Schalten Sie das konfokale Laserscanning-Mikroskop ein und legen Sie den Objektträger auf den Objektträgerhalter. Wählen Sie für die Bildvisualisierung und -aufnahme das 20-fache Objektiv. Wählen Sie in der konfokalen Software den sequentiellen Scan-Modus, um ein Übersprechen zwischen dem BODIPY 493/503 und dem DAPI zu vermeiden.
Anschließend wird der BODIPY 493/503 Die mit der 488 Nanometer Argon Laserlinie und die DAPI mit der 405 Nanometer Laserlinie anregt. Legen Sie die Emissionsbereiche auf 493 bis 589 Nanometer für BODIPY und 410 bis 464 Nanometer für DAPI fest. Konfigurieren Sie als Nächstes die Mikroskopeinstellungen, indem Sie die Bildgrößen, die Scangeschwindigkeit und die Mittelwertbildung anpassen, einschließlich der zweifachen Bittiefe von 12 Bit, der Richtung als bidirektional, des Digitalzooms des Scanbereichs minus eins und der Lochblende von einer Bereichseinheit.
Passen Sie die Einstellungen für Verstärkung und digitale Verstärkung an. Stellen Sie sicher, dass keine gesättigten Pixel vorhanden sind, wie durch die Bereichsanzeige angezeigt. Nachdem Sie die Lipidtröpfchen genau identifiziert haben, nehmen Sie das Bild mit den BODIPY- und DAPI-Kanälen auf.
Um Weitbereichsbilder zu erstellen, wechseln Sie zu einem subjektiven 10-fachen Objektiv. Aktivieren Sie dann den Kachelscanmodus und konfigurieren Sie ihn so, dass fünf mal fünf Mosaikbilder generiert werden. Um 3D- und orthogonale Ansichten zu erzeugen, tragen Sie einen Tropfen Immersionsöl auf die Oberseite des Deckglases auf und tauschen Sie das Objektiv gegen ein 40-faches Objektiv aus.
Wählen Sie den Z-Stapel-Modus aus. Passen Sie die Z-Ebene an, um die erste und letzte Position für die Bildaufnahme zu definieren, und stellen Sie eine optische Schichtdicke von ca. 0,5 Mikrometern sicher, um alle Tröpfchen im Fokus zu erfassen. Wählen Sie das Orthomodul aus, und erstellen Sie orthogonale Ansichten.
Erfassen Sie 3D-Bilder, indem Sie das 3D-Modul nach dem Transparenz-Rendering-Modus auswählen. Beginnen Sie nach der Bildaufnahme mit der Verarbeitung und Analyse von Einzelebenenbildern mit CellProfiler. Laden Sie die Bilder im TIF-Format hoch, indem Sie auf den Bildmodus in der oberen linken Ecke der CellProfiler-Oberfläche klicken.
Verwenden Sie das Modul names and types, um basierend auf den Dateinamen zwischen BODIPY-Tröpfchen- und DAPI-Kern-gefärbten Bildern zu sortieren. Verwenden Sie für die Analyse von Lipidtröpfchen nur BODIPY-gefärbte Bilder. Starten Sie die Rohrleitungskonstruktion, indem Sie auf Module anpassen klicken und das Modul Farbe in Grau auswählen, um die Bilder in Graustufen umzuwandeln.
Definieren Sie dann mit dem Modul "Primärobjekte identifizieren" Lipidtröpfchen zwischen 6 und 300 Pixeln und einem Schwellenwertkorrekturfaktor von eins, um Lipidtröpfchen in den Graustufenbildern zu erkennen. Um die Pixelintensität der identifizierten Lipidtröpfchen zu messen, fügen Sie ein Modul zum Messen der Objektintensität hinzu. Integrieren Sie ein zusätzliches Modul für Filterobjekte, um sicherzustellen, dass nur die stärksten Signale quantifiziert werden, während weniger intensive Signale von der abschließenden Lipidtröpfchenanalyse ausgeschlossen werden.
Um als Nächstes die Lipidtröpfchen zu messen, die sich auf die Ausgabedaten beziehen, fügen Sie das Formmodul zum Messen der Objektgröße hinzu. Fügen Sie dann ein Overlay-Outlines-Modul hinzu, um das identifizierte Tröpfchen über das Originalbild zu legen und so sicherzustellen, dass die Segmentierung auch auf dem unverarbeiteten Bild korrekt aussieht. Wenn Sie fertig sind, fügen Sie einen Export in ein Tabellenkalkulationsmodul hinzu und klicken Sie auf die Schaltfläche Bilder analysieren in der unteren linken Ecke.
Im Vergleich zur Kontrolle wiesen die mit HFD gefütterten Tiere ein ausgeprägtes dyslipidämisches Profil und einen subtilen Anstieg der zirkulierenden Triglyceridspiegel auf. Großflächige Bilder zeigten erhöhte Lipidtröpfchen in der Leber von Tieren, die mit HFD gefüttert wurden. Die Analyse mit CellProfiler ergab eine erhöhte Anzahl von hepatischen Lipidtröpfchen, eine erhöhte BODIPY-Fluoreszenzintensität, ein Flächenverhältnis von 360 % und größere Durchmesser.
Die Größenverteilung bei HFD-gefütterten Tieren zeigte eine Zunahme der makrovesikulären hepatischen Lipidtröpfchen um mehr als neun Mikrometer und eine Verringerung der Mikrovesikel um weniger als drei Mikrometer.
