Legen Sie zunächst die gefrorene dissoziierte embryonale Herzzellsuspension mit Kryofläschchen für ein bis zwei Minuten in ein 37 Grad Celsius warmes Wasserbad. Einen Milliliter komplettes, auf 37 Grad Celsius vorerwärmtes Medium in die aufgetaute Suspension geben und dreimal mit einer Pipette verrühren. Anschließend wird die Suspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millimetern warmem Komplettmedium überführt.
Führen Sie die gesamte Zellsuspension über ein 30-Mikrometer-Sieb und spülen Sie das Sieb mit ein bis zwei Millilitern warmem, vollständigem Medium aus. Sammeln Sie den Durchfluss im selben konischen Rohr. Als nächstes zentrifugieren Sie die Röhrchen fünf Minuten lang bei 300 G.
Nachdem Sie den Überstand entfernt haben, waschen Sie das Pellet mit PBS und überführen Sie die Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension und geben Sie 100 Mikroliter der bereitgestellten magnetischen Mikrokügelchen zu den pelletierten Zellen. Homogenisieren Sie die Suspension fünfmal mit einer breiten Eberpipettenspitze, bevor Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Spülen Sie in der Zwischenzeit die Magnetabscheidesäule mit 500 Mikrolitern Bindepuffer aus. Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, verdünnen Sie die Mikrokügelchen-Zellsuspensionsmischung mit 500 Mikrolitern Bindungspuffer. Als nächstes geben Sie 0,6 Milliliter der Zellsuspension in die magnetische Trennsäule.
Sammeln Sie das Lebendzellen-Abwasser in einem 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Als nächstes spülen Sie das 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen, das die Zellsuspension enthielt, mit einem Milliliter Bindungspuffer aus. Nach dem Spülen den Bindepuffer aus dem 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen in die Kolonne überführen und das Abwasser im selben 15-Milliliter-Röhrchen auffangen.
Wiederholen Sie das Spülen des 1,5-Milliliter-Röhrchens mit einem Milliliter Bindepuffer. Nachdem Sie das Abwasser fünf Minuten lang bei 300 G zentrifugiert haben, entfernen Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu zerstören. Fügen Sie einen Milliliter der PBS BSA-Lösung hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren mit einer Pipettenspitze mit breiter Öffnung.
Anschließend wird die Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen überführt. Zentrifugieren Sie erneut die Zellsuspension und entfernen Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu zerstören. Wiederholen Sie die beiden Waschgänge mit einem Milliliter PBS BSA.
Nachdem Sie den einen Milliliter PBS BSA entfernt haben, resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern PBS BSA-Lösung. Mischen Sie es, indem Sie es 10 Mal pipettieren. Bestimmen Sie die Konzentration durch Durchführung eines Trypanblau-Assays, um eine Zellzahl von mindestens 100.000 Zellen sicherzustellen, und führen Sie eine fluoreszenzbasierte Bewertung der Lebensfähigkeit der Zellen durch.
Der zusätzliche Schritt des Sortierens und Entfernens der toten Zellen nach dem Auftauen ermöglichte die Gewinnung einer saubereren Zellsuspension mit deutlich höherer Zellviabilität und verbesserte die Qualität der Ausgangsprobe. Um die Genauigkeit zu erhöhen, wurden zwei verschiedene Zählmethoden zur Quantifizierung der Zellen und Zellkerne verwendet, darunter Trypanblau und die fluoreszenzbasierte Beurteilung der Lebensfähigkeit. In diesem Protokoll wurde beobachtet, dass die Zellviabilität von 80 bis 90 % vor der Zellkernisolierung auf weniger als 5 % nach der Zellkernisolierung zurückging.
