrahydrate	Millipore Sigma	M5661
Mini-extruder kit (including syringe holder and extruder stand)	Avanti	610020
Olympus IX81 Inverted Microscope	Olympus	IX21
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective	Olympus	1-U2B933
PEO-b-PBD	Polymer Source	P41745-BdEO
pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP plasmid DNA	Homemade	N/A
pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) plasmid DNA	Homemade	N/A
pET28b-WT-GluR0-sfGFP plasmid DNA	Homemade	N/A
POPC lipid in chloroform	Avanti	850457C
Potassium chloride	Millipore Sigma	P9541
PUREfrex 2.0	Cosmo Bio USA	GFK-PF201
Ribonucleotide Solution Set	New England BioLabs	N0450
RNase Inhibitor, Murine	New England BioLabs	M0314S
RTS Amino Acid Sampler	Biotechrabbit	BR1401801
Sodium chloride	Millipore Sigma	S9888
Spermidine	Millipore Sigma	S2626
Sucrose	Millipore Sigma	S0389
VAPRO Vapor Pressure Osmometer Model 5600	ELITechGroup	VAPRO 5600