Impfen Sie zunächst Limosilactobacillus reuteri DSM20016 aus Glycerinbrühe in einem 50-Milliliter-Röhrchen in sechs Milliliter De Man-, Rogosa-, Sharpe- oder MRS-Brühe. Inkubieren Sie die Kultur aerob über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem statischen Inkubator. Am nächsten Tag werden vier Milliliter der Nachtkultur in 200 Milliliter MRS-Brühe geimpft.
Lassen Sie die Kultur in einem statischen Inkubator bei 37 Grad Celsius aerob wachsen, bis die optische Dichte bei 600 Nanometern 0,5 bis 0,85 erreicht. Anschließend wird die Kultur in 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen umgefüllt und auf Eis gelegt, während die Röhrchen ausbalanciert werden. Zentrifugieren Sie die Kultur in einer vorgekühlten Zentrifuge und entsorgen Sie den Überstand.
Bevor Sie das Pellet in 50 Milliliter vorgekühltes, doppelt destilliertes Wasser resuspendieren, wiederholen Sie die Zentrifugation zweimal. Nach der letzten Zentrifugation resuspendieren Sie das Pellet in 25 Milliliter doppelt destilliertem Wasser, 0,5 molare Saccharose und 10 % Glycerin. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension, entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in zwei Millilitern doppelt destilliertem Wasser, 0,5 molaren Saccharose und 10 % Glycerin auf Eis.
Aliquotieren Sie die Suspension in 50 bis 100 Mikroliter-Portionen in vorgekühlten Mikrozentrifugenröhrchen und lagern Sie die Röhrchen bei minus 80 Grad Celsius für die spätere Verwendung. Als nächstes tauen Sie für die Elektroporation ein Aliquot elektrokompetenter Zellen auf Eis auf. Mischen Sie fünf bis 10 Mikroliter des Plasmids in das aufgetaute Aliquot und vermeiden Sie das Pipettieren so weit wie möglich.
Übertragen Sie das Gemisch in eine eisgekühlte Elektroporationsküvette mit einem Milliliter-Spalt und Elektroporat bei 1,25 Kilovolt, 400 Ohm und 25 Mikrofarad. Nach der Elektroporation einen Milliliter MRS-Brühe hinzufügen und mischen, indem Sie die Küvette ein- oder zweimal umdrehen. Legen Sie die Küvetten für 2,5 bis drei Stunden in einen statischen Inkubator bei 37 Grad Celsius, um sich zu erholen.
Als nächstes legen Sie die gesamte Suspension auf mehrere MRS-Schlangenplatten mit entsprechender Auswahl. Stellen Sie die Teller in einen luftdichten Behälter mit einer kleinen brennenden Kerze in einem Beutel mit anaerober Atmosphäre. Wachsen Sie zwei bis drei Tage lang bei 37 Grad Celsius oder bis sichtbare Kolonien erscheinen.
Die Elektroporation von L. reuteri mit dem konstitutiven mCherry2-produzierenden pTRKH3-Plasmid führt zu Transformationseffizienzen von etwa fünf bis acht Kolonien pro 200 Mikroliter, unabhängig von der Plasmidmethylierungsbedingung. Die Transformation mit pNZ123, das kein exogenes konstitutives Reporterprotein trägt, ergab Transformationseffizienzen von dreimal 10 bis vier KBE pro Mikrogramm DNA.
