Beginnen Sie mit der Messung der Konzentration der ventrikulären Kardiomyozyten der Neugeborenen mit einem Hämozytometer. Verdünnen Sie die Zellsuspensionslösung auf 3.000 Zellen pro Milliliter, wobei Alpha-MEM 10 % wärmeinaktiviertes FBS enthält. Verteilen Sie 100 Mikroliter des verdünnten ventrikulären Kardiomyozyten in jede Vertiefung der nicht adhäsiven 96-Well-Platten der Zelle.
Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 100 G und kultivieren Sie sie zwei bis drei Tage lang im Zellkultur-Inkubator mit 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation wird das Kulturmedium aus den Kardiomyozytenkugeln der Ratte abgesaugt, die in der nicht klebenden 96-Well-Platte ausgesät sind. Übertragen Sie dann die Kardiomyozytenkugeln aus jeder Vertiefung in ein 15-Milliliter-Röhrchen.
Zentrifugieren Sie die Kardiomyozytenkugeln und saugen Sie den Überstand ab. Waschen Sie sie dann mit einem ADS-Puffer. Um die Verfolgung der Kardiomyozytenzellen in der Ratte nach der Transplantation zu erleichtern, färben Sie die Zellen mit PKH26.
Bevor Sie die Zellen zentrifugieren, verfolgen Sie die Entwicklung der Bidim-Kardiomyozytenkugeln, indem Sie sie nach der Aussaat regelmäßig unter dem Mikroskop beobachten. Beginnen Sie mit der Vorbereitung des Hauptinjektionsgeräts für eine neonatale Kardiomyozytenkugel-Injektion mit einer 29 Gauge, 50 Millimeter langen Nadel, die mit einer Spritze ausgestattet ist. Verbinden Sie eine 18-Gauge-Spritzennadel mit einem Milliliter an einen dünnen Polypropylenschlauch mit geringer Lumendehnbarkeit.
Saugen Sie das Wasser mit einer Spritze an und entfernen Sie alle Blasen aus der Spritze und den angeschlossenen Röhrchen. Wiederholen Sie dies für eine weitere 18-Gauge-Nadel. Verbinden Sie dann die andere Seite des Stromübertragungsschlauchs mit der 18-Gauge-Nadel derselben Ein-Milliliter-Spritze.
Bestätigen Sie den erfolgreichen Leistungsübergang, indem Sie einen Spritzenkolben nach unten und einen anderen Spritzenkolben nach oben drücken. Wenn Sie fertig sind, setzen Sie die Spritze in eine Spritzenpumpe. Als nächstes richten Sie das Kühlsystem ein, indem Sie das eng aufgewickelte Kupferrohr an der Zelle befestigen, die einen Teil der Zellinjektionsspritze enthält.
Lassen Sie an beiden Enden 10 Millimeter überschüssiges Rohr stehen. Verbinden Sie den Kupferschlauch mit dem flexiblen Kunststoffschlauch, bevor Sie die anderen Enden des Kunststoffschlauchs mit einer externen Pumpe verbinden. Füllen Sie die Leitung mit Kühlwasser und tauchen Sie das überschüssige Kupferrohr in Crushed Ice, um das Wasser zu kühlen.
Dieses Kühlsystem hält die Zellsuspensionslösung im Zylinder bei ca. 2 Grad Celsius.
