Isolierung von Zellkernen aus humanem intermuskulärem Fettgewebe und nachgeschaltete Einzelkern-RNA-Sequenzierung

Zusammenfassung

Die Biologie des intermuskulären Fettgewebes (IMAT) ist aufgrund der begrenzten Zugänglichkeit von menschlichem Gewebe weitgehend unerforscht. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die Zellkernisolierung und die Bibliotheksvorbereitung von gefrorenen humanen IMAT für die Einzelkern-RNA-Sequenzierung, um die zelluläre Zusammensetzung dieses einzigartigen Fettdepots zu identifizieren.

Zusammenfassung

Intermuskuläres Fettgewebe (IMAT) ist ein relativ wenig untersuchtes Fettdepot, das sich zwischen Muskelfasern befindet. Der IMAT-Gehalt steigt mit dem Alter und dem BMI und wird mit Stoffwechsel- und Muskeldegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Das Verständnis der biologischen Eigenschaften von IMAT und seines Zusammenspiels mit den umgebenden Muskelfasern fehlt jedoch erheblich. In den letzten Jahren haben uns die Einzelzell- und Zellkern-RNA-Sequenzierung zelltypspezifische Atlanten verschiedener menschlicher Gewebe geliefert. Die zelluläre Zusammensetzung der humanen IMAT ist jedoch aufgrund der inhärenten Herausforderungen ihrer Zugänglichkeit aus der Biopsieentnahme beim Menschen weitgehend unerforscht. Neben der begrenzten Menge an entnommenem Gewebe ist die Verarbeitung der menschlichen IMAT aufgrund ihrer Nähe zu Skelettmuskelgewebe und Faszien kompliziert. Die lipidbeladene Natur der Adipozyten macht sie mit der Einzelzellisolierung unvereinbar. Daher ist die Einzelkern-RNA-Sequenzierung optimal für die Erlangung hochdimensionaler Transkriptomik mit Einzelzellauflösung und bietet das Potenzial, die Biologie dieses Depots aufzudecken, einschließlich der genauen zellulären Zusammensetzung von IMAT. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Zellkernisolierung und die Bibliotheksvorbereitung von gefrorenen humanen IMAT für die Einzelkern-RNA-Sequenzierung vor. Dieses Protokoll ermöglicht die Profilierung von Tausenden von Zellkernen unter Verwendung eines tröpfchenbasierten Ansatzes und bietet so die Möglichkeit, seltene und wenig häufige Zelltypen zu erkennen.

Einleitung

Intermuskuläres Fettgewebe (IMAT) ist ein ektopisches Fettdepot, das sich zwischen und um die Muskelfasern befindet¹. Wie in einer kürzlich erschienenen Übersichtsarbeit von Goodpaster et al. ausführlich beschrieben, kann IMAT mittels hochauflösender Computertomographie (CT) und Magnetresonanztomographie (MRT) nachgewiesen werden (Abbildung 1A,B) und befindet sich um und in Muskelfasern im gesamten Körper¹. Die Menge der IMAT variiert stark zwischen den Individuen und wird durch BMI, Alter, Geschlecht, Rasse und Bewegungsmangel beeinflusst ^2,3,4<....

Protokoll

Die für dieses Protokoll verwendete Stichprobe war Teil der Study of Muscle, Mobility, and Aging (SOMMA)^15, die vom Institutional Review Board der Western IRB-Copernicus Group (WCG) genehmigt wurde und in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt wurde. Die Teilnehmer gaben eine schriftliche Einverständniserklärung für ihre Teilnahme an der Studie ab.

HINWEIS : Dieses Protokoll wurde von einem früheren Protokoll adaptiert, bei dem 100 mg subkutanes Fettgewebe des menschlichen Abdomens auf einer Nanowell-basierten Plattform¹⁶ verwendet wurden. Das aktuelle Protoko....

Diskussion

Die Arbeit mit IMAT ist mit mehreren Herausforderungen verbunden. Neben der eingeschränkten Zugänglichkeit ist die Ausbeute an Probenmaterial oft sehr gering, und eine "Kontamination" der Skelettmuskulatur ist fast unmöglich zu vermeiden. Um die beste Probenqualität zu erhalten, sollte man beim Einführen der Biopsienadel in die Muskelfaszie eindringen (um sicherzustellen, dass kein subkutanes Fettgewebe entnommen wird) und so viel Muskelgewebe wie möglich entfernen, indem man die Probe unmittelbar nach der Entnahme.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm corning syringe filters	Millipore Sigma	CLS431229
1.7 mL DNA LoBind tubes	Eppendorf	22431021	low-bind tubes
10% Tween 20	Bio-Rad	1662404
100x protease inhibitor	Thermo Fisher Scientific	78437
10X Magnetic Separator	10X Genomics	230003
10X Vortex Adapter	10X Genomics	330002
15 mL canonical tubes	Sarstedt	6,25,54,502
2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939BA
50 mL conical tubes	Sarstedt	6,25,47,254
CellRanger	Genomics	N/A
Chromium iX accesory kit	10X Genomics	PN1000323
Chromium iX Controller	10X Genomics	PN1000326
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit	10X Genomics	PN1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3'  Kit v 3.1	10X Genomics	PN1000269
Chromium Next GEM Single Cell 3' Gel Bead Kit v3.1	10X Genomics	PN1000129
Chromium Next GEM Single Cell GEM Kit v3.1	10X Genomics	PN1000130
Countess 3 Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX2000	Automated cell counter
Countess cell counting chamber slides	Thermo Fisher Scientific	C10228
DoubletFinder	R	N/A
DPBS (no calcium, no magnesium)	Thermo Fisher Scientific	14190144
DTT	Thermo Fisher Scientific	R0861
Dual Index Kit TT Set A, 96 rxns	10X Genomics	PN1000215
Dynabeads MyOne SILANE	10X Genomics	PN2000048
Falcon 100 µm Cell strainer	Corning Life Science	352360
Falcon 40 µm Cell strainer	Corning Life Science	352340
Glycerin (glycerol), 50% (v/v) Aqueous Solution	Ricca Chemical Company	3290-32
KCL	Thermo Fisher Scientific	AM9640G
Library Construction Kit v3.1	10X Genomics	PN1000196
MACS SmartStrainers (30µm)	Miltenyi Biotec	130-098-458
Mastercycler Nexus Gradient Thermal cycler	Eppendorf	6331000017
MgCl2	Ambion	AM9530G
Mortar and pestel	Health care logistics	14075
NucBlue Live Ready Probes Reagent	Thermo Fisher Scientific	R37605
Nuclease Free Water (not DEPC treated)	Thermo Fisher Scientific	AM9930
Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder	Sigma-Aldrich	820024
Qiagen Buffer EB	Qiagen	19086
Ribolock RNAse inhibitor	Thermo Fisher Scientific	EO0382
Seurat	R	N/A
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
SUPERasin 20 U/µL	Thermo Fisher Scientific	AM2695
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000015
Tissue homogenizer	Glass-Col	099C K54
Tris buffer pH 8.0	Thermo Fisher Scientific	AM9855G
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	AC327372500
UltraPure 0.5M EDTA pH 8.0	Gibco	15575020