Nach der Klonierung des Vesikel-Nukleierungspeptids oder VNP-Sequenz-Tags am Aminoterminal des Fusionsproteins wird eine Fünf-Milliliter-Lysogenbrühe oder LB-Starter aus frischen bakteriellen Transformationen bei 37 Grad Celsius bis zur Sättigung kultiviert. Verwenden Sie diese dann, um 25 Milliliter großartige Brühe oder TB zu impfen, die eine geeignete Antibiotikaauswahl in einem 500-Milliliter-Erlenmeyerkolben enthält. Inkubieren Sie den Kolben in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius unter Schütteln mit 200 Umdrehungen pro Minute oder größer als einem 25-Millimeter-Orbitalwurf, bis die Kultur einen optischen Dichtewert von 600 Nanometern oder OD 600 von 0,8 bis 1,0 erreicht.
Anschließend wird die rekombinante Proteinexpression aus dem T7-Promotor induziert, indem IPTG zu einer Endkonzentration von bis zu 20 Mikrogramm pro Milliliter oder 84 Mikromolaren hinzugefügt wird. Nachdem Sie genügend Zeit für die Induktion gelassen haben, pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 3000 G bei 4 Grad Celsius für 20 Minuten. Führen Sie den Überstand durch einen sterilen und reinigungsmittelfreien 0,45-Mikron-PES-Filter, um das vesikelhaltige Medium für die Langzeitlagerung zu sterilisieren.
Um die Vesikel auf ein kleineres Volumen zu konzentrieren, führen Sie das sterile Vesikelmedium durch einen sterilen und reinigungsmittelfreien 0,1-Mikron-MCE-Filter. Waschen Sie dann die Membran vorsichtig mit 0,5 bis 1 Milliliter steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und entfernen Sie die Vesikel vorsichtig mit einem Zellschaber oder Kunststoffspreizer von der Membran. Das Vesikelkonzentrat wird mit einer Pipette in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
Gereinigte Vesikel können bei vier Grad Celsius gelagert werden. Beschallen Sie das Protein mit Vesikeln in den sterilen Medien unter Verwendung eines geeigneten Zeitplans, um die vesikulären Lipidmembranen zu stören und das Protein freizusetzen. Zentrifugieren Sie die beschallte Suspension bei 39.000 G und 4 Grad Celsius für 20 Minuten, um die vesikulären Ablagerungen zu entfernen.
BL21DE3 Escherichia coli, die das VNp6-mNeongreen-Expressionskonstrukt enthielten, zeigten eine mNeongreen-Fluoreszenz, die über Nacht mit IPTG induziert wurde. Die Fluoreszenz blieb in der Kultur nach der Entfernung von Bakterienzellen durch Zentrifugation sichtbar. Das Vorhandensein von VNp-mNeongreen in der Kultur in gereinigten Nährmedien wurde durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestätigt.
Die resuspendierten gereinigten Vesikel in PBS zeigten ebenfalls Fluoreszenz.
