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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Repräsentative Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir stellen eine Methode zur Replikation der Mikroumgebung des Gliomtumors an der invasiven Front vor, die den interstitiellen Flüssigkeitsfluss einbezieht. Bei diesem Modell handelt es sich um ein Hyaluronan-Kollagen-I-Hydrogel in einem Gewebekultureinsatz, auf den ein Flüssigkeitsdruckkopf aufgebracht werden kann. Die Invasion kann quantifiziert werden, und Zellen können isoliert oder lysiert werden.

Zusammenfassung

Das Wiederauftreten von Glioblastomen ist ein großes Hindernis für den Behandlungserfolg und wird durch die Invasion von Gliom-Stammzellen (GSCs) in gesundes Gewebe angetrieben, das für eine chirurgische Resektion nicht zugänglich ist und gegen bestehende Chemotherapien resistent ist. Die Flüssigkeitsbewegung auf Gewebeebene oder der interstitielle Flüssigkeitsfluss (IFF) reguliert die GSC-Invasion in Abhängigkeit von der Tumormikroumgebung (TME), was den Bedarf an Modellsystemen unterstreicht, die sowohl IFF als auch TME enthalten. Wir stellen eine zugängliche Methode zur Replikation der invasiven TME beim Glioblastom vor: ein Hyaluronan-Kollagen-I-Hydrogel, das aus humanen GSCs, Astrozyten und Mikroglia besteht, die in einem Gewebekultureinsatz ausgesät werden. Erhöhte IFF kann durch Anlegen eines Flüssigkeitsdruckkopfes an das Hydrogel dargestellt werden. Darüber hinaus kann dieses Modell so abgestimmt werden, dass es Unterschiede zwischen oder innerhalb des Patienten in zellulären Verhältnissen, Flussraten oder Matrixsteifigkeiten repliziert. Die Invasion kann quantifiziert werden, während Gele für eine Vielzahl von Ergebnissen entnommen werden können, einschließlich GSC-Invasion, Durchflusszytometrie, Protein- oder RNA-Extraktion oder Bildgebung.

Einleitung

Das Glioblastom ist eine verheerende Erkrankung, die durch eine kurze Überlebenszeitgekennzeichnet ist 1, die durch die klinisch verfügbaren Behandlungen nur moderat verlängert wird 2,3. Dieses Hindernis für eine wirksame Therapie ist weitgehend auf die hochgradig infiltrative Natur chemoresistenter Gliom-Stammzellen (GSCs) zurückzuführen, die für die Resektion und das Aussäen rezidivierender Tumoren unzugänglich sind4. Gleichzeitig sind GSCs hochplastisch und reagieren auf verschiedene Reize in der Tumormikroumgebung (TME), um z....

Protokoll

Dieses Protokoll wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Virginia Tech Institutional Biosafety Committee entwickelt.

HINWEIS: Führen Sie alle Verfahren in einem BSL-2-Zellkulturschrank durch, sofern nicht anders angegeben. Bitte wenden Sie sich an den Biosicherheitsausschuss der Institution, um Hinweise zur Verwendung menschlicher Zellen zu erhalten.

1. Berechnungen für die Gelherstellung

  1. Berechnen Sie die Anzahl der Bedingungen, die für das Experiment erforderlich sind.
    HINWEIS: Eine "Bedingung" wird durch den Inhalt der Lösung (z. B. Zellk....

Repräsentative Ergebnisse

Repräsentative Daten zur Invasion (Abbildung 3), zur Viabilität und zur Expression von Ki67 und CD71 mittels Durchflusszytometrie (Abbildung 4) werden für GSC-Linien bereitgestellt, wie sie zuvor für ein thiomodifiziertes Hyaluronan-Kollagen-Hydrogel12 veröffentlicht wurden. Das Vorhandensein von Astrozyten und Mikroglia im TME-Modell hat einen unterschiedlichen Effekt auf die GSC-Invasion in Abhäng.......

Diskussion

Der Aufbau des TME-Modells umfasst sechs grundlegende Schritte: 1) Passieren von Zellen und Trennen der Zellen zwischen ähnlichen Bedingungen, 2) Zusammenstellen einer konzentrierten Kollagenlösung für alle Bedingungen, 3) Kombinieren der Gelkomponenten (Zellen, Kollagen, methacrylierte Hyaluronsäure und der Photoinitiator) für jede Bedingung, 4) Plattieren von Gelen, 5) Vernetzung durch UV-Strahlung und Hitze und 6) Hinzufügen des Flüssigkeitsdruckkopfes. Nach 18 Stunden oder meh.......

Offenlegungen

Die Autoren haben keine relevanten Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken den Geldgebern für diese Arbeit: den National Institutes of Health National Cancer Institute (R37 CA222563 zu J.M.), der Coulter Foundation (J.M.) und der Virginia Tech ICTAS-CEH (J.M. & J.H.). Die in diesem Assay verwendeten GSCs wurden von Jakub Godlewski, Ph.D. (Harvard Medical School) abgeleitet.

....

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
12 Well Tissue Culture Plate, SterileCelltreat Scientific Products 229112
250 mL Filter  System, PES Filter Material, 0.22 µm, 50 mm, SterileDOT Scientific667706
385 nm, 1650 mW (Min) Mounted LED, 1700 mA Thorlabs M385LP1-C1
75cm2 Tissue Culture Flask - Vent Cap, SterileCelltreat Scientific Products229341
8.0 μm Cell Culture Plate Insert 12 mm DiameterMillicellPI8P01250
Absolute Ethanol, 200 proof, Molecular Biology GradeThermo Fisher ScientificT038181000CSEthanol for flow cytometry dead cell control.
Astrocyte Medium (Astrofull)ScienCell Research Laboratories1801Contains astrobasal, FBS, and penicillin/streptomycin. 
B-27 Supplement (50x), minus vitamin A (Gibco)Thermo Fisher Scientific12587010
BSA (MACS)Miltenyi Biotec 130-091-376
CD71 antibody (eBioscience, Invitrogen)Fisher Scientific 25-0719-41
Cell Counting Chambered SlidesNexcelom BioscienceCHT4-PD100-002
Cell ScrapersBiologix USA 70-1250
Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter (Nexelcom Bioscience)VWR NEXCCMK2-SK150-FCS
Centrifuge - Low-SpeedEppendorf 5702 RCentrifuge for cell culture.
Clear Polystyrene 96-Well Microplates, CorningFisher Scientific07-200-108V-bottom plates for flow cytometry staining.
CO2 Incubator, 150L, Heracell 150i (Thermo Scientific)Thermo Fisher Scientific50116047
Collagen I, High Concentration, Rat TailCorning354249
Collagen I, Rat TailCorning354236"Low" concentration for coating adherent flasks.
Collagenase (CAS# 9001-12-1)United States BiologicalC7511-30
Collimation Adapter for Olympus BX & IX, AR Coating: 350 - 700 nmThorlabsCOP1-A
Cotton Swabs, Q-tips Precision Tips AmazonB01KCJB3R2
Dispase (CAS# 9001-92-7) United States BiologicalD3760
DMEM, high glucose (Gibco)Thermo Fisher Scientific11330032
EVOS FLInvitrogenAMF4300
Fetal Bovine Serum (Gibco)Thermo Fisher Scientific26140079For microglia culture.
Formalin solution, neutral buffered, 10% (Sigma-Aldrich) Millipore SigmaHT501128
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience, Invitrogen)Thermo Fisher Scientific00-5523-00
Glioma stem cellsn/an/aCan be patient derived or commercial glioma stem cell lines. 
Guava easyCyte HT SystemMillipore Sigma0500-4008Flow cytometer.
HBSS (Sigma-Aldrich) Millipore SigmaH6648
HEPES (1 M) (Gibco)Thermo Fisher Scientific15630080
High-Power 1-Channel LED Driver with Pulse Modulation, 10.0 A Max, 50.0 V Max ThorlabsDC2200Interface for UV Lamp.
Hoechst 33342 Solution (20 mM) (Thermo Scientific)Thermo Fisher Scientific62249
Human AstrocytesScienCell Research Laboratories1800Primary astrocytes derived from the cerebral cortex.
Human EGF Recombinant Protein (Gibco)Thermo Fisher ScientificPHG0311
Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (aa 10-155) Recombinant Protein (Gibco)Thermo Fisher ScientificPHG0021
Immortalized Human Microglia - hTERTApplied Biological Materials T0251
Incu-mixer MP Heated Microplate Vortexer, 2 positionBenchmark Scientific H6002
Ki67 REAfinity, PerCP-Vio 700 antibodyMiltenyi Biotec130-120-420
LED UV Curing MeterGigahertz-OptikX1-RCH-116Optometer to measure UV light intensity.
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) Advanced Biomatrix5269-100MG Photoinitiator.
LIVE/DEAD Fixable Near-IR (Invitrogen) Thermo Fisher ScientificL24975
Methacrylated hyaluronic acid (photoHA)Advanced Biomatrix5212-100MG
Microcentrifuge, Sorvall ST8R (Thermo Scientific)Fisher Scientific75-997-203Centrifuge for flow cytometry staining.
N-2 Supplement (100X) (Gibco)Thermo Fisher Scientific17502048
Neurobasal-A Medium (Gibco)Thermo Fisher Scientific10888022
PBS (10X), pH 7.4 without Ca & MgQuality Biological119-069-101
Sodium hydroxide, pellets ACS (CAS# 1310-73-2)VWR 97064-476
Synergy Ultrapure Water Purification System (MilliporeSigma)Fisher Scientific SYNS0HFUS
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red (Gibco)Thermo Fisher Scientific25200056
ViaStain AOPI Staining SolutionNexcelom BioscienceCS2-0106

Referenzen

  1. Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2016-2020. Neuro Oncol. 25, 1-99 (2023).
  2. Stupp, R., et al.

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