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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Quantitative 3D-Sauerstoffkarten von murinen Tumoren wurden nichtinvasiv mit Hilfe der Pulselektronen-Paramagnetischen Resonanz abgebildet. Ultraschall B-Modus und Power-Doppler wurden für die Anatomie und den Gefäßaufbau eingesetzt. Bilder aus beiden Modalitäten wurden überlagert, um eine multiparametrische Tumoranalyse zu ermöglichen.

Zusammenfassung

Die präzise Messung des Sauerstoffpartialdrucks (pO 2) in Echtzeit liefert wertvolle Informationen bei vielen Pathologien, einschließlich Krebs. Ein niedriger pO2-Wert des Tumors (d. h. Hypoxie) ist mit der Aggressivität des Tumors und einem schlechten Ansprechen auf die Therapie verbunden. Die Quantifizierung von TumorpO 2 ermöglicht die Bewertung der Wirksamkeit der Behandlung. Die elektronenparamagnetische Resonanztomographie (EPRI), insbesondere das Puls-EPRI, hat sich zu einer fortschrittlichen dreidimensionalen (3D) Methode zur Beurteilung der Sauerstoffversorgung des Gewebes in vivo entwickelt. Diese Innovation wurde durch die technologischen Entwicklungen in der EPR (Elektronen-Paramagnetische Resonanz) und die Anwendung der wasserlöslichen oximetrischen Spinsonden aus der Triarylfamilie ermöglicht, die schnelle und empfindliche Oxygenierungsdaten liefern. Die Relaxationszeit der Spinsonde (T1 und/oder T2) liefert genaue Informationen über pO2 in ausgewählten Voxeln.

Humane Glioblastom-LN229-Tumoren wurden im interscapularen Modepad von BALB/c-Nacktmäusen gezüchtet. Die Ultraschallbildgebung (US) wurde als Referenz für anatomische Informationen des Tumors verwendet. Um das GewebepO 2 abzubilden, wurden die Tiere mit Passermarken in eine feste Position im Tierbett gebracht, was eine Registrierung zwischen den Bildgebungsmodalitäten ermöglichte. Nach der Verabreichung des Kontrastmittels OX071 wurde eine EPRI durchgeführt, gefolgt von einem US-B-Modus. Aufgrund der geringen Toxizität der Spin-Sonde kann das Verfahren während des Tumorwachstums oder der Behandlung wiederholt werden. Nach der Bildgebung wurde der Registrierungsprozess mit einer in MATLAB geschriebenen Software durchgeführt. Letztendlich kann die hypoxische Fraktion für einen bestimmten Tumor berechnet werden, und das Histogramm der pO2-Gewebeverteilung kann über die Zeit verglichen werden. EPRI in Kombination mit Ultraschall ist ein hervorragendes Werkzeug für die Sauerstoffkartierung von Tumoren im präklinischen Umfeld.

Einleitung

Das Verständnis der Tumormikroumgebung (TME) mit ihren komplexen räumlichen und dynamischen Wechselwirkungen führt zu einem besseren Verständnis der Tumorbiologie. Hypoxie oder niedriger Sauerstoffgehalt ist die Schlüsselkomponente der TME und spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung anderer lebensbedrohlicher Erkrankungen, einschließlich Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Stoffwechselstörungen wie Diabetes und chronischer Nierenerkrankung 1,2,3. Die Sauerstoffversorgung des Gewebes ist ein grundlegender Faktor, insbesondere im Zusammenhang mit Krebserkrankungen, bei denen der partielle Sauerstoffdruck des Gewebes (pO 2) mit der Therapieresistenz korreliert. EinpO2-Spiegel von mehr als 10 mm Hg ist mit einer Steigerung der Wirksamkeit der Strahlentherapie mit niedrigem linearen Energietransfer (LET) verbunden (Sauerstoffanreicherungseffekt).

Neuere Studien mit Elektronen-Paramagnetischer Resonanztomographie (EPRI) haben gezeigt, dass die sauerstoffgesteuerte Strahlentherapie zu einer zweifachen Verbesserung der Überlebensraten bei verschiedenen Krebsarten in Mausmodellen führen kann 4,5. Dies ist ähnlich wie bei menschlichen Probanden, deren Tumor pO2 mit mehreren Eppendorf-Elektrodenmessungen gemessen wurde und bei denen festgestellt wurde, dass mediane oder mittlere pO2-Werte unter 10 torr6 lagen. Neben der Strahlentherapie wurde die Tumorhypoxie direkt mit der Tumoraggressivität und dem Ergebnis anderer Therapien, wie z. B. derImmuntherapie, korreliert 7,8. Dieser Zusammenhang unterstreicht die Bedeutung präziser Sauerstoffmessungen für die Verbesserung der therapeutischen Ergebnisse und das Verständnis der Pathophysiologie von Krankheiten.

Eine optimale In-vivo-Oximetrie erfordert eine direkte Messung des Sauerstoffpartialdrucks des Gewebes, unabhängig von Faktoren wie der Gewebeperfusion und der Hämoglobinsättigung. Das Verfahren sollte nicht-invasiv sein, mit einer kurzen und präzisen Bildgebungszeit, um mögliche Auswirkungen auf den Organismus zu vermeiden, wie z. B. eine verlängerte Anästhesie, Veränderungen der Gewebetemperatur oder signifikante Veränderungen des Gewebedrucks und des pH-Werts. Die Gewebeoximetrie sollte eine hohe Genauigkeit und Zuverlässigkeit aufweisen und unabhängig von Schwankungen in der Mikroumgebung des Gewebes, einschließlich Unterschieden im pH-Wert und Redoxzustand, konsistente Messungen gewährleisten. Für eine effektive Therapieplanung sind die Echtzeit-Bilddatenrekonstruktion und die einfache Interpretation von entscheidender Bedeutung. Dies beinhaltet nicht nur das Erreichen einer räumlichen Auflösung von vorzugsweise weniger als 1 mm, sondern ermöglicht auch eine schnelle Datenerfassung zur Überwachung dynamischer Änderungen des Sauerstoffstatus des Gewebes, wie z. B. zyklische Hypoxie.

In diesem Zusammenhang wurden verschiedene Techniken zur Messung von molekularem Sauerstoff oder zur Beurteilung von Hypoxie entwickelt, die jeweils eine einzigartige Anwendbarkeit und Vorteile bieten. Die Platinelektrode, die als "Goldstandard" für die Oximetrie von zellulärem und lebendem tierischem Gewebe gilt, bietet konsistente Messungen durch präzises Einführen in das Gewebe. Andere Ansätze, wie z. B. optische Methoden mit Fluoreszenzsonden, Photoakustik, Überwachung der Auswirkungen von Hypoxie durch Gen- oder Proteinexpression oder Kometenassays, sind einfach zu verwenden, aber indirekt oder durch den optischen Weg im Gewebe begrenzt. Vielversprechende Alternativen zur Beurteilung von Hypoxie und/oder Oxygenierung scheinen die Magnetresonanztomographie (MRT)-OE-MRT10 -- oder MOBILE11, die Positronen-Emissions-Tomographie (PET) mit verschiedenen Hypoxie-empfindlichen Sonden12 oder die Elektronenparamagnetische Resonanz (EPR) zu sein.

Das EPD blickt auf eine lange Geschichte im Bereich der Biomedizin zurück. Das Phänomen selbst wurde erstmals 1944 beschrieben und als Werkzeug zur Analyse chemischer Strukturen und in jüngerer Zeit für biologische Systeme und Materialien mit ungepaarten Elektronen eingesetzt13. Die EPR-Spektroskopie wurde verwendet, um die Dynamik und Struktur biologischer Systeme wie Photosynthese, Metalloproteine, radikalische Enzyme und Phospholipidmembranen zu untersuchen 14,15,16. Die Spektroskopie und Tomographie der paramagnetischen Elektronenresonanz (EPR) hat sich als entscheidende nicht-invasive Methoden zur Untersuchung der Tumoroxygenierung und der Mikroumgebung mit einer räumlichen Auflösung von ~1 mm, einer zeitlichen Auflösung von 1-10 min und einer pO2-Auflösung von 1-3 torr 5,17,18 herausgestellt.

Dauerstrich-EPR-Methoden (CW) sind aufgrund der Einfachheit der Aufzeichnung und Interpretation von Spektren in den meisten Anwendungen nach wie vor weit verbreitet. Die Wechselwirkungen zwischen Sauerstoff und Spin-Sonde funktionieren, indem sie Veränderungen der EPR-Signalintensität oder der Linienform bewerten und so Einblicke in den Sauerstoffgehalt in der Probe geben. CW EPR hat im Vergleich zu Pulsmethoden einen bemerkenswerten Vorteil bei der Empfindlichkeit gegenüber einem breiteren Bereich vonpO 2. Durch die Anwendung verschiedener Pulssequenzen können Informationen wie Elektronenspin-Spin-Relaxationszeiten, Spin-Gitter-Relaxationszeiten und Wechselwirkungen mit benachbarten Spins aufgeklärt werden 18,19. Puls-EPR-Techniken, wie z. B. die Inversionswiederherstellung mit Elektronenspin-Echo-Auslesung (IRESE), messen die Relaxationsraten des Spingitters und verhindern so die Relaxation des Artefakts, die durch die Relaxation von Spinsonde und Spinsonde bei niedrigen Sauerstoffkonzentrationen verursacht wird19,20. EPR kann verwendet werden, um Änderungen der Sauerstoffkonzentration mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung zu überwachen; Bei der Oximetrie bei hohen Sauerstoffkonzentrationen stößt die Puls-EPR jedoch aufgrund der kurzen Relaxationszeiten der transversalen Magnetisierung, die mit dem Elektronenspinecho (ESE) gemessen wird, an ihre Grenzen. Letztendlich ergänzen sich CW und Puls-EPR, und ein zuverlässiges Verständnis des Spinsystems erfordert die Anwendung beider Methoden.

EPR-Oximetrie-Techniken beruhen auf der linearen Beziehung zwischen dem Sauerstoffgehalt und dem Spin-Gitter sowie auf den Spin-Spin-Relaxationsraten in Lösung. Alle oximetrischen Sonden werden oft in zwei Typen unterteilt: lösliche und partikuläre Spinsonden. Die Wahl der richtigen Spinsonde hängt vom Versuchsaufbau und den benötigten Informationen ab 21,22,23. Lösliche Spinsonden, wie Nitroxide oder die Tritylderivate24,25, wie OX063 und seine deuterierte Form OX071, die im gesamten Gewebe verteilt sind, liefern Informationen aus dem gesamten Volumen. Alternativ können für Einzelpunktmessungen und für verlängerte und wiederkehrende Sauerstoffbewertungen Festkörpersonden wie LiPc, LiBuO oder Kohlenstoffderivate verwendet werden (siehe Tabelle 1)22,23,26.

Die Ultraschall-B-Mode-Bildgebung wird in der Klinik häufig für die Bildgebung von Weichgewebe eingesetzt. Die Auflösung hängt von der verwendeten Schallkopffrequenz ab, und für präklinische Studien bieten 18 MHz und höher eine ausreichende Auflösung in der Ebene und in der Tiefe des Bildes. Ein weiterer Vorteil der Sonographie ist die Möglichkeit, funktionelle Gefäßbilder im Power-Doppler-Modus zu erhalten. Hier stellen wir die elektronenparamagnetische Resonanz-Sauerstoff-Bildgebung (EPROI) als Methode zur Erstellung von 3D-Sauerstoffkarten von Tumoren in lebenden Mäusen vor. Die entsprechende Sonographie ermöglicht die notwendige anatomische Referenz für die Tumordefinition innerhalb von EPROI. Für jedes Tier sind mehrere bildgebende Untersuchungen möglich. Der letzte Schritt ist die Analyse, einschließlich der Bildrekonstruktion und Registrierung zwischen den Modalitäten, um einpO2-Histogramm aus dem Tumorvolumen zu erhalten.

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Protokoll

Die Mäuse wurden aus einer zugelassenen Tierzuchtanlage gewonnen und alle Versuche wurden in Übereinstimmung mit ethischen Richtlinien durchgeführt (in unserem Fall - Genehmigung Nr. 165/2023, Erste Lokale Ethikkommission, Krakau, Polen).

1. Tiere und Tumorlinie

HINWEIS: Die Mäuse wurden unter Standard-Laborbedingungen untergebracht: Hell/dunkel: 12 h/12 h, Luftfeuchtigkeit: 60%, Temperatur: 23 °C. Sie erhielten eine Standard-Chow-Diät mit freiem Zugang zu Trinkwasser in Gemeinschaftskäfigen.

  1. Maus-Glioblastoma multiforme LN229-Zelllinienkultur
    1. Kultivieren Sie LN229-Zellen in 25 cm2 Gewebekulturflaschen in DMEM-Medium, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) und Penicillin-Streptomycin in Konzentrationen von 10 U/ml bzw. 0,1 mg/ml.
    2. Halten Sie die Zellen in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 bei 37 °C und durchlaufen Sie sie alle 48 Stunden mit 0,25 % Trypsin-EDTA und PBS ohne Magnesium- und Calciumionen (pH 7,4).
  2. Tumor-Inokulation
    1. Fassen Sie Mäuse eine Woche vor der Inokulation täglich an, um sie mit dem Untersucher vertraut zu machen.
    2. Wiegen Sie die Mäuse am Tag der Impfung.
    3. Suspendieren Sie 200.000 LN229-Zellen in 50 μl extrazellulärer Matrix ohne Wachstumsfaktoren. Mit einer 29 G Nadel inokulieren Sie die Zellmischung subkutan in das intrascapulare Fettpolster von 16 Wochen alten BALB/c Nacktmäusen (N = 5).

2. Doppler-US-Bildgebung

Der gesamte Zeitverlauf der Tumorbildgebung ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Ultraschallbildgebung wird sowohl für die Gefäßbildgebung mittels Doppler US als auch für die Anatomy US als Referenz kurz vor EPROI verwendet (Abbildung 2). Die anatomische Bildgebung im B-Modus ist für die Analyse der Tumoroxygenierung mittels EPR unerlässlich und wird in Abschnitt 3 beschrieben. Die Doppler-Ultraschallbildgebung (Abschnitt 2) ist zwar nicht zwingend erforderlich für eine erfolgreiche Registrierung, liefert aber dennoch wertvolle Informationen über das optimale Zeitfenster für die EPR-Studie und ermöglicht die Bestimmung des aktiven Gefäßsystems im Tumorbereich.

  1. Vorbereitung der Maus
    1. Warten Sie, bis die Tumore etwa 30 mm erreichen3. Rasieren Sie die Mäuse bei Bedarf manuell um die Tumorstelle herum.
    2. Induzieren Sie eine Anästhesie mit 2 % Isofluran und halten Sie sie mit 1-1,5 % Isofluran aufrecht.
    3. Bringen Sie das Tier aus der Anästhesiekammer auf ein Heizkissen, um die Körpertemperatur während der Zubereitung auf 37 °C zu halten (basierend auf dem rektalen Temperaturfühler). Stabilisieren Sie die Temperatur des Tieres, um eine korrekte Rückmeldung der physiologischen Parameter zu erhalten.
  2. Ultraschall
    1. Verwenden Sie das Ultraschallsystem mit einem 57-25 MHz Schallkopf für die präklinische Bildgebung (Abbildung 2, Schritt 1).
    2. Erfassen Sie 3D-B-Mode-Messungen zur Visualisierung der Tumormorphologie in sagittaler Richtung. Verwenden Sie eine Schrittweite von 0,1 mm.
      HINWEIS: Bewegen Sie weder das Tier noch den Schallkopf, um genau die gleichen Einstellungen beizubehalten.
    3. Verwenden Sie den Power-Doppler-Modus , um funktionelle Tumorgefäße mit den folgenden Parametern zu visualisieren: Geschwindigkeit: 1,5 kHz, Wandfilter: Niedrig, Priorität: 75%, Persistenz: Mittel, Schrittweite 0,10 mm.
    4. Drehen Sie den Messkopf, um die Schritte 2.2.2 und 2.2.3 in axialer Richtung zu wiederholen.
    5. Führen Sie die Datenanalyse mit der vom Ultraschallhersteller bereitgestellten Software durch. Markieren Sie die Tumorgrenze, laden Sie sie in ein 3D-Bild hoch und berechnen Sie das Tumorvolumen und den prozentualen Anteil des Gefäßsystems.

3. EPROI

  1. Vorbereitung der Sonde
    1. OX071-Pulver, das bei -80 °C in injizierbarem H2O gelagert wird, wird auf eine Endkonzentration von 1 g/10 mL (~70 mM) aufgelöst.
  2. Vorbereitung der Maus
    1. Betäuben Sie die Mäuse mit 1%-3% Isofluran, gemischt mit Raumluft und positionieren Sie sie auf einer Tierhalterung.
    2. Verabreichen Sie 1 ml physiologische Kochsalzlösung subkutan, um den richtigen Feuchtigkeitsgehalt aufrechtzuerhalten.
    3. Überwachen Sie die Atemfrequenz (80 ± 20 BPM) und die Temperatur (37 ± 1 °C) des Tieres mit einem Atemkissensensor und einem Oberflächenthermometer, das an der Maushaut befestigt ist. Überwachen Sie die Rektaltemperatur als Referenzpunkt (37 °C ± 1 °C).
    4. Führen Sie einen Schlauch aus Polytetrafluorethylen (PTFE) (0,7 mm Außendurchmesser) intraperitoneal für die Verabreichung der Spin-Sonde ein. Sichern Sie die Kanüle mit Vinylpolysiloxan (VPS), um ein Herausfallen aus der Bauchhöhle zu verhindern.
    5. Führen Sie einen Urinkatheter (24 G) ein, um die ausgeschiedene Spin-Sonde aufzufangen.
    6. Sichern Sie die Maus in einem Tierbett mit VPS-Zahnmasse zur Immobilisierung (Abbildung 2A).
  3. Anatomische US-Bildgebung für die Registrierung
    1. Schalten Sie den 3D-gesteuerten Tisch ein und richten Sie das Bett aus. Stellen Sie die Temperatur der Plattform auf 60 °C ein, so dass die Temperatur des durch den Kunststoffbetthalter isolierten Tieres bei 37 °C gehalten wird.
    2. Platzieren Sie das Tierbett mit dem immobilisierten Tier in der Betthalterung und bringen Sie es zur anatomischen Bildgebung vor der EPR-Messung auf einen 3D-gesteuerten Tisch (Abbildung 2B). Stellen Sie sicher, dass das Tier in der Betthalterung gesichert ist und die Heizplattform nicht berührt.
    3. Fixieren Sie die Position des Betthalters in drei Dimensionen, um eine Drehung zu verhindern, insbesondere eine XZ-Drehung (Sagittalebene), die für eine genaue Registrierung entscheidend ist.
    4. Platzieren Sie einen Positionsmarker (Angeldraht auf dem Band, 0,35 mm Durchmesser) auf dem Betthalter, der den Beginn des Resonators markiert.
    5. Führen Sie die B-Modus-Bildgebung manuell mit einem Schritt von 1 mm in axialer und sagittaler Richtung in Richtung Y-Achse durch.
    6. Abbildung der Tumorstruktur mit den folgenden Parametern in Abhängigkeit von der spezifischen Schallkopffrequenz; für einen 18 MHz Wandler, Tiefe 20 mm, Dynamikumfang 84 dB, Leistung 8 dB, Verstärkung 80%; für 40 MHz Wandler, Tiefe 20 mm, Dynamikumfang 32 dB, Verstärkung 100%; für 57 MHz Wandler, Tiefe 13 mm, Verstärkung 6 dB, Leistung 100%. Passen Sie die Einstellung des Schallkopffokus entsprechend der jeweiligen Tumorposition an.
    7. Wischen Sie am Ende der anatomischen Bildgebung das überschüssige Gel von der Maus ab und nehmen Sie die immobilisierte Maus im Tierbett aus dem Betthalter.
  4. EPR-Sauerstoffbildgebung
    1. Verwenden Sie den Sauerstoff-Imager für Pulse EPR, der in Funkfrequenzen von 685 MHz bis 735 MHz arbeitet. Verwenden Sie für die Einrichtung versetzte Spulen für die 3D-Bildgebung und Analyse der Relaxationszeiten. Verwenden Sie einen horizontalen Resonator mit den Maßen 32 mm x 35 m.
    2. Übertragen Sie die immobilisierte Maus im Tierbett nach dem anatomischen Ultraschall umgehend in den EPR-Imager (Abbildung 2C). Die Position des Tierbettes ist sorgfältig beizubehalten, um Rotationen innerhalb des Resonators zu minimieren, ähnlich wie in Abschnitt 3.3 beschrieben.
    3. Schließen Sie den Temperaturfühler wieder an, um eine kontinuierliche Überwachung und Aufrechterhaltung der Temperatur des Tieres zu gewährleisten, und korrelieren Sie sie mit der Temperatur im Resonator.
    4. Führen Sie in der EPR-Spektrometer-Software die Resonatorabstimmung durch, indem Sie die Frequenz mit dem Abstimmrad um 725 MHz zentrieren (Abbildung 3A).
      HINWEIS: Ein gut abgestimmter Resonator sollte einen Einbruch von 25 dB oder besser haben.
    5. Optimieren Sie die Mikrowellenleistung, um einen Spitzenwert von 60 ns zu erzielen (Abbildung 3B), indem Sie den Dämpfungswert von 20 dB auf 3 dB anpassen.
    6. Stimmen Sie das Instrument so, dass der freie Induktionszerfall (FID) von Passern, die im Tierbett positioniert sind, im Magnetfeld zentriert und phasenweise angeordnet ist (Abbildung 3C).
    7. Verabreichen Sie 100 μl OXO71 intraperitoneal durch die zuvor eingeführte Kanüle, gefolgt von einer Spülung mit 50-100 μl Kochsalzlösung.
    8. Mit einer programmierten Warteschlangensequenz können Messungen mit festgelegten Parametern erfasst werden. Eine typische Sequenz enthält T1, T2 Relaxationszeiten, 3D Electron Spin Echo (ESE) für Passerbilder und 4D Inversion Recovery Electron Spin Echo (IRESE) für das Tierbild. Erfassen Sie die IRESE-Bildgebung mit einem Gradienten von 1,5 G/cm, einer Wiederholzeit von 55 μs, einer Vortriggerung von -250 ns, t90 von 60 ns und tau von 400 ns; Gesamterfassungszeit ~12 min. Wiederholen Sie die IRESE-Bildgebung mindestens 30-40 Minuten (3-4x) nach der Sondeninjektion.
    9. Nach der Bildgebung übertragen Sie die Maus aus dem Tierbett auf das Heizkissen. Verabreichen Sie 1 ml physiologische Kochsalzlösung subkutan, um den richtigen Feuchtigkeitsgehalt aufrechtzuerhalten. Überwachen, bis die Maus die aufrechte Fortbewegung wiedererlangt.

4. Datenanalyse

  1. 4D-Rekonstruktionsanalyse in "ProcessGUI"
    1. Wenden Sie vor der Rekonstruktion eine Basislinienkorrektur auf die Projektionen an, indem Sie das Szenario "PulseRecon.scn" auswählen und die Parameterdatei "IRESE_64pts_mouse_STANDARD_CHIRALITY.par" laden, um die IRESE-Rohdaten zu analysieren.
    2. Filtern Sie jede Projektion mit einem Gaußschen Filter mit einer Breite von 4 Punkten, einer Standardeinstellung für das ausgewählte Szenario.
    3. Führen Sie eine Unterstichprobe der gefilterten Projektionen auf 64 Punkte (Matrixgröße) durch, eine Standardeinstellung für das ausgewählte Szenario.
    4. Filtern Sie die Projektionen weiter mit einem Ram-Lak-Filter mit Apodisierung bei 0,6-facher Nyquist-Frequenz (klicken Sie auf Rekonstruktionsparameter | FilterCutOff).
    5. Projizieren Sie die gefilterten Projektionen zurück, um ein spektral-räumliches 4D-Bild zu erzeugen.
    6. Verwenden Sie einen Anpassungsalgorithmus, um die Linienbreite des Spin-Pakets aus dem Spektrum in jedem Voxel zu extrahieren. Einstellung der Schnittanpassungsparameter : Letzter Punkt-Extender - 3, Anpassungsmethode - Standard.
    7. Verwenden Sie die Standardeinstellungen für Parameter in der Anpassungsprozedur, einschließlich der Amplitude des Spektrums, der Phase, des Spektralzentrums und der Linienbreite des spektralen Spin-Pakets.
  2. Registrierung zwischen anatomischem US und EPROI in "ArbuzGUI" (Abbildung 4)
    HINWEIS: Für die Registrierung wurde das von Boris Epel von der University of Chicago entwickelte MATLAB-Verfahren "ArbuzGUI" verwendet. Die Software ist unter EPR-IT https://github.com/o2mdev/eprit erhältlich. Das Instrumentarium für die Registrierung wurde bereits an anderer Stelle erläutert27. In der Bedienungsanleitung finden Sie eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitung28.
    1. Laden Sie 2D-US-Bilder als Stapel in 1-mm-Schritten (der Schritt bezieht sich streng auf die Frame-Erfassung bei der B-Modus-Bildgebung, Punkt 3.3.7), um 3D-US-Bilder zu erstellen.
    2. Fügen Sie gesammelte pO2-Bilder (rekonstruiert in Schritt 4.1) als 3D-Bildtyp hinzu, der als "PO2_pEPRI"-Daten festgelegt ist. Speichern Sie Daten im Projekt.
    3. Erstellen Sie eine Registrierungssequenz und -transformation, indem Sie Spezial | MRT-EPRI-Registrierung.
    4. Wählen Sie das Bild aus, das in EPRI-Daten angepasst werden soll (z. B. US axial 3D), indem Sie Sequenz | Aktion hinzufügen auswählen. Verwenden Sie Stufe 5:T2 für die beste Leistung. Im Ergebnis erscheint ein schwarzes Plus-Symbol vor dem Namen des ausgewählten Bildes.
    5. Öffnen Sie das US-Bild in SliceMaskEditPLG. Passen Sie den Maßstab des US-Bildes basierend auf dem auf den Bildern dargestellten Lineal an. Markieren Sie die US-Positionsmarkierung, den Tierumriss und die Tumorposition basierend auf ausgewählten Frames.
    6. Markieren Sie in der SliceMaskEditPLG den Umriss und das Passerzeichen der pO2-Karte in rekonstruierten 4D-pO2-Bildern .
    7. Drehen Sie das US-Bild mit dem Figurenbetrachter und der RotateImagePLG-Toolbox entsprechend der US-Positionsmarkierung im Vergleich zu den Passermarken, um die pO2-Karte mit dem US-Umriss zu registrieren.
    8. Transformieren Sie die Tumormaske vom US-Bild in diepO 2-Map .
    9. Visualisieren Sie die Tumormaske in der pO2-Map der Maus und exportieren Sie diepO 2-Werte für jedes Voxel.

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Ergebnisse

In Abbildung 5 ist ein repräsentativer Querschnitt aus dem Ultraschallbild eines LN229-Tumors dargestellt, der im intrascapularen Fettpolster zusammen mit dem Gefäßsystem wächst. Ein Teil des Gefäßsystems ist außerhalb der Tumorgrenze zu sehen. Unerwarteterweise nahm der Prozentsatz des Tumorgefäßvolumens nicht ab und blieb mit dem Tumorwachstum stabil.

Wie in Abbildung 2 dargestellt, beinhal...

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Diskussion

Das beschriebene Bildgebungsprotokoll enthält einige kritische Schritte. Erstens, um die Anatomiebilder mit den Sauerstoffkarten zu registrieren, könnte die MRT aufgrund der besseren Auflösung und der Möglichkeit, detaillierte 3D-Daten zu liefern, eine bessere Wahl als Ultraschall sein19. Ultraschall mit einem Hochfrequenz-Schallkopf bietet eine hervorragende Auflösung und eine ausreichende Bildgebungstiefe für präklinische Studien. Sowohl die MRT als auch ...

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Offenlegungen

Prof. H. Halpern und B. Epel sind Mitbegründer von O2M Technologies. Die anderen Autoren: G. Dziurman, A. Bienia, A. Murzyn, B. Płóciennik, J. Kozik, G. Szewczyk, M. Szczygieł, M. Krzykawska-Serda und M. Elas haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

Wir danken O2M Technology für die großzügige technische Unterstützung. Die Finanzhilfen des polnischen Nationalen Wissenschaftszentrums Nr. 2020/37/B/NZ4/01313 (Jiva-25-Imager) und NCBiR: ENM3/IV/18/RXnanoBRAIN/2022 (Tierkosten) werden anerkannt. Die Anschaffung des VevoF2-Ultraschalls wurde von der Fakultät für Biochemie, Biophysik und Biotechnologie im Rahmen der Strategischen Exzellenzinitiative an der Jagiellonen-Universität unterstützt.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
aqua pro injectionePolpharma1280610-
ArbuzGUI O2M Technologies-accesible in the github repository
disodium phosphatePOCH S.A.799280115-
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - high glucoseMerck Life ScienceD56484500 mg/L glucose and L-glutamine
fetal bovine serum Gibco, Thermo Fisher Scientific10500064-
fishing wireGood FishA-55A-035US position marker - 0.35 mm
GeltrexGibco, Thermo Fisher ScientificA1413302reduced growth factor basement membrane matrix
ibGUIO2M Technologies-accesible in the github repository
injectio natrii chlorati isotonicaPolpharmamultipe items were used9 mg/mL
insulin needles 29 G Becton, Dickinson and Companymultipe items were used-
Jiva 25O2M Technologies-EPROI
MATLABMathWorks-version R2021b
penicillin-streptomycinMerck Life ScienceP4333with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL
potassium chloridePOCH S.A.739740114-
potassium dihydrogen phosphatePOCH S.A.742020112-
ProcessGUIO2M Technologies-accesible in the github repository
PTFE tubing Cole Palmer Instrument Co06412-11-
sodium chloridePOCH S.A.794121116-
SpecMan4EPRFEMI Instruments-version 3.4 CS 64bit
Surflash I.V. CatheterTerumoSR*FF2419size: 24G x ¾"
tape3M multipe items were usedmicropore
Trypsin-EDTA Gibco, Thermo Fisher Scientific25200072-
UltrasonographyTelemed-Anatomical US
US gelKONIXNUG-0019-
VetfluraneVirbac1373171000 mg/g
Vevo F2FujiFilms, Visual Sonics-B-mode and Doppler
vinyl polysiloxane dental clay 3M ESPEmultiple items were used-

Referenzen

  1. Chen, P. -S. Pathophysiological implications of hypoxia in human diseases. J Biomed Sci. 27, 63(2020).
  2. Lopez-Pascual, A., Trayhurn, P., Martínez, J. A., González-Muniesa, P. Oxygen in metabolic dysfunction and its therapeutic relevance. Antioxid Redox Signal. 35 (8), 642-687 (2021).
  3. Vaupel, P., Mayer, A., Höckel, M. Tumor hypoxia and malignant progression. Methods Enzymol. 381, 335-354 (2004).
  4. Gertsenshteyn, I., et al. Absolute oxygen-guided radiation therapy improves tumor control in three preclinical tumor models. Front Med (Lausanne). 10, 1269689(2023).
  5. Epel, B., et al. Oxygen-guided radiation therapy. Int J of Radiat Oncol Biol Phys. 103 (3), 977-984 (2019).
  6. Hockel, M., et al. Association between tumor hypoxia and malignant progression in advanced cancer of the uterine cervix. Cancer Res. 56 (19), 4509-4515 (1996).
  7. Semenza, G. L. Intratumoral hypoxia and mechanisms of immune evasion mediated by hypoxia-inducible factors. Physiology (Bethesda). 36 (2), 73-83 (2021).
  8. Dewhirst, M. W., Mowery, Y. M., Mitchell, J. B., Cherukuri, M. K., Secomb, T. W. Rationale for hypoxia assessment and amelioration for precision therapy and immunotherapy studies. J Clin Invest. 129 (2), 489-491 (2019).
  9. Tatum, J. L., et al. Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy. Int J Radiat Biol. 82 (10), 699-757 (2006).
  10. O'Connor, J. P. B., et al. Oxygen-enhanced MRI accurately identifies, quantifies, and maps tumor hypoxia in preclinical cancer models. Cancer Res. 76 (4), 787-795 (2016).
  11. Colliez, F., et al. Oxygen mapping within healthy and acutely infarcted brain tissue in humans using the NMR relaxation of lipids: A proof-of-concept translational study. PLoS One. 10 (8), e0135248(2015).
  12. Gouel, P., et al. Advances in PET and MRI imaging of tumor hypoxia. Front Med (Lausanne). 10, 1055062(2023).
  13. Płonka, P. M. Paramagnetomics. Electron Spin Resonance Spectroscopy in Medicine. , 189-221 (2019).
  14. Kavetskyy, T. S., et al. EPR study of self-organized magnetic nanoparticles in biomaterials. Semiconductor Physics, Quantum Electronics and Optoelectronics. 25, 146-156 (2022).
  15. Eaton, G. R., Eaton, S. S., Ohno, K. EPR Imaging and in Vivo EPR. , CRC Press. (2018).
  16. Berliner, L. J. The evolution of biomedical EPR (ESR). Biomed Spectrosc Imaging. 5 (1), 5-26 (2017).
  17. Matsumoto, K. -I., et al. EPR-based oximetric imaging: a combination of single point-based spatial encoding and T1 weighting. Magn Reson Med. 80 (5), 2275-2287 (2018).
  18. Kishimoto, S., et al. Pulsed electron paramagnetic resonance imaging: Applications in the studies of tumor physiology. Antioxid Redox Signal. 28 (5), 1378-1393 (2018).
  19. Epel, B., Halpern, H. J. In vivo pO2 imaging of tumors: Oxymetry with very low-frequency electron paramagnetic resonance. Methods Enzymol. 564, 501-527 (2015).
  20. Epel, B., et al. Absolute oxygen R1e imaging in vivo with pulse electron paramagnetic resonance. Magn Reason Med. 72 (2), 362-368 (2014).
  21. Ahmad, R., Kuppusamy, P. Theory, instrumentation, and applications of electron paramagnetic resonance oximetry. Chem Rev. 110 (5), 3212-3236 (2010).
  22. Kuppusamy, P. Sense and sensibility of oxygen in pathophysiology using EPR oximetry. Measuring oxidants and oxidative stress in biological systems. Berliner, L. J., Parinandi, N. L. , Springer. Cham (CH). (2020).
  23. Flood, A. B., Satinsky, V. A., Swartz, H. M. Comparing the effectiveness of methods to measure oxygen in tissues for prognosis and treatment of cancer. Adv Exp Med Biol. 923, 113-120 (2016).
  24. Ardenkjær-Larsen, J. H., et al. EPR and DNP properties of certain novel single electron contrast agents intended for oximetric imaging. J Magn Reason. 133, 1-12 (1998).
  25. Reddy, T. J., Iwama, T., Halpern, H. J., Rawal, V. H. General synthesis of persistent trityl radicals for EPR imaging of biological systems. J Org Chem. 67 (14), 4635-4639 (2002).
  26. Kmiec, M. M., Tse, D., Kuppusamy, P. Oxygen-sensing paramagnetic probes for clinical oximetry. Adv Exp Med Biol. 1269, 259-263 (2021).
  27. Pandian, R. P., Parinandi, N. L., Ilangovan, G., Zweier, J. L., Kuppusamy, P. Novel particulate spin probe for targeted determination of oxygen in cells and tissues. Free Radic Biol Med. 35 (9), 1138-1148 (2003).
  28. O2M Technologies LLC. JIVA-25 Oxygen Imager User Manual. , (2024).
  29. Epel, B., et al. Electron paramagnetic resonance oxygen imaging of a rabbit tumor using localized spin probe delivery. Med Phys. 37 (6 Part1), 2553-2559 (2010).
  30. Epel, B., Viswakarma, N., Sundramoorthy, S. V., Pawar, N. J., Kotecha, M. Oxygen imaging of a rabbit tumor using a human-sized pulse electron paramagnetic resonance imager. Mol Imaging Biol. 26 (3), 403-410 (2023).
  31. Epel, B., Redler, G., Tormyshev, V., Halpern, H. J. Towards human oxygen images with electron paramagnetic resonance imaging. Adv Exp Med Biol. 876, 363-369 (2016).
  32. Elas, M., et al. EPR oxygen images predict tumor control by a 50% tumor control radiation Dose. Cancer Res. 73 (17), 5328-5335 (2013).
  33. Elas, M., et al. Electron paramagnetic resonance oxygen images correlate spatially and quantitatively with Oxylite oxygen measurements. Clin Cancer Res. 12 (14), 4209-4217 (2006).
  34. Redler, G., Epel, B., Halpern, H. J. Principal component analysis enhances SNR for dynamic electron paramagnetic resonance oxygen imaging of cycling hypoxia in vivo. Magn Reson Med. 71 (1), 440-450 (2014).
  35. Naz, S., Kishimoto, S., Mitchell, J. B., Krishna, M. C. Imaging metabolic processes to predict radiation responses. Semin Radiat Oncol. 29 (1), 81-89 (2019).
  36. Yamamoto, K., et al. Molecular imaging of the tumor microenvironment reveals the relationship between tumor oxygenation, glucose uptake, and glycolysis in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Res. 80 (11), 2087-2093 (2020).
  37. Kawai, T., et al. Continuous monitoring of postirradiation reoxygenation and cycling hypoxia using electron paramagnetic resonance imaging. NMR Biomed. 35 (10), e4783(2022).
  38. Takakusagi, Y., et al. Pyruvate induces transient tumor hypoxia by enhancing mitochondrial oxygen consumption and potentiates the anti-tumor effect of a hypoxia-activated prodrug TH-302. PLoS One. 9 (9), e107995(2014).
  39. Li, T., et al. Evaluations of an early change in tumor pathophysiology in response to radiotherapy with oxygen enhanced electron paramagnetic resonance imaging (OE EPRI). Mol Imaging Biol. 26 (3), 448-458 (2024).
  40. Schaner, P. E., et al. First-in-human study in cancer patients establishing the feasibility of oxygen measurements in tumors using electron paramagnetic resonance with the OxyChip. Front Oncol. 11, 743256(2021).
  41. Swartz, H. M., et al. How best to interpret measures of levels of oxygen in tissues to make them effective clinical tools for care of patients with cancer and other oxygen-dependent pathologies. Physiol Rep. 8 (15), 14541(2020).
  42. Tseytlin, M., et al. A combined positron emission tomography (PET)-electron paramagnetic resonance imaging (EPRI) system: initial evaluation of a prototype scanner. Phys Med Biol. 63 (10), 105010(2018).
  43. Kim, H., et al. Development of a PET/EPRI combined imaging system for assessing tumor hypoxia. J Instrum. 16 (03), P03031(2021).
  44. Shen, J., et al. Development of isoindoline nitroxides for EPR oximetry in viable systems. Appl Magn Reason. 22, 357-368 (2002).
  45. Alecci, M., Ferrari, M., Quaresima, V., Sotgiu, A., Ursini, C. L. Simultaneous 280 MHz EPR imaging of rat organs during nitroxide free radical clearance. Biophys J. 67 (3), 1274-1279 (1994).
  46. Hyde, J. S., Subczynski, W. K. Simulation of ESR spectra of the oxygen-sensitive spin-label probe CTPO. J Magn Reson (1969). 56 (1), 125-130 (1984).
  47. Sarna, T., Dulȩba, A., Korytowski, W., Swartz, H. Interaction of melanin with oxygen. Arch Biochem Biophys. 200 (1), 140-148 (1980).
  48. Bratasz, A., Kulkarni, A. C., Kuppusamy, P. A highly sensitive biocompatible spin probe for imaging of oxygen concentration in tissues. Biophys J. 92 (8), 2918-2925 (2007).
  49. Gluth, T. D., et al. Biocompatible monophosphonated trityl spin probe, HOPE71, for in vivo measurement of pO2, pH, and [Pi] by electron paramagnetic resonance spectroscopy. Anal Chem. 92 (2), 946-954 (2022).
  50. Gluth, T. D., et al. Large-scale synthesis of a monophosphonated tetrathiatriarylmethyl spin probe for concurrent in vivo measurement of pO2, pH and inorganic phosphate by EPR. RSC Adv. 11 (42), 25951-25954 (2022).
  51. Vahidi, N., et al. In vivo and in vitro EPR oximetry with fusinite: A new coal-derived, particulate EPR probe. Magn Reson Med. 31 (2), 139-146 (1994).
  52. Gallez, B., et al. Small particles of fusinite and carbohydrate chars coated with aqueous soluble polymers: preparation and applications for in vivo EPR oximetry. Magn Reson Med. 40 (1), 152-159 (1998).
  53. James, P. E., et al. Gloxy: An oxygen-sensitive coal for accurate measurement of low oxygen tensions in biological systems. Magn Reson Med. 38 (1), 48-58 (1997).
  54. Goda, F., et al. In vivo oximetry using EPR and India ink. Magn Reson Med. 33 (2), 237-245 (1995).
  55. Liu, K. J., et al. Lithium phthalocyanine: a probe for electron paramagnetic resonance oximetry in viable biological systems. Proc Natl Acad Sci. USA. 90 (12), 5438-5442 (1993).
  56. Ilangovan, G., Zweier, J. L., Kuppusamy, P. Mechanism of oxygen-induced EPR line broadening in lithium phthalocyanine microcrystals. J Magn Reason. 170 (1), 42-48 (2004).

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