Sobald am siebten Tag rund 25 Millionen Mitochondrien-Spenderzellen gewonnen wurden, ernten Sie die exponentiell gewachsenen Zellen in einem 50-Milliliter-Röhrchen und sammeln Sie sie, indem Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur und 520 g zentrifugieren. Waschen Sie die Zellen mit kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung und sedimentieren Sie sie durch Zentrifugation bei Raumtemperatur in 520 g für fünf Minuten. Führen Sie nun die gesamte mitochondriale Extraktion bei vier Grad Celsius mit kalten Reagenzien durch und halten Sie die Zellen oder Mitochondrien auf Eis.
Nach der dritten Zentrifugation wird der Überstand durch Aspiration mit einer Glaspipette, die mit einer Vakuumpumpe gekoppelt ist, verworfen und die gepackten Zellen in einem Volumen hypotonen Puffers resuspendiert, das dem Siebenfachen des Zellpelletvolumens entspricht. Übertragen Sie dann die Zellsuspension in ein Homogenisatorröhrchen und lassen Sie die Zellen aufquellen, indem Sie sie zwei Minuten lang auf Eis inkubieren. Brechen Sie die Zellmembranen auf, indem Sie 8 bis 10 Hübe im Homogenisator ausführen, der mit einem motorbetriebenen Stößel gekoppelt ist, der sich mit 600 Umdrehungen pro Minute dreht.
Fügen Sie dem Zellhomogenat den hypotonen Puffer hinzu, der dem Siebenfachen des Volumens des ursprünglichen Pellets entspricht, um eine isotonische Umgebung zu erzeugen. Das Homogenat wird in ein 15-Milliliter-Röhrchen umgefüllt und in einem festen Rotor bei 1.000 g und vier Grad Celsius fünf Minuten lang zentrifugiert. Sammeln Sie dann nur 3/4 des Überstands, lassen Sie einen großen Rand vom Pellet, um eine Kontamination mit Zellkernen oder intakten Zellen zu vermeiden, und übertragen Sie es in ein anderes Röhrchen.
Nach zweimaliger Wiederholung des Vorgangs wird der Überstand mit der mitochondrialen Fraktion in 1,5-Milliliter-Röhrchen umgefüllt. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei einer maximalen Geschwindigkeit von 18.000 g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das mit Mitochondrien angereicherte Pellet mit Puffer A. Kombinieren Sie den Inhalt der beiden Röhrchen zu einem und zentrifugieren Sie wie zuvor gezeigt.
Wiederholen Sie den Vorgang, bis sich das gesamte Material in nur noch einem Röhrchen befindet. Waschen Sie das bei der letzten Zentrifugation gewonnene Pellet mit 300 Mikrolitern Puffer A. Quantifizieren Sie die mitochondriale Proteinkonzentration mit dem Bradford-Assay. Vor der Fusion mit der mitochondrialen Empfängerzelllinie wird die Abwesenheit von Zellkernkontaminanten in der mitochondrialen Fraktion durch Immundetektion von Kernproteinen untersucht.
Alternativ können Sie eine quantitative Polymerase-Kettenreaktion oder eine QPCR-Amplifikation eines Kerngens durchführen.
