Nehmen Sie zunächst einen Kolben mit kultivierten Fibroblastenzellen, bestreichen Sie eine 10 Zentimeter große Zellkulturplatte, die für die hiPSC-Kultur geeignet ist, mit vier Millilitern Kaltbeschichtungslösung pro Platte und inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Anschließend entfernst du die Medien aus den Fibroblasten und wäschst sie mit vier Millilitern vorgewärmtem PBS pro Kolben. Saugen Sie das PBS ab und assoziieren Sie die Fibroblasten mit vier Millilitern Trypsin-EDTA pro Kolben, indem Sie fünf bis sieben Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Überwachen Sie die Zellablösung mit einem Phasenkontrastmikroskop und klopfen Sie bei Bedarf gegen die Seite des Kolbens, um die Zellen von der Kunststoffoberfläche zu lösen. Übertragen Sie die abgelösten Zellen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und waschen Sie die leeren Kolben mit sechs Millilitern vorgewärmtem Fibroblastenmedium. Sammeln und bündeln Sie die verbleibenden Zellen in der konischen Röhre.
Anschließend zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 g für fünf Minuten bei 20 Grad Celsius. Saugen Sie den Überstand an und suspendieren Sie das Zellpellet in drei Millilitern frischem, vorgewärmtem PBS. Zählen Sie die Zellen, übertragen Sie 1,5 mal 10 bis sechste Fibroblasten in ein neues konisches Röhrchen und füllen Sie PBS bis zur Fünf-Millimeter-Marke auf.
Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 200 g für fünf Minuten bei 20 Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand, suspendieren Sie das Zellpellet erneut in fünf Milliliter Elektroporationsmedium und zentrifugieren Sie erneut. In der Zwischenzeit wird die Beschichtungslösung von der beschichteten 10-Zentimeter-Zellkulturplatte abgesaugt und sieben Milliliter vorgewärmtes Fibroblastenmedium hinzugefügt.
Am Ende der Zentrifugation wird der Überstand verworfen und das Zellpellet in Elektroporationsmedium mit einer Konzentration von 1,5 mal 10 bis zu den sechsten Zellen in 250 Mikrolitern resuspendiert. Übertragen Sie die 250 Mikroliter fassende Zellsuspension in eine Elektroporationsküvette mit einem Abstand von vier Millimetern. Als nächstes wird eine Plasmatransfektionsmischung hergestellt, indem vier Mikrogramm jedes Plasmids zu einem Gesamtvolumen von 50 Mikrolitern Elektroporationsmedium hinzugefügt werden.
Übertragen Sie das Transfektionsgemisch in die Küvette, mischen Sie es vorsichtig durch Schnippen und elektroporieren Sie mit einem Impuls bei 280 Volt. Zum Schluss werden 150 Mikroliter der elektroporierten Fibroblasten auf die vorbereitete 10 Zentimeter große Zellkulturplatte übertragen. Rühren Sie die Platte dreimal in alle Richtungen, um die Zellen zu verteilen, und inkubieren Sie sie über Nacht.
Fibroblasten liegen in einem langen, spindelartigen Phänotyp vor, der eine Größe von 150 bis 300 Nanometern hat. Nach der Reprogrammierung treten Kolonien mit 50 Mikrometer kleinen hiPSCs auf, die deutliche Ränder aufweisen. Die hiPS-Zellen zeichnen sich durch ein hohes Zellkern-zu-Körper-Verhältnis und eine erhöhte Proliferationsrate aus.
