Beginnen Sie damit, die Embryonen, die von der euthanasierten zwei bis sechs Monate alten trächtigen weiblichen Maus präpariert wurden, in ein kaltes, vollständiges Medium mit 1 % fötalem Kälberserum zu legen. Nachdem Sie das Endometriumgewebe, die Plazenta und den Dottersack unter 5-facher Vergrößerung aus dem Embryo entfernt haben, werden die kardialen Vorläuferzellen mit einer Pinzette aus der embryonalen Herzregion präpariert. Ziehen Sie alle von fünf Mausembryonen präparierten Herzregionen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie in einem auf vier Grad Celsius vorgekühlten Schwingeimer.
Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Gewebe mit einem Milliliter PBS in Gewebekulturqualität. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 300 G für eine Minute bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie dann den Überstand und wiederholen Sie zwei Wäschen mit einem Milliliter PBS.
Wenn Sie fertig sind, ersetzen Sie das PBS durch 0,05 % Trypsin-EDTA. Zentrifugieren und zwei Waschgänge mit 0,05%Trypsin-EDTA wiederholen. Um das Gewebe zu verdauen, fügen Sie 50 Mikroliter 0,05%Trypsin-EDTA hinzu und erhitzen Sie es 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.
Als nächstes wenden Sie nach fünf Minuten eine sanfte mechanische Dissoziation an, indem Sie die Suspension mit einer Filterspitze mit breiter Öffnung auf und ab ansaugen. Inaktivieren Sie die Trypsin-Verdauungsaktivität, indem Sie den dissoziierten Zellen 350 Mikroliter des vollständigen Mediums hinzufügen. Die Zellsuspension wird durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb geführt.
Bereiten Sie die Zellen für das Einfrieren vor, indem Sie die frisch dissoziierte Zellsuspension zentrifugieren. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter gekühltem Gefriermedium. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein vorgekühltes Kryo-Fläschchen und legen Sie das Kryo-Fläschchen in einen vorgekühlten Gefrierbehälter.
Stellen Sie den Gefrierbehälter vier bis acht Stunden lang auf minus 80 Grad Celsius, bevor Sie ihn für Sequenzierungsexperimente in flüssigen Stickstoff umfüllen.
