Verwenden Sie für die transmitochondriale Cybriderzeugung die mitochondrialen Empfängerzellen, die durch die Behandlung mit Rhodamin 6G zu Mitochondrien depletiert wurden, und führen Sie eine Fusion mit Mitochondrien durch, die aus den Mitochondrien-Spenderzellen isoliert wurden. Stellen Sie sicher, dass die mitochondriale Funktion in den Empfängerzellen aufgehoben und die Organellen aus Spenderzellen gereinigt werden, indem Sie eine kleine Anzahl von mit Rhodamin 6G behandelten Zellen und isolierte Mitochondrien in vollständigem Nährmedium in einer Sechs-Well-Platte aussäen. Prüfen Sie, ob nach einem Monat der Kultur keine überlebenden Zellen mehr in den Vertiefungen vorhanden sind.
Um mit der Fusion fortzufahren, fügen Sie die mit Rhodamin 6G behandelten Zellen vorsichtig dem isolierten Mitochondrienpellet hinzu. Dann fünf Minuten lang bei 520 g zentrifugieren, damit sich die Zellen mit den Mitochondrien vermischen können. Fügen Sie 100 Mikroliter 50%iges Polyethylenglykol hinzu und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig für 30 Sekunden Dann lassen Sie die Suspension weitere 30 Sekunden unberührt ruhen.
Zum Schluss wird die Mischung in eine Sechs-Well-Platte mit frischem Zellkulturmedium überführt und bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid in den Inkubator gegeben. Normalerweise sollten transmitochondriale Cybriden nach etwa einer Woche zu wachsen beginnen, wodurch Klone entstehen, die vor ihrer Analyse einzeln ausgewählt oder in einem Pool gemischt werden können. Die Restriktionsfragmente, die aus der Analyse des Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) von Wildtyp-Mitochondrien gewonnen wurden, unterschieden sich von der Mutante.
Die RFLP-Analyse der neuen transmitochondrialen Zelllinien zeigte, dass die Restriktionsfragmente identisch mit denen waren, die sie in ihren jeweiligen mitochondrialen Spendern erhalten hatten, und sich von denen unterschieden, die mit den Empfängerzelllinien erzeugt wurden. Darüber hinaus könnte der Unterschied in einem typischen DNA-Kerngenotypisierungsprofil der beiden Zelllinien, die im Hybridisierungsprozess verwendet werden, auch genutzt werden, um die Reinheit der Kern-DNA zu bestätigen.
