Um Southern Blotting durchzuführen, schneiden Sie zunächst eine Nylonmembran in ein 10 x 12 Zentimeter großes Segment. Machen Sie eine Kerbe in der gleichen Position wie das Gel. Aktivieren Sie die Membran, indem Sie sie in destilliertes Wasser tauchen, gefolgt von 20-fachem Natriumsalzcitratpuffer.
Legen Sie einen Docht aus Filterpapier auf ein doppelt umgedrehtes Fach und stellen Sie es so ein, dass die Enden den Boden des äußeren Fachs berühren. Legen Sie das Gel über das Filterpapier. Legen Sie dann die aktivierte Nylonmembran über das Gel und achten Sie darauf, dass sich die Kerben überlappen.
Entfernen Sie alle Luftblasen mit einem Glasstab. Legen Sie einen zwei Zentimeter großen Haufen 9,5 x 11,5 Zentimeter großes Zellulose-Filterpapier und einen weiteren sechs Zentimeter großen Haufen normales Filterpapier ein. Platzieren Sie ein Gewicht auf dem Setup, um eine gleichmäßige Gewichtsverteilung zu gewährleisten.
Füllen Sie die äußere Schale mit 20-fachem Natrium-Kochsalzcitrat-Puffer und lassen Sie ihn über Nacht stehen, um einen effizienten Transfer zu gewährleisten. Nach dem Südtransfer fixieren Sie die übertragene DNA auf der Membran durch UV-Vernetzung auf einem UV-Transilluminator. Waschen Sie die Membran zweimal mit 25 Millilitern 2X Natrium-Kochsalz-Citrat-Puffer.
Um eine Hybridisierung durchzuführen, wird die Membran in 10 Millilitern des vorgewärmten Vorhybridisierungspuffers inkubiert. Bewegen Sie die Membran in regelmäßigen Abständen vorsichtig von Hand. Anschließend wird der Blot in 10 Millilitern Hybridisierungspuffer bei 42 Grad Celsius drei Stunden lang unter leichtem Rühren inkubiert.
Waschen Sie den Blot zweimal in 25 Millilitern strengem Puffer für 10 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren. Waschen Sie nun den Blot zweimal in 25 Millilitern vorgewärmtem stringenten Puffer bei 50 Grad Celsius für 15 Minuten unter leichtem Rühren. Spülen Sie mit 15 Milliliter Waschpuffer fünf Minuten lang unter leichtem Rühren bei Raumtemperatur.
Inkubieren Sie die Membran in 10 Millilitern frisch zubereiteter Blockierlösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren. Geben Sie es dann in 10 Milliliter Anti-Digoxigenin, das mit einer alkalischen Phosphatase-Arbeitslösung konjugiert ist. Waschen Sie den Blot zweimal im Waschpuffer bei Raumtemperatur für 15 Minuten.
Nun in 10 Millilitern Nachweispuffer fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nachdem Sie den überschüssigen Puffer entfernt haben, legen Sie die Membran mit der DNA-Seite nach oben auf eine Acetatfolie. Geben Sie etwa einen bis 1,5 Milliliter Substratlösung tropfenweise auf die Membran.
Legen Sie sofort eine weitere Acetatfolie darauf und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Drücken Sie die überschüssige Substratlösung vor der Bildgebung aus. Erfassen Sie mit einem Gel-Dokumentations-Bildgebungssystem mehrere ungesättigte Bilder zu unterschiedlichen Zeitpunkten zur Analyse.
Nach Southern Blot und Hybridisierung waren die Telomerrestriktionsfragmente deutlich sichtbar, was durch einen Abstrich angedeutet wurde.
