Der Autor bedankt sich bei Frau Lora Matthews für die Durchführung der Technik und Herr Paul Shepherd für Kinematographie danken. Dieses Projekt wurde von der University of South Australia, Laboratoriumsmedizin Programm gefördert.

Vorbereitung von 5x Veronal Buffered Saline (VBS) <ol><li> Zur Vorbereitung der Veronal-gepufferte Kochsalzlösung (VBS), müssen drei separate Lösungen vorbereitet werden. </li><li> Bereiten Sie die Lösung 1 durch Auflösen 21.25gm von NaCl und 0.94gm von Sodium barbiturathaltiges Mittel in 350ml destilliertem Wasser. Die Endkonzentrationen von NaCl und Natrium barbiturathaltiges Mittel sind 1,02 M und 13mm bzw.. </li><li> Bereiten Sie die Lösung 2 durch Lösen 1.44gm von barbiturathaltiges Mittel in 125ml destilliertem Wasser heiß. Die Endkonzentration der barbiturathaltiges Mittel ist 62.5mm. </li><li> Bereiten Lösung 3 durch Auflösen 20.33gm von MgCl 2 und 4.41gm von CaCl 2 in 100 ml destilliertem Wasser. Die Endkonzentration von MgCl 2 und CaCl 2 ist 2,18 m und 440 jeweils. </li><li> Mix-Lösungen 1 und 2 und auf Raumtemperatur abkühlen. </li><li> Sobald die kombinierte Lösung abgekühlt ist, fügen Sie 1,25 ml der Lösung 3 und pH-Wert auf 7,3-7,5 mit 1 M HCl. </li><li> Passen Sie das endgültige Volumen auf 500 ml mit destilliertem Wasser auf einem 5-fach Stammlösung. </li><li> So bereiten Sie eine 1x funktionierende Lösung, verdünnte die Aktie im Verhältnis 1:5 mit destilliertem Wasser. </li></ol> Sensibilisierung von Schafs-Erythrozyten mit Hämolysin <ol><li> Bereiten Sie das Hämolysin, indem zunächst Verdünnung 1:50 mit VBS </li><li> Um 4 ml SRBC hinzufügen 6ml des VBS und vorsichtig durch Umdrehen mischen </li><li> Zentrifugation bei 600g x 5 Minuten </li><li> Überstand verwerfen und die Zellen weitere 2 Mal </li><li> Nach dem letzten Waschen Zentrifuge die Zellen bei 900g x 5 Minuten, um die Zellen-Pack </li><li> Überstand verwerfen und Zellen in ausreichender VBS zu einer 10% igen Lösung, dh 0,5 ml gepackte Zellen herzustellen, sind in 5 ml Puffer </li><li> Tropfenweise das gleiche Volumen von Hämolysin (Kaninchen Anti-Schaf-Erythrozyten-Antikörper), um die Zellen während wirbelnde kontinuierlich </li><li> Inkubation bei 30 ° C für 30 Minuten in einem Wasserbad </li><li> Vorsichtig mischen die Zellen alle 15 Minuten </li><li> Sensibilisiert SRBC kann über Nacht bei 4 ° C gelagert werden </li></ol> CH 50-Test <ol><li> Label eine Reihe von Röhren in zweifacher Ausfertigung mit 1:8, 1:16, 1:32, 1:64 und 1:128. </li><li> Bereiten Sie eine Reihe von zwei fache serielle Verdünnungen von Kontroll-und Test-Serum in VBS jeweils im Doppel </li><li> Start bei 1:4 (100ml Serum + 300ml VBS) und Transfer 200ml Probe in den nächsten markierten Röhre. </li><li> Nach gründlichem Mischen zwischen Verdünnungen und Transfer 200ml zum nächsten Verdünnung mit einer frischen Pipettenspitze. </li><li> Wiederholen, bis alle fünf Verdünnungen hergestellt werden. </li><li> Discard 200ml von der endgültigen 1:128 Verdünnung. </li><li> Add 200 ml suspendiert sensibilisiert SRBC allen Rohren. </li><li> Label zwei getrennten Röhren als BLANK und fügen 200ml sensibilisierter SRBC + 200ml VBS. Diese Rohre messen spontane Lyse der SRBC im VBS. </li><li> Label anderen zwei getrennten Röhren als TOTAL Lyse und fügen Sie 200 ml sensibilisiert SRBC + 200ml destilliertem Wasser. </li><li> Vorsichtig mischen allen Rohren. </li><li> Bei 37 ° C für 30 Minuten in einem Wasserbad Mischen nach 15 Minuten. </li><li> Zentrifugieren Sie die Proben bei 1.500 g für 5 Minuten in das Sediment des RBC. </li><li> Transfer 100ml Überstand aus jeder Röhre ein gut in einer 96-well ebenen Bodenplatte. </li><li> Add 100 ml destilliertem Wasser in jede Vertiefung. </li><li> Lesen Sie die Absorption der Proben bei 540 nm mit einer Platte Spektralphotometer. </li></ol> Berechnungen <ol><li> Berechnen Sie die mittlere Absorption für jede Probe </li><li> Subtrahieren Sie die BLANK Absorption (spontane Lyse) von allen Proben </li><li> Berechnen Sie den% Lyse für jede Verdünnung mit folgender Formel: <img src="/files/ftp_upload/1923/1923eq1.jpg" alt="Gleichung" /></li><li> Zeichnen Sie die prozentuale Lyse (vertikale Achse) gegen die Serumverdünnung auf der horizontalen Achse. </li><li> Berechnen Sie die Verwässerung für die 50% ige Hämolyse für die Steuerung und Testserum (Abb. 2) benötigt. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: Das Video enthält ein Beispiel für repräsentative Ergebnisse. In der Praxis wird ein Kontrollserum auch zur gleichen Zeit wie die Testserum geführt und ist in der gleichen Weise behandelt. Below (Tabelle 1) Sample-Daten aus einer getesteten Serumprobe. Die Daten werden nach der Gleichung in 5.3 vorgestellt manipuliert. <table border="1"><tbody><tr><td> Probe </td><td> OD 540 </td><td> Bedeuten </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Leer </td><td> 0,042, 0,044 </td><td> 0,043 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Insgesamt Lyse </td><td> 0,183, 0,183 </td><td> 0,183 </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="5"></td></tr><tr><td> Verdünnung </td><td> OD 540 </td><td> Bedeuten </td><td> Mean-Blank </td><td> % Lysis </td></tr><tr><td> 01.08 </td><td> 0,200, 0,219 </td><td> 0,210 </td><td> 0,168 </td><td> 116 </td></tr><tr><td> 01.16 </td><td> 0,179, 0,173 </td><td> 0,176 </td><td> 0,134 </td><td> 93 </td></tr><tr><td> 01.32 </td><td> 0,134, 0,110 </td><td> 0,122 </td><td> 0,08 </td><td> 55 </td></tr><tr><td> 1:64 </td><td> 0,053, 0,066 </td><td> 0,059 </td><td> 0,017 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> 1:128 </td><td> 0,044, 0,045 </td><td> 0,045 </td><td> 0,003 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table><img src="http://www.jove.com/files/ftp_upload/1923/1923fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Die Aktivierung des klassischen Komplementweges. Der klassische Weg wird durch die Bindung Immunglobulin-M (IgM) oder Immunglobulin-G (IgG) auf der Oberfläche einer Zielzelle aktiviert. Der Fc-Teil des Ab bindet C1q, ist C1r aktiviert und dies wiederum aktiviert ein anderes Molekül C1r die zusammen aktivieren zwei Moleküle C1s. C1s spaltet C4 nun die Bindungsstelle für C2, die ebenfalls gespalten wird entlarvt. Die Bindung von C4b und C2a führt zur Bildung eines Komplexes bezeichnet als C3-Konvertase. Dieser Komplex jetzt spaltet C3 bildet C3a und C3b, von denen einige mit dem C3-Konvertase Bildung einer C5 Konvertase kombinieren. Dieser Komplex wirkt nun auf C5, mit den daraus resultierenden C5b Bindung an C6 initiieren die Bildung der Membran-Angriffs-Komplex (MAC). C5b6 wirkt auf C7, was wiederum wirken auf C8 und letztlich auf C9, was zur Bildung des endgültigen MAC. (Goldsby et al, 2003). <img src="http://www.jove.com/files/ftp_upload/1923/1923fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Plotten von Sample-Daten und die Berechnung der CH50 für eine Steuer-und Testserumprobe. (A), sind die berechneten Prozentsatz (%) Lyse sowohl der Kontrollgruppe (•) und test () Serumproben gegen Verdünnungsfaktor aufgetragen. (B) Für die Berechnung der 50%-Lyse ist eine Linie von der 50% Prozent-Wert gezogen, bis sie mit dem Graphen Geraden schneidet und dann eine senkrechte Linie nach unten, um die Verdünnung gezogen. In diesem Beispiel werden ein 35-facher Verdünnung der Kontroll-und 21,6-fachen Verdünnung des Testserum verpflichtet, 50% Lyse zu erreichen. Diese Daten deuten darauf hin, dass es weniger Ergänzung im Testserum verglichen mit der Kontrollgruppe, da sie weniger Verdünnung erforderlich, bevor 50% Lyse wurde erreicht. Die Kontrollprobe zeigt auch&gt; 100% Lyse bei der 1:8 Verdünnung. Dies ist wahrscheinlich aufgrund von unvollständigen Lyse der SRBC durch das destillierte Wasser und effizientere Lyse durch den Komplement-Komponenten.

<ol>
	<li>Goldsby, R. A., Kindt, T. J., Osborne, B. A., Kuby, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunology. , (2003).</li></ol>

Die CH 50-Test unterliegt vielen Störungen. Einige SRBC sind empfindlicher als andere, was zu spontanen Hämolyse, die nicht mit Aktivitäten zu ergänzen ist. Die Affinität der Kaninchen-Antikörper variiert von Charge zu Charge und von einem Hersteller zum anderen, dies beeinflusst die Höhe des Antikörper, der an der SRBC bindet. Auch der Prozess der Sensibilisierung SRBC mit Antikörper Ergebnisse in Zellen mit unterschiedlichen Mengen der Antikörper-Beschichtung der SRBC. Gewinnung und Lagerung sind ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Sheep red blood cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CSL</td>
<td>2490201</td>
<td>Use at 1% final</td>
</tr>
<tr>
<td>Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Human serum</td>
</tr>
<tr>
<td>Rabbit Anti-Sheep Haemolytic serum (RBCs), Unconjugated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AdB Serotec</td>
<td>C12HSB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>96 well flat bottom plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>83.1839</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Veronal buffered saline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use at 1x final</td>
</tr>
<tr>
<td>Waterbath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plate reader</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>37&deg;C room/incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

measuring the 50% haemolytic complement (ch50) activity of serum

Das Komplementsystem ist eine Gruppe von Proteinen, die bei Aktivierung führen zu Zelllyse Ziel und erleichtert die Phagozytose durch Opsonisierung. Individuelle Komplement-Komponenten quantifiziert Dies bedeutet jedoch keine Auskunft über die Aktivität der Weg sein. Die CH<sub&gt; 50</sub&gt; Ist ein Screening-Test für die Aktivierung des klassischen Komplementweges (Abb. 1) und es ist empfindlich auf die Reduktion, Abwesenheit und / oder Untätigkeit eines jeden Teils des Weges. Die CH<sub&gt; 50</sub&gt; Tests die Funktionsfähigkeit des Serum-Komplement-Komponenten von den klassischen Weg, um rote Blutzellen von Schafen (SRBC) vorbeschichtet mit Kaninchen-Anti-Schaf-Erythrozyten-Antikörper (Hämolysin) zu lysieren. Als Antikörper-beschichteten SRBC mit Testserum, den klassischen Weg der Komplementaktivierung wird aktiviert und Hämolyse Ergebnisse inkubiert. Wenn ein Komplement-Komponente fehlt, wird der CH<sub&gt; 50</sub&gt; Ebene Null sein wird, wenn eine oder mehrere Komponenten des klassischen Weges sind zurückgegangen, die CH<sub&gt; 50</sub&gt; Verringert. Ein festes Volumen von optimal sensibilisiert SRBC wird jeder Serumverdünnung aufgenommen. Nach der Inkubation wird das Gemisch zentrifugiert und der Grad der Hämolyse wird durch Messung der Absorption des Hämoglobins in den Überstand bei 540 nm freigesetzt quantifiziert. Die Höhe der Komplement-Aktivität wird durch die Untersuchung die Fähigkeit der verschiedenen Verdünnungen der Test Serum-Antikörper beschichtet SRBC lysieren bestimmt. Dieses Video beschreibt die experimentellen Schritte bei der Analyse der Ebene der Komplement-Aktivität des klassischen Komplementweges beteiligt.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring the 50% Haemolytic Complement CH50 Activity of Serum at JoVE.com

Measuring the 50% Haemolytic Complement CH50 Activity of Serum

Der klassische Weg wird durch Antikörper aktiviert und gipfelt in Ziel-Zell-Lyse. Die CH<sub&gt; 50</sub&gt; Test liefert ein Maß für die Komplement-Aktivität einer Serumprobe. Dieses Video zeigt die Schritte bei der Bestimmung der CH beteiligt<sub&gt; 50</sub&gt; Einer Serumprobe, die Berechnungen und Interpretation der Ergebnisse.

Die Messung der 50% Hämolytische Complement (CH 50) Aktivität von Serum

The complement system is a group of proteins that when activated lead to target cell lysis and facilitates phagocytosis through opsonisation. Individual ...

measuring-the-50-haemolytic-complement-ch50-activity-of-serum

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring the 50% Haemolytic Complement (CH50) Activity of Serum

37.3K Aufrufe.  University of South Australia. Der klassische Weg wird durch Antikörper aktiviert und gipfelt in Ziel-Zell-Lyse. Die CH 50 Test liefert ein Maß für die Komplement-Aktivität einer Serumprobe. Dieses Video zeigt die Schritte bei der Bestimmung der CH beteiligt 50 Einer Serumprobe, die Berechnungen und Interpretation der Ergebnisse.