Nehmen Sie zunächst die Platte mit elektroporierten Fibroblasten und beobachten Sie die Bildung von hiPSC-Kolonien unter einem 10- bis 20-fachen Phasenkontrastmikroskop. Die hiPSC-Kolonien mit einem Durchmesser von 300 Mikrometern, ausgeprägten Rändern und einem hohen Kern-zu-Körper-Verhältnis eignen sich für die Ernte. Beschichten Sie vor der Ernte die Wells einer 96-Well-Platte, die für hiPSC-Kultur geeignet ist, mit 100 Mikrolitern Beschichtungslösung.
Und eine Stunde bei 37 Grad Celsius inkubieren. Markieren Sie während der Inkubation mit einem Stift die interessierenden Kolonien am Boden der Zellkulturschale. Für die endgültige Präparation der 96-Well-Platte entfernen Sie die Beschichtungslösung und geben 100 Mikroliter vorgewärmtes hiPSC-Nährmedium mit 10 Mikromol ROCK-Inhibitor Y-27632 in jede Well.
Waschen Sie als Nächstes die Zellen mit vorgewärmtem PBS und fügen Sie frisches, vorgewärmtes hiPSC-Nährmedium hinzu, das 10 Mikromol des ROCK-Inhibitors Y-27632 enthält, bevor Sie abgestorbene Zellen entfernen. Wählen Sie die hiPSC-Kolonien mit einer Messnadel aus und teilen Sie die Kolonien in kleine Stücke, indem Sie ein Gitter in jede Kolonie zeichnen. Überprüfen Sie anschließend mit einem Phasenkontrastmikroskop, ob die Kolonien erfolgreich in Stücke geteilt wurden.
Zum Schluss werden die Kolonien mit einer 100-Mikroliter-Pipette auf die vorbereitete 96-Well-Platte übertragen und die Pipette aufrecht über die Kolonie gehalten. Lassen Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid ungestört anlagern. Ersetzen Sie das Medium am nächsten Tag durch 200 Mikroliter frisches hiPSC-Nährmedium, um den ROCK-Inhibitor Y-27632 zu entfernen, und legen Sie die Platten wieder in den Inkubator.
Überwachen Sie die 96-Well-Platte und markieren Sie die Wells mit erfolgreich gepflückten Klonen. Die markierten Klone können an dieser Stelle erweitert und eingefroren werden. Phasenkontrastbilder zeigten erfolgreich reprogrammierte hiPSC-Kolonien, ausgewählte hiPS-Kolonien, spontan differenzierte Kolonien, Nicht-hiPSC-Kolonien und eine zu dichte hiPSC-Kultur wurden präsentiert.
