Um mit der Zugabe des primären Antikörpers zu beginnen, aspirieren Sie das Rinderserumalbumin oder BSA aus den fixierten und blockierten transfizierten HeLa-Zellen und lassen Sie 10 Mikroliter BSA-Lösung in der Vertiefung. Dann 10 Mikroliter der in 3%BSA hergestellten primären Antikörperlösung in PBS zugeben und die Platte im Dunkeln bei vier Grad Celsius über Nacht inkubieren. Nach der Inkubation jeden Brunnen viermal mit 100 Mikrolitern PBS ausspülen, wobei nach dem letzten Waschen 10 Mikroliter übrig bleiben.
Als nächstes werden 10 Mikroliter sekundäre Antikörperlösung auf die 384-Well-Platte gegeben. Verwenden Sie isotypspezifische Antikörper, die an Fluorochrome konjugiert sind, wie z. B. Alexa Fluor 488 und Alexa Fluor 555. Nachdem Sie die Platte eine Stunde lang im Dunkeln inkubiert haben, spülen Sie jede Vertiefung viermal mit 100 Mikrolitern PBS aus und lassen Sie nach dem letzten Waschgang 50 Mikroliter PBS in der Vertiefung.
Die Verwendung von Anti-DNA-Antikörpern ermöglichte es, die mitochondriale DNA-Verteilung in der Zelle unter den gegebenen experimentellen Bedingungen zu überwachen. Die Herunterregulierung des mitochondrialen Transkriptionsfaktors A TFAM führte zu drastischen Veränderungen in der mitochondrialen DNA-Verteilung mit weniger mitochondrialen DNA-Spots als in Kontrollzellen. Die Quantifizierung des mittleren Fluoreszenzsignals des Anti-DNA-Antikörpers zeigte einen mehrfachen Anstieg nach TFAM-Silencing im Vergleich zu den anderen getesteten Bedingungen.
