Diese Forschung wurde aus nationalen und europäischen Mitteln über die portugiesische Wissenschafts- und Technologiestiftung (FCT), den Europäischen Fonds für regionale Entwicklung (FEDER) und das Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE) finanziert: 2020.09481.BD, UIDP/04539/2020 (CIBB) und POCI-01-0145-FEDER-007440. Die Autoren bedanken sich für die Unterstützung von iLAB - Microscopy and Bioimaging Lab, einer Einrichtung der Medizinischen Fakultät der Universität Coimbra und Mitglied der nationalen Infrastruktur PPBI-Portuguese Platform of BioImaging (POCI-01-0145-FEDER-022122), sowie für die Unterstützung von FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142.

Alle in dieser Studie durchgeführten Tierversuche wurden von der Tierschutzbehörde des Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR) (ORBEA, #9/2018) genehmigt und entsprachen den nationalen und europäischen Richtlinien für die Tierpflege sowie den ARRIVE-Richtlinien.
1. Versuchsplanung
<ol><li>Paarhaltung von 13 Wochen alten männlichen Wistar-Ratten in belüfteten Käfigen unter kontrollierten Umgebungsbedingungen von Temperatur (22 °C ± 1 °C), Luftfeuchtigkeit (50%-60%) und Licht (12 h Hell-Dunkel-Zyklus) und mit Ad-libitum-Zugang zu Leitungswasser und Standard-Nagetierfutter.</li>
	<li>Nach einer 2-wöchigen Eingewöhnungsphase werden die Ratten willkürlich in zwei Gruppen eingeteilt.</li>
	<li>Füttern Sie die Kontrollgruppe (CTRL, n = 6) und die fettreiche Diätgruppe (HFD, n = 6) 24 Wochen lang mit Standardfutter bzw. einer fettreichen Diät (45 % kcal/Fett).</li>
	<li>Überwachen Sie wöchentlich das Körpergewicht (BW). Erfassen Sie den täglichen Verzehr von Speisen und Getränken pro Käfig.</li>
</ol>2. Vorbereitung der Leberprobe
<ol><li>Leberdissektion<ol><li>Peristaltikpumpe vorbereiten: 70%iges Ethanol durch den Schlauch laufen lassen, eine 27-G-Nadel an das Auslassende des Schlauchs anschließen und den Schlauch mit eiskalter (4 °C) 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH ~7,4) ansaugen (z. B. 200 U/min an einer Peristaltikpumpe mit 1,6 mm Innendurchmesser Silikonschlauch, IV-Mini-Tropfset). Passen Sie das Körpergewicht an (z. B. verwenden Sie für eine 100-150 g schwere Ratte eine Flussrate von ca. 10-12 ml/min).</li>
		<li>Die Ratte wird durch eine intraperitoneale Injektion unter Verwendung eines Anästhesieprotokolls betäubt (die Endkonzentration von Ketamin = 75 mg/kg und die Endkonzentration von Medetomidin = 1 mg/kg). Anmerkungen: Stellen Sie sicher, dass die Ratte mit der Zehenquetschmethode vollständig betäubt ist.</li>
		<li>Legen Sie die Ratte auf das Seziertablett.</li>
		<li>Desinfizieren Sie das Fell gründlich mit 70% Ethanol und trocknen Sie es mit einem Papiertuch.</li>
		<li>Machen Sie mit einer Schere einen U-förmigen Schnitt durch die Haut und schneiden Sie unterhalb des Zwerchfells auf. Schneiden Sie dann den Brustkorb an den Rändern rostal durch, um das Herz freizulegen.</li>
		<li>Während das 1x PBS läuft, führen Sie die Nadel durch die linke Herzkammer in die aufsteigende Aorta und klemmen Sie sie ab. Dann wird der rechte Vorhof geschnitten, um eine Drainage zu ermöglichen, sobald die Durchblutung begonnen hat. Anmerkungen: Die Leber sollte anfangen zu blanchieren, wenn das Blut durch PBS ersetzt wird.</li>
		<li>Entfernen Sie die Leber vorsichtig mit einer Schere und einer Dumont-Pinzette und spülen Sie sie mit 1x PBS ab.</li>
		<li>Übertragen Sie die Leber auf eine Petrischale und wiegen Sie sie.</li>
		<li>Sammeln Sie mit einem Skalpell 5 mm dicke Lebergewebeproben von der lateralen Seite (1 cm vom Rand entfernt) des linken Leberlappens für den Einbettungsprozess. HINWEIS Das restliche Gewebe kann zur Langzeitlagerung bei −80 °C gelagert werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Einbettung von Lebergewebe<ol><li>Bereiten Sie einen Trockeneisbehälter vor und beschriften Sie die Kryoformen ordnungsgemäß mit der Proben-ID und -ausrichtung.</li>
		<li>Geben Sie ein paar Tropfen der Kryo-Einbettungsmatrix auf die Mitte des Kryomolds, um die optimale Schnitttemperatur (OCT) zu erreichen.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass die Gewebeprobe für einen Querschnitt richtig ausgerichtet ist. Anmerkungen: Stellen Sie sicher, dass die Seite, die den Boden des Kryofolds berührt, die Seite ist, die zuerst geschnitten wird.</li>
		<li>Geben Sie vorsichtig mehr OCT auf das Kryomold, bis es vollständig bedeckt ist. Versuchen Sie, die Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Entfernen Sie bei Bedarf mit einer einfachen Pinzette alle Blasen im OCT.</li>
		<li>Legen Sie das Kryomold mit der OCT-bedeckten Probe schnell in einen Trockeneisbehälter. HINWEIS: Die Gewebe können 3 Jahre bei −80 °C gelagert werden.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Schnitt von gefrorenem Gewebe
<ol><li>Stellen Sie die Kryostattemperatur ein (Kammer: −21 °C; Probe: −18 °C) und setzen Sie eine neue sterile Klinge ein.</li>
	<li>Legen Sie die Proben für 30 Minuten in den Kryostaten, bevor Sie die Temperatur ausgleichen lassen.</li>
	<li>Machen Sie eine einzelne Schicht OCT auf der Probenscheibe, um die Haftung der Probe zu ermöglichen. Lassen Sie das OCT einfrieren und montieren Sie die Gewebeprobe in der gewünschten Ausrichtung. Anmerkungen: Die Schnittfläche sollte parallel zur Klinge sein. Um eine gute Haftung zu gewährleisten, platzieren Sie den Wärmeabsauger auf der Oberseite der Probe. Die vorherigen Schritte können auch in einem Trockeneisbehälter mit Trockeneis durchgeführt werden.</li>
	<li>Legen Sie die Probe in den Probenkopf und schneiden Sie die Oberfläche des Gewebes ab (einige 30 μm große Gewebeprobenabschnitte).</li>
	<li>Sobald der interessierende Bereich für die Schnitterstellung zugänglich ist, schneiden Sie 12 μm dicke Schnitte und legen Sie sie auf beschriftete Objektträger, die bei Raumtemperatur (RT) aufbewahrt werden. Anmerkungen: Um den Schnitt zu entnehmen, bewegen Sie den Objektträger langsam in Richtung des Gewebeschnitts. Auf jedem Objektträger können zwei Leberabschnitte gesammelt werden.</li>
	<li>Lassen Sie die Objektträger 10 Minuten bei RT trocknen. HINWEIS: Die Objektträger können 6-12 Monate bei −20 °C oder bis zu 3 Jahre bei −80 °C gelagert werden.</li>
</ol>4. BODIPY-Färbung
<ol><li>Tauen Sie die Objektträger in einem Objektträgerfärbesystem bei RT für 30 Minuten auf.</li>
	<li>Mit 1x PBS waschen (je 3x für je 5 min).</li>
	<li>Umkreisen Sie den Abschnitt mit einer hydrophoben Schicht und verwenden Sie einen Barrierestift.</li>
	<li>500 μg/ml BODIPY 493/503 Stammlösung herstellen: 1 mg BODIPY 493/503 in 2 ml Lösungsmittel (90 % DMSO; 10 % 1x PBS) auflösen. Vor Licht schützen. Beschallung im Ultraschallbad für 1 h (9,5-10 W) bei 37 °C. Anmerkungen: Die Lösung kann mindestens 30 Tage bei −20 °C gelagert werden.</li>
	<li>Bereiten Sie die BODIPY-Färbelösung (1 μg/ml) vor, indem Sie 2 μl BODIPY 493/503-Stammlösung und 0,1 μl DAPI-Stammlösung (5 mg/ml) zu 997,9 μl 1x PBS hinzufügen.</li>
	<li>Die Objektträger (75 μl/Objektträger) werden mit BODIPY 493/503 (1 μg/ml) und DAPI (0,1 μg/ml) bei RT für 40 min inkubiert. HINWEIS: Halten Sie die Folien ab diesem Schritt im Dunkeln.</li>
	<li>Waschen Sie die Objektträger mit 1x PBS (3x für je 5 min).</li>
	<li>Fixieren Sie die Objektträger mit Deckgläsern mit einem Fluoreszenz-Eindeckmedium, lassen Sie sie 30 Minuten trocknen und versiegeln Sie sie mit Nagellack. HINWEIS: Die Objektträger können bis zur Belichtung bei 4 °C gelagert werden.</li>
</ol>5. Quantifizierung der Lipide
<ol><li>Messen Sie den Gesamtcholesterin- und TG-Spiegel im Serum mit einer automatischen, validierten Methode und Ausrüstung.</li>
	<li>Messen Sie die hepatischen TG-Spiegel mit einem kolorimetrischen Triglycerid-Assay-Kit (Table of Materials) gemäß dem Protokoll des Herstellers.</li>
</ol>6. Bildaufnahme
<ol><li>Legen Sie den Objektträger auf den konfokalen Laserscanning-Objektträgerhalter.</li>
	<li>Verwenden Sie für die Bildvisualisierung und -aufnahme ein konfokales Mikroskop mit einer 20-fach-Objektivlinse (Plan-Apochromat: 20-fach/0,8).</li>
	<li>Um ein Übersprechen zwischen dem BODIPY 493/503 und dem DAPI zu vermeiden, verwenden Sie den sequenziellen Scan-Modus (bestes Signal) in der konfokalen Software.</li>
	<li>Anregen Sie den BODIPY 593/503 mit der 488 nm Argon-Laserlinie und den DAPI mit der 405 nm Laserlinie. Stellen Sie die Emissionsbereiche auf 493-589 nm für BODIPY 493/503 und auf 410-464 nm für DAPI ein.</li>
	<li>Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: Lochblende: 1 AE, Auflösung: 1.024 Pixel x 1.024 Pixel, Bittiefe: 12, Pixelgröße: 0,415 μm, bidirektionaler Modus, Scangeschwindigkeit: 7 (~1,58 μs/Pixel für ein 20-faches Objektiv), Zeilenmittelung: 2x und Digitalzoom: 1. HINWEIS: Die oben genannten Scanparameter müssen für jedes verwendete konfokale Mikroskop und Objektiv optimiert werden.</li>
	<li>Stellen Sie die Verstärkung und die digitale Verstärkung so ein, dass keine gesättigten Pixel auf der Entfernungsanzeige erkannt werden. HINWEIS: Korrigieren Sie das Hintergrundsignal, indem Sie den Offset anpassen.</li>
	<li>Sobald die LDs korrekt identifiziert sind, nehmen Sie das Bild mit den BODIPY- und DAPI-Kanälen auf. HINWEIS: Alle Bilder müssen unter den gleichen Bedingungen (Belichtung und allgemeine Einstellungen) für jeden Farbkanal aufgenommen werden.</li>
	<li>Um großflächige Bilder zu erstellen (Abbildung 2), wechseln Sie das Objektiv zu einer 10-fach-Objektivlinse (Plan-Neofluar: 10-fach/0,3).</li>
	<li>Wählen Sie den Kachelscan-Modus und erstellen Sie Mosaike aus 5 pro 5 Bildern. HINWEIS: In dieser Arbeit hatte jede Kachel eine Überlappung von 10 %, um die Kacheln für die Analyse angemessen zusammenzuführen.</li>
	<li>Um 3D- und orthogonale Ansichten zu erstellen (Abbildung 3A), geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf die Oberseite des Deckglases und tauschen Sie das Objektiv gegen eine 40-fache Objektivlinse aus (plan-neofluar: 40-fach/1,30 Öl).</li>
	<li>Wählen Sie den Z-Stack-Modus und definieren Sie durch Anpassen der Z-Ebene die erste und letzte Position für die Erfassung mit einer optischen Schicht mit einer optimalen Dicke (~0,5 μm), um sicherzustellen, dass alle Tröpfchen erfasst werden. HINWEIS: Um die Bildaufnahme zu beschleunigen und ein Ausbleichen zu vermeiden, kann der optische Schnitt auf eine suboptimale Größe eingestellt werden, um ein Oversampling von mindestens 30 % für eine gute 3D-Rekonstruktion zu gewährleisten.</li>
	<li>Wählen Sie das Modul Ortho aus, und erstellen Sie orthogonale Ansichten.</li>
	<li>Erfassen Sie 3D-Bilder, indem Sie das 3D-Modul nach dem Transparenz-Rendering-Modus mit der konfokalen Mikroskop-Software auswählen.</li>
</ol>7. Analyse von Bildern
<ol><li>Verarbeiten und analysieren Sie die Einzelebenenbilder (20-fache Vergrößerung) mit CellProfiler (Version 4.2.5). HINWEIS: Die in dieser Arbeit verwendete Pipeline wurde von Adomshick et al.45. Der Teufel</li>
	<li>Klicken Sie auf das Modul Bilder in der oberen linken Ecke des CellProfiler-Fensters und laden Sie die Bilder als .tiff Dateien hoch.</li>
	<li>Verwenden Sie das NamesAndTypes-Modul , um basierend auf den Dateinamen zwischen BODIPY- (Tröpfchen) und DAPI- (Kernen) gefärbten Bildern zu sortieren. Führen Sie die LD-Analyse nur mit BODIPY-gefärbten Bildern durch.</li>
	<li>Um die Pipeline-Konstruktion zu starten, klicken Sie auf Module anpassen und wählen Sie das Modul ColorToGray aus, um die Bilder in Graustufenbilder zu konvertieren. HINWEIS: Zur Identifizierung von Objekten sind Graustufenbilder erforderlich.</li>
	<li>Identifizieren Sie Tröpfchen, indem Sie das IdentifyPrimaryObjects-Modul mithilfe des Graustufenbilds verwenden. HINWEIS: Die Parameter in diesem Modul müssen angepasst werden, um eine gute LD-Identifizierung zu erreichen. In dieser Arbeit führte die Definition von LDs mit einer Größe zwischen 6 Pixeln und 300 Pixeln und einem Schwellenwertkorrekturfaktor von 1,0 zur genauesten Identifizierung.</li>
	<li>Um die Pixelintensität der identifizierten Lipidtröpfchen zu messen, fügen Sie ein MeasureObjectIntensity-Modul hinzu.</li>
	<li>Fügen Sie ein zusätzliches FilterObjects-Modul hinzu, um sicherzustellen, dass nur die stärksten Signale quantifiziert werden, während weniger intensive Signale von der abschließenden Lipidtröpfchenanalyse ausgeschlossen werden (minimale Intensität: 0,15; maximale Intensität: 1 beliebige Einheit).</li>
	<li>Um die LDs zu messen, die sich auf die Ausgabedaten beziehen, fügen Sie das Modul MeasureObjectSizeShape hinzu.</li>
	<li>Fügen Sie an dieser Stelle ein OverlayOutlines-Modul hinzu, um das identifizierte Tröpfchen über das Originalbild zu legen und so sicherzustellen, dass die Segmentierung auch auf dem unverarbeiteten Bild korrekt aussieht. HINWEIS: Dies ist ein optionaler Schritt (Qualitätskontrolle).</li>
	<li>Fügen Sie am Ende ein ExportToSpreadsheet-Modul hinzu und klicken Sie auf die Schaltfläche Bilder analysieren in der unteren linken Ecke.</li>
</ol>8. Statistische Analyse
<ol><li>Drücken Sie die Ergebnisse als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (S.E.M.) mit einer beliebigen Software für die statistische Analyse aus. HINWEIS: In dieser Studie wurde die GraphPad-Software für die statistische Analyse verwendet.</li>
	<li>Analysieren Sie die Verteilung der Werte mit dem Kolmogorov-Smirnov-Test, um signifikante Abweichungen von der Normalverteilung zu bewerten. Analysieren Sie die parametrischen Daten mit dem ungepaarten t-Test des Schülers. HINWEIS: Werte von p < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.</li>
</ol>

Beurteilung der Lebersteatose mit 3D-Fluoreszenz-Lipidtröpfchen-Rekonstruktion

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Dieses BODIPY 493/503 Fluoreszenz-basierte Protokoll zur LD-Beurteilung zielte darauf ab, einen neuen Bildgebungsansatz für die Beurteilung der hepatischen Steatose zu entwickeln. Aufgrund des starken Zusammenhangs zwischen Adipositas und Fettlebererkrankungen wurde die fettreiche Diät nach westlichem Vorbild verwendet, um ein Tiermodell der Lebersteatose zu etablieren26. Ein robuster Anstieg der hepatischen TG-Gehalte wurde durch ein quantitatives kolorimetrisches Triglycerid-Assay-Kit bestäti...

Lipidtröpfchen (LDs), die klassischerweise als Energiedepots angesehen werden, sind spezialisierte Zellorganellen, die die Lipidspeicherung vermitteln, und sie bestehen aus einem hydrophoben neutralen Lipidkern, der hauptsächlich Cholesterinester und Triglyceride (TGs) enthält und von einer Phospholipid-Monoschicht eingekapselt ist 1,2,3.
Die LD-Biogenese findet im endoplasmatischen Retikulum (ER) statt, beginnend mit der Synthese von Triacylglycerin (TAG) und Sterolestern. Neutrale Lipide diffundieren in geringen Konzentrationen zwischen den Segeln der ER-Doppelschicht, verschmelzen aber zu Öllinsen, die wachsen und zu fast kugelförmigen Tröpfchen aus der ER-Membran austreiben, wenn ihre intrazelluläre Konzentration steigt4. Anschließend translozieren Proteine aus der ER-Doppelschicht und dem Zytosol, insbesondere die Perilipin (PLIN)-Proteinfamilie, auf die Oberflächen der LDs, um die Knospung zu erleichtern 5,6,7,8,9.
Durch die Synthese neuer Fettsäuren und die Fusion oder Koaleszenz von LDs wachsen LDs in unterschiedliche Größen heran. Dementsprechend unterscheiden sich Größe und Anzahl der LDs zwischen den verschiedenen Zelltypen erheblich. Kleine Tröpfchen (300-800 nm Durchmesser), die als initiale LDs (iLDs) bezeichnet werden, können von fast allen Zellen gebildet werden4. Später in der LD-Bildung sind die meisten Zellen in der Lage, einige iLDs in größere, expandierende LDs (eLDs >1 μm Durchmesser) umzuwandeln. Doch nur bestimmte Zelltypen, wie Adipozyten und Hepatozyten, haben die Fähigkeit, riesige oder übergroße LDs (bis zu zehn Mikrometer im Durchmesser) zu bilden4,10.
LDs spielen eine sehr wichtige Rolle bei der Regulierung des zellulären Fettstoffwechsels, der Unterdrückung der Lipotoxizität und der Verhinderung von ER-Stress, mitochondrialer Dysfunktion und letztendlich des Zelltods, der durch freie Fettsäuren (FAs) verursacht wird11,12,13,14. Darüber hinaus sind LDs auch an der Regulation der Genexpression, der Sequestrierung von viralen Replikationsproteinen sowie des Membrantransports und der Signalübertragung beteiligt15,16,17. Daher ist die Fehlregulation der LD-Biogenese ein Kennzeichen chronischer Krankheiten, die mit metabolischem Syndrom, Adipositas, Typ-2-Diabetes mellitus (T2DM) und/oder Arteriosklerose, um nur einige zu nennen, assoziiert sind18,19,20.
Die Leber als Stoffwechselknotenpunkt ist hauptsächlich für den Fettstoffwechsel verantwortlich, indem sie Lipide speichert und verarbeitet, und ist daher ständig von Fettotoxizität bedroht21. Die hepatische Steatose (HS) ist ein häufiges Merkmal einer Reihe von fortschreitenden Lebererkrankungen und ist gekennzeichnet durch eine übermäßige intrazelluläre Lipidakkumulation in Form von zytosolischen LDs, die letztendlich zu Stoffwechselstörungen der Leber, Entzündungen und fortgeschrittenen Formen der nichtalkoholischen Fettlebererkrankung führen können22,23,24,25. HS tritt auf, wenn die Rate der Fettsäureoxidation und des Exports als Triglyceride innerhalb von Lipoproteinen sehr niedriger Dichte (VLDLs) niedriger ist als die Rate der hepatischen Fettsäureaufnahme aus dem Plasma und der de novo Fettsäuresynthese26. Die hepatische Akkumulation von Lipiden tritt häufig in zwei Formen auf - mikrovesikuläre und makrovesikuläre Steatose -, und diese weisen unterschiedliche zytoarchitektonische Merkmale auf27. Typischerweise ist die mikrovesikuläre Steatose durch das Vorhandensein kleiner LDs gekennzeichnet, die über die gesamte Hepatozyten verteilt sind und deren Kern zentral platziert ist, während die makrovesikuläre Steatose durch das Vorhandensein einer einzigen großen LD gekennzeichnet ist, die den größten Teil der Hepatozyten einnimmt und den Kern in die Peripherie drückt28,29. Bemerkenswert ist, dass diese beiden Arten der Steatose oft zusammen gefunden werden, und es bleibt unklar, wie diese beiden LD-Muster die Krankheitspathogenese beeinflussen, da die Evidenz immer noch uneinheitlich ist31,32,33,34. Diese Art der Analyse wird jedoch häufig als "Referenzstandard" in präklinischen und klinischen Studien verwendet, um das dynamische Verhalten von LDs zu verstehen und die hepatische Steatose zu charakterisieren 29,34,35,36.
Leberbiopsien, der Goldstandard für die Diagnose und Einstufung von HS, werden routinemäßig durch histologische Hämatoxylin- und Eosinanalysen (H&E) beurteilt, bei denen Lipidtröpfchen als ungefärbte Vakuolen in H&E-gefärbten Leberschnitten ausgewertet werden37. Diese Art der Färbung ist zwar für die Beurteilung der makrovesikulären Steatose akzeptabel, schränkt aber im Allgemeinen die Beurteilung der mikrovesikulären Steatoseein 38. Fettlösliche Diazofarbstoffe, wie z. B. Oil Red O (ORO), werden klassischerweise mit der Hellfeldmikroskopie kombiniert, um intrazelluläre Lipidspeicher zu analysieren, aber diese haben immer noch eine Reihe von Nachteilen: (i) die Verwendung von Ethanol oder Isopropanol im Färbeprozess, was häufig zur Störung der nativen LDs und gelegentlich zur Fusion führt, obwohl die Zellen fixiert sind39; (ii) die zeitaufwändige Natur, da die ORO-Lösung aufgrund der begrenzten Haltbarkeit frisches Pulver auflöst und filtriert, was zu weniger konsistenten Ergebnissen beiträgt; (iii) und die Tatsache, dass ORO mehr als nur Lipidtröpfchen färbt und die hepatische Steatose oft überschätzt38.
Folglich wurden zelldurchlässige lipophile Fluorophore, wie z. B. Nilrot, entweder in lebenden oder fixierten Proben verwendet, um einige der oben genannten Einschränkungen zu überwinden. Die unspezifische Natur der Markierung zellulärer Lipidorganellen schränkt die LD-Bewertungen jedoch immer wieder ein40. Darüber hinaus variieren die spektralen Eigenschaften von Nilrot je nach Polarität der Umgebung, was häufig zu spektralen Verschiebungen führen kann41.
Die lipophile Fluoreszenzsonde 1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-bora-3a,4adiaza-s-indacen (Anregungswellenlänge: 480 nm; Emissionsmaximum: 515 nm; BODIPY 493/503) weist hydrophobe Eigenschaften auf, die eine schnelle Aufnahme durch intrazelluläre LDs ermöglichen, akkumuliert sich im Lipidtröpfchenkern und emittiert anschließend hellgrüne Fluoreszenz12. Im Gegensatz zu Nilrot ist BODIPY 493/503 unempfindlich gegenüber der Polarität der Umgebung und hat sich als selektiver erwiesen, da es eine hohe Helligkeit für die LD-Bildgebung aufweist. Um neutrale LDs zu färben, kann dieser Farbstoff in lebenden oder fixierten Zellen verwendet und erfolgreich mit anderen Färbe- und/oder Markierungsmethoden gekoppelt werden42. Ein weiterer Vorteil des Farbstoffs besteht darin, dass er wenig Kraftaufwand erfordert, um ihn in eine Lösung zu geben, und stabil ist, so dass er nicht für jedes Experiment neu vorbereitet werden muss42. Obwohl die Sonde BODIPY 493/503 erfolgreich eingesetzt wurde, um die Lokalisation und Dynamik von LDs in Zellkulturen zu visualisieren, haben einige Berichte auch die zuverlässige Verwendung dieses Farbstoffs als LD-Bildgebungswerkzeug in Geweben wie dem menschlichen Musculus vastus lateralis43, dem Musculus soleus 42 der Ratte42 und dem Darmder Maus 44 gezeigt.
In dieser Arbeit schlagen wir ein optimiertes BODIPY 493/503-basiertes Protokoll als alternativen analytischen Ansatz für die Bewertung der LD-Anzahl, -Fläche und des LD-Durchmessers in Leberproben aus einem Tiermodell der hepatischen Steatose vor. Dieses Verfahren umfasst die Vorbereitung von Leberproben, die Gewebeschnitte, die Färbebedingungen, die Bildaufnahme und die Datenanalyse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Lyon, France</td>
			<td>D3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>10191455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Illustrator CC</td>
			<td>Adobe Inc.</td>
			<td>Used to design the figures</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic analyzer Hitachi 717</td>
			<td>Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany</td>
			<td>8177-30-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barrier pen (Liquid blocker super pap pen)</td>
			<td>Daido Sangyo Co., Ltd, Japon</td>
			<td>_</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade</td>
			<td>Leica</td>
			<td>221052145</td>
			<td>Used in the cryostat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Profiler version 4.2.5</td>
			<td>https://cellprofiler.org/releases/</td>
			<td>Used to analyse the acquired images</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Menzel-Glaser, Germany</td>
			<td>_</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>_</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>_</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Lyon, France</td>
			<td>D-8418</td>
			<td>Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic 
			and flammable. Vapors may cause 
			irritation. Manipulate in a fume 
			hood. Avoid direct contact with skin. 
			Wear rubber gloves, protective eye 
			goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice container (styrofoam cooler)</td>
			<td>Novolab</td>
			<td>A26742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>Fine Science Tools, Germany</td>
			<td>11295-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dish (H 25 mm, &#248; 
			150 mm)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td>Used to weigh the liver after dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycergel</td>
			<td>DAKO Omnis</td>
			<td>S303023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism software, version 9.3.1</td>
			<td>GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-fat diet</td>
			<td>Envigo, Barcelona, Spain</td>
			<td>MD.08811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Nimatek&#160; 100 mg/mL)</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>791/01/14DFVPT</td>
			<td>Used at a final concentration of 75 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope&#160; (QUASAR detection unit; )</td>
			<td>Carl Zeiss, germany</td>
			<td>LSM 710 Axio Observer Z1 microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine (Sedator 1 mg/mL)</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>1838 ESP / 020/01/07RFVPT</td>
			<td>Used at a final concentration of 1 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>BD microlance</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No 15 Sterile carbon steel scalpel 
			Blade</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil)</td>
			<td>&#160;Carl Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brushes</td>
			<td>Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X</td>
			<td>&#160;Used to handle cryosections</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump (Minipuls 3)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>1004170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Lyon, France</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle, 125 mm (5&#34;), No. 3</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide staining system StainTray</td>
			<td>Simport Scientific</td>
			<td>M920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard diet</td>
			<td>&#160;Mucedola</td>
			<td>4RF21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus microscope slides</td>
			<td>Menzel-Glaser, Germany</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT mounting media</td>
			<td>VWR CHEMICALS</td>
			<td>361603E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triglycerides colorimetric assay kit</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>10010303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Bandelin Sonorex</td>
			<td>&#160;TK 52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors - 3 mm 
			cutting edge</td>
			<td>Fine Science Tools, Germany</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Black software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of fluorescent-stained lipid droplets with 3d reconstruction for hepatic steatosis assessment

Lipidtröpfchen (LDs) sind spezialisierte Organellen, die die Lipidspeicherung vermitteln und eine sehr wichtige Rolle bei der Unterdrückung der Lipotoxizität und der Verhinderung von Funktionsstörungen spielen, die durch freie Fettsäuren (FAs) verursacht werden. Die Leber ist aufgrund ihrer entscheidenden Rolle im Fettstoffwechsel des Körpers ständig durch die intrazelluläre Anhäufung von LDs in Form von mikrovesikulärer und makrovesikulärer Lebersteatose bedroht. Die histologische Charakterisierung von LDs basiert in der Regel auf lipidlöslichen Diazofarbstoffen, wie z. B. der Oil Red O (ORO)-Färbung, aber eine Reihe von Nachteilen erschweren die Verwendung dieser Analyse mit Leberproben durchweg. In jüngerer Zeit sind lipophile Fluorophore 493/503 aufgrund ihrer schnellen Aufnahme und Akkumulation in den neutralen Lipidtröpfchenkern für die Visualisierung und Lokalisierung von LDs populär geworden. Obwohl die meisten Anwendungen in Zellkulturen gut beschrieben sind, gibt es weniger Evidenz für den zuverlässigen Einsatz von lipophilen Fluorophorsonden als LD-Bildgebungswerkzeug in Gewebeproben. In dieser Arbeit schlagen wir ein optimiertes Bordipyrromethen (BODIPY) 493/503 basiertes Protokoll für die Evaluierung von LDs in Leberproben aus einem Tiermodell der fettreichen Diät (HFD)-induzierten hepatischen Steatose vor. Dieses Protokoll umfasst die Vorbereitung von Leberproben, die Gewebeschnitte, die BODIPY 493/503-Färbung, die Bildaufnahme und die Datenanalyse. Wir zeigen eine erhöhte Anzahl, Intensität, Flächenzahl und Durchmesser von hepatischen LDs bei HFD-Ernährung. Mittels orthogonaler Projektionen und 3D-Rekonstruktionen war es möglich, den vollen Gehalt an neutralen Lipiden im LD-Kern zu beobachten, die als nahezu kugelförmige Tröpfchen auftraten. Darüber hinaus konnten wir mit dem Fluorophor BODIPY 493/503 Mikrovesikel (1 μm < d ≤ 3 μm), intermediäre Vesikel (3 μm < d ≤ 9 μm) und Makrovesikel (d > 9 μm) unterscheiden, was eine erfolgreiche Unterscheidung von mikrovesikulärer und makrovesikulärer Steatose ermöglicht. Insgesamt ist dieses BODIPY 493/503 Fluoreszenz-basierte Protokoll ein zuverlässiges und einfaches Werkzeug für die hepatische LD-Charakterisierung und könnte einen ergänzenden Ansatz zu den klassischen histologischen Protokollen darstellen.

Lipid droplets (LDs), classically viewed as energy depots, are specialized cellular organelles that mediate lipid storage, and they comprise a hydrophobic neutral lipid core, which mainly contains cholesterol esters and triglycerides (TGs), encapsulated by a phospholipid monolayer1,2,3.
LD biogenesis occurs in the endoplasmic reticulum (ER), starting with the synthesis of triacylglycerol (TAG) and sterol esters. Neutral lipids are diffused between the leaflets of the ER bilayer at low concentrations but coalesce into oil lenses that grow and bud into nearly spherical droplets from ER membrane when their intracellular concentration increases4. Subsequently, proteins from the ER bilayer and cytosol, particularly the perilipin (PLIN) protein family, translocate to the surfaces of the LDs to facilitate budding5,6,7,8,9.
Through new fatty acid synthesis and LD fusion or coalescence, LDs grow into different sizes. Accordingly, the size and number of LDs differ considerably across different cell types. Small droplets (300-800 nm diameter), which are known as initial LDs (iLDs), can be formed by nearly all cells4. Later in LD formation, most cells are able to convert some iLDs into larger ones-expanding LDs (eLDs &#62;1 &#181;m in diameter). Yet, just specific cell types, such as adipocytes and hepatocytes, have the capacity to form giant or supersized LDs (up to tens of microns in diameter)4,10.
LDs play a very important role in the regulation of cellular lipid metabolism, suppressing lipotoxicity, and preventing ER stress, mitochondrial dysfunction, and, ultimately, cell death caused by free fatty acids (FAs)11,12,13,14. Furthermore, LDs have also been implicated in the regulation of gene expression, viral replication protein sequestration, and membrane trafficking and signaling15,16,17. Therefore, the misregulation of LD biogenesis is a hallmark of chronic diseases associated with metabolic syndrome, obesity, type 2 diabetes mellitus (T2DM), and/or arteriosclerosis, to name just a few18,19,20.
The liver, as a metabolic hub, is mostly responsible for lipid metabolism by storing and processing lipids, and, therefore, it is constantly threatened by lipotoxicity21. Hepatic steatosis (HS) is a common feature of a series of progressive liver diseases and is characterized by excessive intracellular lipid accumulation in the form of cytosolic LDs that, ultimately, may lead to liver metabolic dysfunction, inflammation, and advanced forms of nonalcoholic fatty liver disease22,23,24,25. HS occurs when the rate of fatty acid oxidation and export as triglycerides within very low-density lipoproteins (VLDLs) is lower than the rate of hepatic fatty acid uptake from the plasma and de novo fatty acid synthesis26. The hepatic accumulation of lipids often occurs in two forms-microvesicular and macrovesicular steatosis-and these display distinct cytoarchitectonic characteristics27. Typically, microvesicular steatosis is characterized by the presence of small LDs dispersed throughout the hepatocyte with the nucleus placed centrally, whereas macrovesicular steatosis is characterized by the presence of a single large LD that occupies the greater part of the hepatocyte, pushing the nucleus to the periphery28,29. Notably, these two types of steatosis are often found together, and it remains unclear how these two LD patterns influence disease pathogenesis, as evidence is still inconsistent31,32,33,34. Yet, such type of analysis is often employed as a &#34;reference standard&#34; in preclinical and clinical studies to understand the dynamic behavior of LDs and characterize hepatic steatosis29,34,35,36.
Liver biopsies, the gold standard for diagnosing and grading HS, are routinely assessed by histological hematoxylin and eosin (H&#38;E) analysis, where lipid droplets are evaluated as unstained vacuoles in H&#38;E-stained liver sections37. While acceptable for macrovesicular steatosis evaluation, this type of staining generally narrows the assessment of microvesicular steatosis38. Lipid-soluble diazo dyes, such as Oil Red O (ORO), are classically combined with brightfield microscopy to analyze intracellular lipid stores, but these still have a number of disadvantages: (i) the usage of ethanol or isopropanol in the staining process, which often causes the disruption of the native LDs and occasional fusion despite the cells being fixed39; (ii) the time-consuming nature, as ORO solution requires fresh powder dissolving and filtering due to the limited shelf life, thus contributing to less consistent results; (iii) and the fact that ORO stains more than just lipid droplets and often overestimates hepatic steatosis38.
Consequently, cell-permeable lipophilic fluorophores, such as Nile Red, have been used in either live or fixed samples to overcome some of the aforementioned limitations. However, the non-specific nature of cellular lipid organelle labeling repeatedly narrows LD assessments40. Moreover, the spectral properties of Nile Red vary according to the polarity of the environment, which can often lead to spectral shifts41.
The lipophilic fluorescent probe 1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4adiaza-s-indacene (excitation wavelength: 480 nm; emission maximum: 515 nm; BODIPY 493/503) exhibits hydrophobicity characteristics that allow its rapid uptake by intracellular LDs, accumulates in the lipid droplet core, and, subsequently, emits bright green fluorescence12. Unlike Nile Red, BODIPY 493/503 is insensitive to the environment polarity and has been shown to be more selective, as it displays high brightness for LD imaging. In order to stain neutral LDs, this dye can be used in live or fixed cells and successfully coupled with other staining and/or labeling methods42. Another advantage of the dye is that it requires little effort to place into a solution and is stable, thus eliminating the need to freshly prepare it for each experiment42. Even though the BODIPY 493/503 probe has been successfully employed to visualize the localization and dynamics of LDs in cell cultures, some reports have also demonstrated the reliable use of this dye as an LD imaging tool in tissues including the human vastus lateralis muscle43, the rat soleus muscle42, and the mouse intestine44.
Herein, we propose an optimized BODIPY 493/503-based protocol as an alternative analytical approach for the evaluation of the LD number, area, and diameter in liver specimens from an animal model of hepatic steatosis. This procedure covers liver sample preparation, tissue sectioning, staining conditions, image acquisition, and data analysis.

Autor im Rampenlicht: Analyse von fluoreszenzgefärbten Lipidtröpfchen mit 3D-Rekonstruktion zur Beurteilung der Lebersteatose  

Analyse fluoreszenzgefärbter Lipidtröpfchen mit 3D-Rekonstruktion zur Beurteilung der Lebersteatose

This imaging approach allows the three-dimensional reconstruction of hepatic lipid droplet deposition and overcomes the main disadvantages of classic histological staining that narrowed the successful discrimination between micro and macrovesicular steatosis. The assessment of microvesicular steatosis is when gold-standard histological stainings are used, both and Oil Red, due to disruption and occasional fusion of native lipid droplets. The pro-BODIPY offers an alternative to the routine protocols for microvesicular hepatic steatosis assessment due to its right hydrophobicity for a fast uptake and effective tagging of lipid droplets, being not only insensitive to the environment polarity, but also extremely selective.This imaging approach encloses broader applications in combination with immunochemistry techniques, allowing the simultaneous detection of other subcellular antigens that may advance the study of lipid droplets'biogenesis and dynamics, underpinning micro and macrovesicular hepatic steatosis.

Die erfolgreiche Durchführung dieser Technik sollte zu einer eindeutigen Lipidtröpfchenfärbung für die gleichzeitige Charakterisierung der LD-Morphologie (Form und Lipidkerndichte basierend auf der 3D-Rekonstruktion) zusammen mit ihrer räumlichen Verteilung, Anzahl pro Gesamtfläche und durchschnittlicher Größe (bewertet mit der oben beschriebenen Pipeline, Abbildung 1) führen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" ...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Fluorescent-Stained Lipid Droplets with 3D Reconstruction for Hepatic Steatosis Assessment at JoVE.com

In dieser Arbeit demonstrieren wir ein optimiertes BODIPY 493/503 Fluoreszenz-basiertes Protokoll zur Charakterisierung von Lipidtröpfchen in Lebergewebe. Durch die Verwendung von orthogonalen Projektionen und 3D-Rekonstruktionen ermöglicht der Fluorophor eine erfolgreiche Unterscheidung zwischen mikrovesikulärer und makrovesikulärer Steatose und kann einen komplementären Ansatz zu den klassischen histologischen Protokollen zur Beurteilung der hepatischen Steatose darstellen.

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing ...

Dieser bildgebende Ansatz ermöglicht die dreidimensionale Rekonstruktion der hepatischen Lipidtröpfchenablagerung und überwindet die Hauptnachteile der klassischen histologischen Färbung, die die erfolgreiche Unterscheidung zwischen mikro- und makrovesikulärer Steatose einschränkte. Die Beurteilung der mikrovesikulären Steatose erfolgt, wenn histologische Goldstandardfärbungen verwendet werden, sowohl als auch Ölrot, aufgrund der Störung und gelegentlichen Fusion nativer Lipidtröpfchen. Der pro-BODIPY bietet aufgrund seiner richtigen Hydrophobie für eine schnelle Aufnahme und effektive Markierung von Lipidtröpfchen eine Alternative zu den Routineprotokollen zur Beurteilung der mikrovesikulären Lebersteatose, da er nicht nur unempfindlich gegenüber der Umgebungspolarität ist, sondern auch äußerst selektiv ist.Dieser bildgebende Ansatz umfasst breitere Anwendungen in Kombination mit immunchemischen Techniken, die den gleichzeitigen Nachweis anderer subzellulärer Antigene ermöglichen, die die Untersuchung der Biogenese und Dynamik von Lipidtröpfchen vorantreiben und die mikro- und makrovesikuläre hepatische Steatose untermauern können.

analysis-fluorescent-stained-lipid-droplets-with-3d-reconstruction

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of Fluorescent-Stained Lipid Droplets with 3D Reconstruction for Hepatic Steatosis Assessment

3.0K Aufrufe.  University of Coimbra. Dieser bildgebende Ansatz ermöglicht die dreidimensionale Rekonstruktion der hepatischen Lipidtröpfchenablagerung und überwindet die Hauptnachteile der klassischen histologischen Färbung, die die erfolgreiche Unterscheidung zwischen mikro- und makrovesikulärer Steatose einschränkte. Die Beurteilung der mikrovesikulären Steatose erfolgt, wenn histologische Goldstandardfärbungen verwendet werden, sowohl als auch Ölrot, aufgrund der Störung und gelegentlichen Fusion nativer Lipidtröpf...

Serie: Autor im Rampenlicht: Analyse von fluoreszenzgefärbten Lipidtröpfchen mit 3D-Rekonstruktion zur Beurteilung der Lebersteatose  

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing dysfunction caused by free fatty acids (FAs). The liver, given its critical role in the body's fat metabolism, is persistently threatened by the intracellular accumulation of LDs in the form of both microvesicular and macrovesicular hepatic steatosis. The histologic characterization of LDs is typically based on lipid-soluble diazo dyes, such as Oil Red O (ORO) staining, but a number of disadvantages consistently hamper the use of this analysis with liver specimens. More recently, lipophilic fluorophores 493/503 have become popular for visualizing and locating LDs due to their rapid uptake and accumulation into the neutral lipid droplet core. Even though most applications are well-described in cell cultures, there is less evidence demonstrating the reliable use of lipophilic fluorophore probes as an LD imaging tool in tissue samples. Herein, we propose an optimized boron dipyrromethene (BODIPY) 493/503-based protocol for the evaluation of LDs in liver specimens from an animal model of high-fat diet (HFD)-induced hepatic steatosis. This protocol covers liver sample preparation, tissue sectioning, BODIPY 493/503 staining, image acquisition, and data analysis. We demonstrate an increased number, intensity, area ratio, and diameter of hepatic LDs upon HFD feeding. Using orthogonal projections and 3D reconstructions, it was possible to observe the full content of neutral lipids in the LD core, which appeared as nearly spherical droplets. Moreover, with the fluorophore BODIPY 493/503, we were able to distinguish microvesicles (1 &#181;m &lt; d &#8804; 3 &#181;m), intermediate vesicles (3 &#181;m &lt; d &#8804; 9 &#181;m), and macrovesicles (d &gt; 9 &#181;m), allowing the successful discrimination of microvesicular and macrovesicular steatosis. Overall, this BODIPY 493/503 fluorescence-based protocol is a reliable and simple tool for hepatic LD characterization and may represent a complementary approach to the classical histological protocols.

Herein, we demonstrate an optimized BODIPY 493/503 fluorescence-based protocol for lipid droplet characterization in liver tissue. Through the use of orthogonal projections and 3D reconstructions, the fluorophore allows for successful discrimination between microvesicular and macrovesicular steatosis and may represent a complementary approach to the classical histological protocols for hepatic steatosis assessment.

Forschung

Biochemie

Frozen Liver Tissue Sectioning and BODIPY Staining of Lipid Droplets

Turn on the cryostat and cut 12-micron-thick sections of the frozen liver tissue collected from a rat. Place the sections onto the labeled microscope slides at room temperature. For BODIPY staining, wash the tissue sections thrice with PBS for five minutes each.After the last wash, circle the sections on the slide with a hydrophobic layer using a barrier pen. Prepare a staining solution containing BODIPY 493/503 and DAPI. Then, pipette 75 microliters of the solution onto each slide.Incubate the slides at room temperature for 40 minutes in the dark. Following incubation, wash the slides thrice with PBS for five minutes each. Then, using a fluorescence mounting medium, carefully mount cover slips on each slide.Allow the slides to dry for 30 minutes before sealing the edges with nail polish.

Schnitt von gefrorenem Lebergewebe und BODIPY-Färbung von Lipidtröpfchen

Image Acquisition of Lipid Droplets and Analysis

Turn on the laser scanning confocal microscope and place the slide on the slide holder. For image visualization and acquisition, select the 20X objective lens. From the confocal software, select sequential scan mode to avoid crosstalk between the BODIPY 493/503 and DAPI.Then excite the BODIPY 493/503 die using the 488 nanometer argon laser line and the DAPI stain using the 405 nanometer laser line. Set the emission ranges at 493 to 589 nanometers for BODIPY and 410 to 464 nanometers for DAPI. Next, configure the microscope settings by adjusting frame sizes, scan speed, and averaging which includes number two times bit depth as 12 bits, direction as bidirectional, scan area digital zoom minus one, and pinhole minus one area unit.Adjust the gain and digital gain settings. Ensure there are no saturated pixels as indicated by the range indicator. After accurately identifying the lipid droplets, acquire the image with the BODIPY and DAPI channels.To create wide area images, switch to a 10X subjective lens. Then activate tile scan mode and configure it to generate five by five mosaic images. To generate 3D and orthogonal views, apply a drop of immersion oil on the top of the cover glass and change the objective lens to a 40X lens.Select the Z-stack mode. Adjust the Z-plane to define the first and last positions for image capture, ensuring an optical slice thickness of approximately 0.5 microns to capture all droplets in focus. Select the ortho module and create orthogonal views.Acquire 3D images by selecting the 3D module following transparency rendering mode. After image acquisition, begin processing and analyzing single plane images using CellProfiler. Upload the images in TIF format by clicking on the images mode in the top left corner of the CellProfiler interface.Use the names and types module to sort between BODIPY droplet and DAPI nuclei stained images based on the filenames. For lipid droplet analysis, use only BODIPY stained images. Initiate pipeline construction by clicking on adjust modules and select the color to gray module to convert the images into gray scale.Then using identify primary objects module, define lipid droplets between 6 to 300 pixels and a threshold correction factor of one to detect lipid droplets within the gray scale images. To measure the pixel intensity of the identified lipid droplets, add a measure object intensity module. Incorporate an additional filter objects module to ensure that only the strongest signals are quantified while less intense signals are excluded from the final lipid droplet analysis.Next, to measure the lipid droplets related to the output data, add the measure object size shape module. Then add an overlay outlines module to overlay the identified droplet on the original image and thus ensure that the segmentation looks accurate on the unprocessed image as well. Once done, add an export to spreadsheet module and click on the analyze images button from the bottom left corner.Compared to the control, HFD-fed animals presented a pronounced dyslipidemic profile and subtle increase in circulating triglycerides levels. Wide area images revealed increased lipid droplets across the livers of HFD-fed animals. Analysis with CellProfiler revealed an increased number of hepatic lipid droplets, augmented BODIPY fluorescence intensity, 360%area ratio, and larger diameters.Size distribution in HFD-fed animals revealed an increase in macro vesicular hepatic lipid droplets of more than nine microns and a reduction in microvesicles of less than three microns.