Geben Sie zunächst 500 Mikroliter des Lysepuffers in das zuvor erhaltene A2780-Zellpellet und mischen Sie es vorsichtig mit einer abgeschnittenen Spitze mit einem minimalen Öffnungsdurchmesser von zwei Millimetern. Fügen Sie 20 Mikrogramm pro Milliliter frisch zubereitete RNase hinzu und mischen Sie sie durch sanfte Umkehrung. Bei 37 Grad Celsius 30 Minuten inkubieren.
Am Ende der Inkubation wird die Proteinase K bis zu einer Endkonzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter hinzugefügt und 10-mal vorsichtig invertiert. Erneut eine Stunde lang bei 55 Grad Celsius inkubieren, dabei das Röhrchen alle 10 Minuten umdrehen. Pipettieren Sie 500 Mikroliter Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol-Reagenz in das Röhrchen und drehen Sie das Röhrchen etwa 20 Mal vorsichtig um.
Zentrifugieren Sie es bei 9.391 g für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Pipettieren Sie die obere wässrige viskose Schicht in ein neues Röhrchen. Fügen Sie eine gleiche Menge Chloroform hinzu und mischen Sie durch sanfte Umkehrung.
Nachdem Sie das Röhrchen einmal zentrifugiert haben, sammeln Sie die wässrige Schicht. Geben Sie eine angemessene Menge von fünf molaren Natriumchlorid in das Röhrchen, um die Konzentration um 0,2 Mol zu erhöhen. Geben Sie zwei Volumina 100%iges Ethanol in das Röhrchen und drehen Sie es 20 Mal vorsichtig um.
Bei 15.871 G fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Nachdem Sie den Überstand entsorgt haben, fügen Sie 500 Mikroliter 70%iges Ethanol hinzu. Zentrifugieren Sie erneut im gleichen Zustand und entsorgen Sie dann den Überstand.
Sobald das Pellet an der Luft getrocknet ist, fügen Sie 50 Mikroliter steriles nukleasefreies Wasser hinzu und lassen Sie es rehydrieren. Mischen Sie dann die DNA durch Pipettieren mit der abgeschnittenen Spitze. Verwenden Sie die UV-Spektrophotometrie, um die DNA-Konzentration zu messen.
Nachdem Sie die DNA verdaut haben, trennen Sie sie mit 0,8 % Agarose. Tauchen Sie das Agarose-Gel 10 Minuten lang bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren in 0,25 molare Salzsäurelösung. Spülen Sie das Gel dann zweimal mit destilliertem Wasser ab.
Um die DNA zu denaturieren, tauchen Sie das Gel in eine Lösung aus Natriumhydroxid und Natriumchlorid. Spülen Sie das Gel dann zweimal mit destilliertem Wasser ab. Um die DNA wie gezeigt zu neutralisieren, tauchen Sie das Gel in eine Lösung aus 0,5 molarer Salzsäure und dreimolarem Natriumchlorid bei pH sieben.
Die genomische DNA des Extraktors zeigte eine gute Integrität, was darauf hindeutet, dass sie für die weitere Weiterverarbeitung von Telomerrestriktionsfragmenten verwendet wird.
