Fresh Primary Tumor Tissue Processing to Establish Tumor Organoids and Primary Fibroblasts

Beginnen Sie damit, das Gewebe in eine sterile Gewebekulturplatte zu legen und überschüssiges Medium zu entfernen. Messen Sie das Gewebe mit einem sterilen Metalllineal und fotografieren Sie es. Geben Sie drei Milliliter fortschrittliches DMEM/F-12-Medium in das geschnittene Gewebe und pipettieren Sie das Gewebe auf und ab, um es zu waschen.

Waschen Sie das Taschentuch anschließend mit drei Millilitern PBS. Saugen Sie das Medium von der Gewebekulturplatte ab und schneiden Sie es mit sterilen Klingen und zwei Millilitern Aufschlussmedium in kleine Stücke. Anschließend wird das Gewebe in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit insgesamt fünf Millilitern Verdauungsmedium gesammelt.

Inkubieren Sie das Röhrchen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Mischen Sie die Suspension regelmäßig durch Auf- und Abpipettieren. Inaktivieren Sie das Trypsin, indem Sie fünf Milliliter fortschrittliches DMEM/F-12 in das Röhrchen geben.

Filtern Sie die Probe dann durch ein 70-Mikrometer-Porensieb, um große Ablagerungen zu entfernen. Pipettieren Sie nun zwei Milliliter DMEM mit 10 % FBS an die Oberseite des Filters und verwenden Sie eine Pipette, um die Ablagerungen und Gewebereste für die Fibroblastenkultivierung zu sammeln. Anschließend werden die Trümmer für die Fibroblastenkultur plattiert.

Das Filtrat wird fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 200 bis 300 g zentrifugiert und dann der Überstand abgesaugt. Geben Sie fünf Milliliter fortschrittliches DMF 12 in das Pellet und zentrifugieren Sie die Suspension erneut fünf Minuten lang bei 300 g. Für die Lyse der roten Blutkörperchen wird das Pellet in vier Milliliter Ammoniumchlorid-Kalium-Kalium-Lysepuffer resuspendiert und in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführt.

Inkubieren Sie die Zellen zwei Minuten lang bei Raumtemperatur. Nachdem das Gemisch unter den gleichen Bedingungen wie zuvor gezeigt zentrifugiert wurde, wird der Überstand abgesaugt. Dem Pellet werden fünf Milliliter fortschrittliches DMEM/F-12 hinzugefügt und erneut bei vier Grad Celsius zentrifugiert.

Nach dem Absaugen des Überstandes wird ein Milliliter handelsübliches Zelldissoziationsreagenz in das Pellet gegeben und zwei bis drei Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation zentrifugieren und den Überstand erneut absaugen. Anschließend wird das Pellet in fünf Milliliter fortschrittlichem DMEM/F-12 resuspendiert.

Dissoziieren Sie Zellklumpen, indem Sie die Suspension mehrmals mit einer P1000-Pipette pipettieren. Zentrifugieren Sie die Suspension und entfernen Sie den Überstand. Besorgen Sie sich als Nächstes vorgekühlte P1000- und P200-Pipettenspitzen und verwenden Sie die kalten Spitzen, die an der P1000-Pipette befestigt sind, um das Zellpellet in der Membranmatrix zu resuspendieren, bevor Sie den Falcon auf Eis legen, um eine Erstarrung zu verhindern.

Holen Sie die vorgewärmte Platte aus dem Inkubator. Mit dem P200-Pipettensatz bei 48 Mikrolitern und unter Verwendung kalter Spitzen werden Basalmembran-Matrixkuppeln in der vorgeheizten Platte erzeugt. Inkubieren Sie es dann, um die Basalmembranmischung zu verfestigen.

Sobald die Matrix verfestigt ist, fügen Sie zwei bis zweieinhalb Milliliter fortschrittliches DMEM/F-12 hinzu, ergänzt mit den Wachstumsfaktoren und Inhibitoren. Über einen Zeitraum von 15 Tagen wurden Tumorzellen isoliert und Tumororganoide aus frischem Gewebe gebildet. Gelegentlich verhindern große Zelltrümmervolumina eine genaue Visualisierung der Entwicklung von Tumororganoiden.

Es wurde beobachtet, dass die sich entwickelnden Organoide je nach Tumorursprung phänotypisch von isolierten, gerundeten bis hin zu sphäroiden oder aggregatartigen Kulturen variieren. Organoide Kulturen können durch Fibroblasten kontaminiert sein, ein häufiges PI-Produkt der primären Tumorzellkultur. Nach etwa sieben Tagen Kultur wandern die Fibroblasten aus den Kuppeln der Basalmembranmatrix und haften an den Zellplatten, was ein optimales Wachstum der Organoide beeinträchtigen kann.

Fibroblastenkulturen werden aus den aus dem Filter gewonnenen Gewebetrümmern hergestellt. Die Zellen wandern aus den Gewebetrümmern heraus und haften an den Kulturplatten.