Die Autoren danken verschiedenen Twitter-Nutzern, die Fragen zu dem Protokoll gestellt haben, das in dem Artikel zur Beschreibung der VNp-Technologie vorgestellt wird. Abbildung 1A wurde unter Verwendung von Symbolen aus flaticon.com generiert. Diese Arbeit wurde von der University of Kent unterstützt und vom Biotechnology and Biological Sciences Research Council finanziert (BB/T008/768/1 und BB/S005544/1).

Die bakterielle Arbeit folgt den lokalen, nationalen und internationalen Vorschriften zur Eindämmung der biologischen Sicherheit, die dem jeweiligen biologischen Sicherheitsgefahrenniveau jedes Stammes entsprechen.
1. Auswahl verschiedener VNps
<ol><li>Identifizieren Sie die VNp-Sequenzen. HINWEIS: Für die vorliegende Studie wurden drei VNp-Sequenzenidentifiziert1 , die zu einer maximalen Ausbeute und einem vesikulären Export der bisher untersuchten Proteine führen: VNp2, VNp6 und VNp15. Es ist derzeit nicht klar, warum bestimmte VNp-Varianten mit einigen Proteinen effizienter arbeiten als andere; Daher wird empfohlen, mit jeder VNp-Variante (d. h. VNp2, 6 oder 15) Fusionen zwischen einem neuen Protein von Interesse zu erzeugen. VNp2: MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEA AGKTKEGVL VNp6: MDVFKKGFSIADEGVVGAVEKTDQGVTEA AEKTKEGVM VNp15: MDVFKKGFSIADEGVVGAVE Plasmide, die die Expression des interessierenden Proteins mit verschiedenen aminoterminalen VNp-Fusionen ermöglichen, wurden kommerziell verfügbar gemacht (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Entwerfen Sie eine Klonierungsstrategie, um das interessierende Gen am 3'-Ende der cDNA, die für das VNp kodiert, in eines dieser Konstrukte einzufügen, oder passen Sie ein vorhandenes Plasmid an, indem Sie synthetisierte VNp-cDNA stromaufwärts des ersten ATG-Codons des Gens integrieren, das für das interessierende Protein kodiert. Verwenden Sie die unter1 beschriebenen Methoden.</li>
	<li>Verwenden Sie für toxische Proteine einen Vektor mit einem repressiblen Expressionspromotor oder einen Promotor mit minimalem nicht induziertem Expressionsrauschen.</li>
	<li>Klonen Sie den VNp-Sequenz-Tag am Amino-Terminal des Fusionsproteins. Stellen Sie sicher, dass sich die Affinitätsmarkierungen, Proteasespaltungssequenzen usw. und das interessierende Protein auf der Carboxylseite des VNp-Tags befinden. Es wird empfohlen, das VNp mit einer flexiblen Linkerregion, wie z. B. zwei oder drei Wiederholungen einer -G-G-S-G-peptidsequenz, vom nachgeschalteten Peptid zu trennen (Abbildung 1). HINWEIS: Verwenden Sie Plasmide mit einer Antibiotikaauswahl, die nicht auf Peptidoglykan abzielt, was die Zelloberfläche schwächt und die Vesikelausbeute verringert. Kanamycin und Chloramphenicol (siehe Materialtabelle) waren die bevorzugten Antibiotika, die für diese Studie verwendet wurden.</li>
</ol>2. Bakterielle Zellkultur und Proteininduktion
HINWEIS: Bakterienstämme, die typischerweise in diesem Protokoll verwendet werden, sind entweder Escherichia coli BL21 (DE3) oder W3110. E. coli-Zellen werden in Lysogenbrühe (LB) (10 g/L Trypton; 10 g/L NaCl; 5 g/L Hefeextrakt) oder in hervorragender Bouillon (TB) (12 g/L Trypton; 24 g/L Hefeextrakt; 4 mL/L 10% Glycerin; 17 mM KH 2 PO 4; 72 mM K2HPO4, Salze separat autoklaviert) kultiviert (siehe Materialtabelle). Beispielbilder, die jeden Schritt der Proteininduktion und des anschließenden Isolierungs- und Reinigungsprozesses zeigen, sind in Abbildung 2 dargestellt.
<ol><li>Kultur von 5 ml LB Starter aus frischen bakteriellen Transformationen bei 37 °C bis zur Sättigung und Verwendung zur Inokulation von 25 ml TB in einem 500 ml Erlenmeyerkolben, alles mit geeigneter Antibiotikaauswahl.</li>
	<li>Das Verhältnis von Oberfläche zu Volumen ist ein wichtiger Faktor bei der Optimierung dieses Systems. Verwenden Sie einen möglichst großvolumigen Kolben (z. B. einen 5-Liter-Kolben mit 1 l Kultur; für Optimierungsläufe verwenden Sie 25 ml des Mediums in einem 500-ml-Kolben).</li>
	<li>Die größeren Schüttelkolbenkulturen werden in einem Inkubator bei 37 °C unter Schütteln bei 200 U/min (≥25 mm Orbitalwurf) inkubiert, bis ein optischer Dichtewert von 600 nm (OD600) von 0,8-1,0 erreicht ist. HINWEIS: Die Vesikulation ist optimal, wenn die Zellen bei 37 °C gezüchtet werden. Einige rekombinante Proteine müssen jedoch bei niedrigeren Temperaturen exprimiert werden. Wenn dies bei dem interessierenden Protein der Fall ist, muss der VNp6-Tag verwendet werden, da dies einen hochergiebigen Vesikelexport bei Temperaturen von bis zu 25 °C ermöglicht.</li>
	<li>Um eine rekombinante Proteinexpression aus dem T7-Promotor zu induzieren, wird Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) zu einer Endkonzentration von bis zu 20 μg/ml (84 μM) hinzugefügt (siehe Materialtabelle). Die Induktion der rekombinanten Proteinexpression muss für die Produktion von Vesikeln in der späten logarithmischen Phase (d.h. typischer OD600 von 0,8-1,0) erfolgen. HINWEIS: Die Länge der Induktionszeit kann je nach Proteinen unterschiedlich sein, wobei einige die maximale Produktion nach 4 Stunden und andere über Nacht (18 Stunden) erreichen. Bisher wurde der maximale Vesikelexport in Übernachtkulturen erzielt.</li>
</ol>3. Rekombinante Vesikelisolierung
<ol><li>Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 3.000 x g (4 °C) für 20 Minuten.</li>
	<li>Um vesikelhaltige Medien für die Langzeitlagerung zu sterilisieren, führen Sie die gereinigten Nährmedien durch einen sterilen und reinigungsmittelfreien 0,45 μm Polyethersulfon(PES)-Filter (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Um den Ausschluss lebensfähiger Zellen aus dem vesikelhaltigen Filtrat zu testen, auf LB-Agar plattieren und über Nacht bei 37 °C inkubieren.</li>
	<li>Um die Vesikel auf ein kleineres Volumen zu konzentrieren, werden die sterilen vesikelhaltigen Medien durch einen sterilen und reinigungsmittelfreien 0,1-μm-Filter für gemischte Celluloseester (MCE) geleitet (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Waschen Sie die Membran vorsichtig mit 0,5-1 ml sterilem PBS mit einem Zellschaber oder Kunststoffstreuer, um die Vesikel vorsichtig von der Membran zu entfernen. In ein frisches Mikrofugenröhrchen umfüllen. HINWEIS: Gereinigte Vesikel können in sterilen Medien oder phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei 4 °C gelagert werden. Es gibt Beispiele für rekombinante Proteine, die auf diese Weise 6 Monate lang in diesen Vesikeln gelagert werden, ohne dass die enzymatische Aktivität verloren geht.</li>
</ol>4. Freisetzung löslicher Proteine aus isolierten Vesikeln
<ol><li>Nachdem die proteinhaltigen Vesikel in das sterile Medium/den sterilen Puffer isoliert wurden, werden die vesikulären Lipidmembranen nach einem für die Apparatur geeigneten Zeitplan (z. B. 6 x 20 s Ein- und Ausschaltzyklen) beschallt und 20 Minuten lang bei 39.000 x g (4 °C) zentrifugiert, um Vesikelreste zu entfernen. HINWEIS: Eine osmotische Schock- oder Detergenzienbehandlung kann als Alternative zum Aufbrechen der Vesikel verwendet werden, aber die Auswirkungen auf die Proteinfunktionalität und/oder die nachgeschaltete Anwendung müssen berücksichtigt werden.</li>
	<li>Wenn die VNp-Fusion zytosolisch bleibt und nicht in das Medium freigesetzt wird, isolieren Sie das Protein unter Verwendung von Standardprotokollen (z. B. Resuspendierung der Zellpellets in 5 ml eines geeigneten Extraktionspuffers (20 mM Tris, 500 mM NaCl), Beschallung und Entfernung der Zelltrümmer durch Zentrifugation).</li>
</ol>5. Bestimmung der Proteinkonzentration
<ol><li>Bestimmung der Proteinkonzentration durch Gel-Densitometrie-Analyse von dreifachen Proben1. Laufen Sie zusammen mit den Beladungsstandards für Rinderserumalbumin (BSA) auf Coomassie-gefärbten Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Gelelektrophorese-Gelen (SDS-PAGE). Scannen und analysieren Sie die Gele mit geeigneter Software (z. B. Bild J; siehe Materialtabelle).</li>
</ol>6. Visualisierung der Vesikelbildung und isolierter Vesikel mittels Fluoreszenzmikroskopie
HINWEIS: Wenn die Zellen fluoreszenzmarkierte VNp-Fusions- oder Membranmarker enthalten, kann die Bildgebung lebender Zellen verwendet werden, um die Vesikelbildung zu verfolgen. Alternativ können fluoreszierende Lipidfarbstoffe verwendet werden, um Vesikel sichtbar zu machen, um die Produktion und Reinigung zu bestätigen.
<ol><li>Zellenmontage<ol><li>Induzieren Sie die VNp-Fusionsexpression für mehrere Stunden, bevor Sie sie auf das Deckglas aufbringen.</li>
		<li>Agarose-Pad-Methode (Abbildung 3A-C): Pipettieren Sie die Zellen auf ein dünnes (<1 mm), kreisförmiges LB-Agarose-Pad (2 %), das sich bilden und auf einem sauberen Glasobjektträger abbinden konnte. Lassen Sie die Zellen absetzen und ausgleichen und legen Sie ein 50 mm x 25 mm großes Deckglas auf das Pad und die Zellen. Halten Sie das Deckglas mit Abstandshaltern und Klebeband fest.</li>
		<li>Polyethylenimin (PEI)-Methode (Abbildung 3D-F): 20 μl 0,05 % PEI (in dH2O) mit einer Pipettenspitze auf ein Deckglas verteilen und 3-5 Minuten ohne Trocknen an Glas binden lassen. Fügen Sie 50 μl Zellkultur hinzu und lassen Sie sie 5-10 Minuten einwirken, um sicherzustellen, dass sich Bakterien mit der PEI-beschichteten Oberfläche verbunden haben4. Waschen Sie das Deckglas mit 100 μl Medien, bevor Sie es auf den Objektträger legen, und halten Sie es mit Abstandshaltern und Klebeband fest.</li>
	</ol></li>
	<li>Montage von Vesikeln<ol><li>Pipettieren Sie gereinigte Vesikel auf ein dünnes (<1 mm), kreisförmiges LB-Agarose-Pad (2 %), das sich bilden und auf einem sauberen Objektträger abbinden konnte. Sobald die Flüssigkeit getrocknet ist, legen Sie ein 50 mm x 25 mm großes Deckglas auf das Pad und die Vesikel. Halten Sie das Deckglas mit Abstandshaltern und Klebeband fest.</li>
		<li>Der fluoreszierende Lipidfarbstoff FM4-64 ist in der Lage, Membranen5 zu färben und kann daher zur Visualisierung von Vesikeln verwendet werden. FM4-64 (siehe Materialtabelle) in einer Endkonzentration von 2 μM (aus einem in Dimethylsulfoxid [DMSO] gelösten 2-mM-Stamm) zu gereinigten Vesikeln geben und nach einer 10-minütigen Inkubation abbilden. Dies ist besonders nützlich für die Identifizierung von Vesikel, die nicht fluoreszenzmarkierte Ladungenenthalten 5.</li>
		<li>Spülen Sie die Deckgläser mit dem gleichen Medium aus, mit dem die beobachteten Zellen kultiviert wurden. HINWEIS: Einige komplexe Medien (z. B. TB) können Autofluoreszenz aufweisen, was zu einem übermäßigen Hintergrundsignal führen kann.</li>
	</ol></li>
	<li>Bildgebende Vesikel HINWEIS: Beispielmikroskopiebilder von rekombinanten VNp-Vesikeln sind in Abbildung 4 zu sehen.<ol><li>Montieren Sie den Objektträger mit einem Ölimmersionsobjektiv auf ein inverses Mikroskop (siehe Materialtabelle) und lassen Sie ihn 2-3 Minuten einwirken, damit sich die Probe setzen und die Temperatur ausgleichen kann. HINWEIS: Die gesamte Bildgebung lebender Zellen für jede Probe muss innerhalb von 30 Minuten nach dem Aufbringen der Zellen auf Deckgläser abgeschlossen sein, um die Auswirkungen von Phototoxizität und anaerobem Stress zu minimieren. Aus diesem Grund werden Bilder mit einer Ebene gegenüber Z-Stapeln bevorzugt.</li>
		<li>Verwenden Sie geeignete Lichtquellen (z. B. Leuchtdiode [LED] oder Halogenlampe; siehe Materialtabelle) und Filterkombinationen für das/die verwendete(n) fluoreszierende(n) Protein(e)/Farbstoff(e)6.</li>
		<li>Verwenden Sie ein Objektiv mit hoher Vergrößerung (z. B. 100x oder 150x) und hoher numerischer Apertur (z. B. NA ≥1,4) für die Abbildung der mikrobiellen Zellen und Vesikel.</li>
		<li>Bestimmen Sie die minimale Lichtintensität, die erforderlich ist, um Fluoreszenzsignale von Zellen und / oder Vesikeln sichtbar zu machen. Dies kann eine Anpassung der Belichtungs- und Verstärkungseinstellungen für die verwendete Kamera erfordern. HINWEIS: Die typischen Belichtungszeiten aktueller CMOS-Kameras (Complementary Metal-Oxide Semiconductor) variieren je nach Bildgebungssystem zwischen 50 und 200 ms.</li>
		<li>Verwenden Sie für Einzelbildbilder die Mittelwertbildung aus drei Bildern, um hardwareabhängige zufällige Hintergrundgeräusche zu reduzieren.</li>
		<li>Planen Sie für Zeitrafferaufnahmen 3-5 Minuten zwischen den einzelnen Bildern ein. Anmerkungen: Abhängig von der Mikroskopkonfiguration muss der Fokus bei längeren Zeitrafferexperimenten möglicherweise intermittierend angepasst werden.</li>
	</ol></li>
</ol>

Herstellung und Bildgebung von rekombinanten proteingefüllten Vesikeln aus E. coli

<ol>
	<li>Eastwood, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+vesicle-packaged+recombinant+protein+production+from+E.+coli.">High-yield vesicle-packaged recombinant protein production from E. coli.</a> Cell Reports Methods. 3 (2), 100396 (2023).</li><li>Makino, T., Skretas, G., Georgiou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+engineering+for+improved+expression+of+recombinant+proteins+in+bacteria.">Strain engineering for improved expression of recombinant proteins in bacteria.</a> Microbial Cell Factories. 10, 32 (2011).</li><li>Peng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+recombinant+protein+secretion+efficiency+in+gram-positive+bacteria:+Signal+peptide+and+beyond.">Factors influencing recombinant protein secretion efficiency in gram-positive bacteria: Signal peptide and beyond.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 139 (2019).</li><li>Lewis, K., Klibanov, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+nature:+rational+design+of+sterile-surface+materials.">Surpassing nature: rational design of sterile-surface materials.</a> Trends in Biotechnology. 23 (7), 343-348 (2005).</li><li>Betz, W. J., Mao, F., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+exocytosis+and+endocytosis.">Imaging exocytosis and endocytosis.</a> Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 365-371 (1996).</li><li>Mulvihill, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+in+fission+yeast.">Live cell imaging in fission yeast.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (10), (2017).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+monomeric+green+fluorescent+protein+derived+from+Branchiostoma+lanceolatum.">A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum.</a> Nature Methods. 10 (5), 407-409 (2013).</li><li>Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+mCherry+variants+with+long+Stokes+shift,+red-shifted+fluorescence,+and+low+cytotoxicity.">Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity.</a> PloS One. 12 (2), e0171257 (2017).</li><li>Periz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+dynamic+F-actin+network+regulates+transport+and+recycling+of+micronemes+in+Toxoplasma+gondii+vacuoles.">A highly dynamic F-actin network regulates transport and recycling of micronemes in Toxoplasma gondii vacuoles.</a> Nature Communications. 10 (1), 4183 (2019).</li><li>Qiu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniform+patchy+and+hollow+rectangular+platelet+micelles+from+crystallizable+polymer+blends.">Uniform patchy and hollow rectangular platelet micelles from crystallizable polymer blends.</a> Science. 352 (6286), 697-701 (2016).</li></ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder sonstigen Interessenkonflikte.

Die oben beschriebene aminoterminale Peptid-markierte Methode zur Herstellung rekombinanter Proteine ist ein einfacher Prozess, der konstant große Mengen an Protein liefert, die effizient isoliert und/oder monatelang gelagert werden können.
Es ist wichtig, die wichtigsten Schritte im Protokoll hervorzuheben, die für eine optimale Nutzung dieses Systems erforderlich sind. Zuerst muss der VNp-Tag1 am N-Terminus lokalisiert werden, gefolgt von dem interessierenden Protein und den entsprechenden Tags. Es ist auch wichtig, den Einsatz von Antibiotika zu vermeiden, die auf die Peptidoglykanschicht abzielen, wie z. B. Ampicillin.
In Bezug auf die Wachstumsbedingungen sind Rich Media (z. B. LB- oder TB-Medien) und ein hohes Oberflächen-Volumen-Verhältnis erforderlich, um die Vesikelproduktion zu maximieren. Die optimale Temperatur für die Produktion extrazellulärer Vesikel beträgt 37 °C, aber auch die Bedingungen, die typischerweise für die Expression des interessierenden Proteins erforderlich sind, müssen berücksichtigt werden. Für niedrigere Induktionstemperaturen muss VNp6 verwendet werden. Entscheidend ist, dass die Induktion des T7-Promotors mit nicht mehr als 20 μg/ml (84 μM) IPTG erreicht werden muss, sobald die Zellen einen OD600 von 0,8-1,0 erreichen. Proteine, die mit dem System exprimiert werden, erreichen die maximale Vesikelproduktion entweder nach 4 Stunden oder nach Induktion über Nacht.
Trotz der Einfachheit dieses Protokolls muss es optimiert werden. Die Fusion von VNp-Varianten, die Expressionstemperaturen und die Induktionszeiten können je nach interessierendem Protein unterschiedlich sein. Darüber hinaus besteht die Notwendigkeit, die Reinigung und anschließende Konzentration der extrazellulären Vesikel aus den Medien zu optimieren. Das aktuelle Verfahren ist nicht skalierbar und kann zeitaufwändig sein. Dies sind die Grenzen dieser Methodik.
Die VNp-Technologie hat viele Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden2. Es ermöglicht den vesikulären Export verschiedener Proteine, wobei die maximale Größe, die bisher erfolgreich exprimiert wurde, 175 kDa für Vesikel liegt, die intern bleiben, und 85 kDa für diejenigen, die exportiert werden. Darüber hinaus kann diese Technologie die Ausbeute an rekombinanten Proteinen mit einer Reihe von physikalischen Eigenschaften und Aktivitäten erheblich steigern. Exportierte Vesikel, die das interessierende Protein enthalten, können durch einfache Filtration aus dem vorgereinigten Medium isoliert und anschließend in sterilen Nährmedien oder Puffern bei 4 °C für mehrere Monate gelagert werden.
Die Anwendungen für dieses System sind vielfältig und reichen von der Entdeckungswissenschaft über die angewandte Biotechnologie bis hin zur Medizin (z. B. durch die Herstellung funktioneller Therapeutika)3. Die einfache Herstellung, die Weiterverarbeitung und die hohe Ausbeute sind attraktive Eigenschaften in diesen Bereichen und insbesondere in der Industrie.

Das gramnegative Bakterium E. coli ist ein attraktives System für die rekombinante Proteinproduktion sowohl im industriellen als auch im akademischen Maßstab. Es ist nicht nur kostengünstig und einfach, in Chargen bis zu hohen Dichten zu kultivieren, sondern es wurde auch ein breites Spektrum an Reagenzien, Stämmen, Werkzeugen und Promotoren entwickelt, um die Erzeugung funktioneller Proteine in E. coli1 zu fördern. Darüber hinaus überwinden Techniken der synthetischen Biologie nun Hindernisse, die typischerweise mit der Anwendung posttranslationaler Modifikationen und der Faltung komplexer Proteine zusammenhängen2. Die Möglichkeit, die Sekretion rekombinanter Proteine gezielt in Nährmedien zu fördern, ist attraktiv, um die Ausbeute zu verbessern und die Herstellungskosten zu senken. Die kontrollierte Verpackung von benutzerdefinierten Proteinen in Membranvesikel unterstützt die Entwicklung von Produkten und Technologien in der angewandten Biotechnologie- und Medizinindustrie. Bisher fehlte es an breit anwendbaren Methoden, um rekombinante Proteine aus E. coli 3 zu sezernieren.
Eastwood et al. haben kürzlich eine Peptid-Tagging-basierte Methode zur Herstellung und Isolierung rekombinanter proteinhaltiger Vesikel aus E. colientwickelt 1. Dieses Vesikel-Nukleating-Peptid (VNp) ermöglicht die Herstellung extrazellulärer bakterieller Membranvesikel, in die das rekombinante Protein der Wahl gezielt eingesetzt werden kann, um die Reinigung und Lagerung des Zielproteins zu vereinfachen, und ermöglicht deutlich höhere Ausbeuten als normalerweise aus Schüttelkolbenkulturen. Es wurden Ausbeuten von fast 3 g rekombinantem Protein pro Liter Kolbenkultur berichtet, wobei die Ausbeuten >100-mal höher waren als bei äquivalenten Proteinen ohne VNp-Tag. Diese rekombinanten, mit Proteinen angereicherten Vesikel können schnell aus den Nährmedien gereinigt und konzentriert werden und bieten eine stabile Umgebung für die Lagerung. Diese Technologie stellt einen großen Durchbruch in der Produktion von rekombinanten E. coli-Proteinen dar . Die Vesikel kompartimentieren toxische und disulfidbrückenhaltige Proteine in löslicher und funktioneller Form und unterstützen die einfache, effiziente und schnelle Reinigung von vesikelverpackten, funktionellen Proteinen für die Langzeitlagerung oder die direkte Verarbeitung1.
Die wichtigsten Vorteile, die diese Technologie gegenüber den derzeitigen Techniken bietet, sind: (1) die Anwendbarkeit auf eine Reihe von Größen (1 kDa bis >100 kDa) und Proteintypen; (2) Erleichterung der Bildung von Disulfidbrücken zwischen und innerhalb von Proteinen; (3) anwendbar auf Multiproteinkomplexe; (4) kann mit einer Reihe von Promotoren und Standard-Labor-E. coli-Stämmen verwendet werden; (5) die Erzeugung von Proteinausbeuten aus Schüttelkolben, die normalerweise nur bei Fermentationskulturen zu beobachten sind; Proteine werden exportiert und in membrangebundene Vesikel verpackt, die (6) eine stabile Umgebung für die Lagerung des aktiven löslichen Proteins bieten; und (7) vereinfacht die nachgeschaltete Verarbeitung und Proteinreinigung. Dieses einfache und kostengünstige Werkzeug für rekombinante Proteine wird sich wahrscheinlich positiv auf die Biotechnologie- und Medizinbranche sowie auf die Entdeckungswissenschaft auswirken.
Hier beschreibt ein detailliertes, über mehrere Jahre entwickeltes Protokoll die optimalen Bedingungen, um mit der VNp-Technologie rekombinante proteingefüllte Vesikel aus Bakterien herzustellen. Es werden Beispielbilder dieses Systems in der Praxis gezeigt, wobei ein fluoreszierendes Protein exprimiert wird, wodurch das Vorhandensein von Vesikeln in verschiedenen Phasen der Produktion, Reinigung und Konzentration visualisiert werden kann. Abschließend wird eine Anleitung gegeben, wie die Bildgebung lebender Zellen zur Validierung der Produktion von VNp-fusionshaltigen Vesikeln aus den Bakterien verwendet werden kann.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Melford</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Acros Organics (Thermofisher Scientific)</td>
			<td>56-75-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21 (DE3)</td>
			<td>Lab Stock</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli DH10&#946;</td>
			<td>Lab Stock</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters for microscope</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Molecular Probes (Invitrogen)</td>
			<td>T-3166</td>
			<td>Dissolved in DMSO, stock concentration 2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Open Source</td>
			<td></td>
			<td>Downloaded from: https://imagej.net/ij/index.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Melford</td>
			<td>367-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulphate</td>
			<td>Gibco (Thermofisher Scientific)</td>
			<td>11815-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED light source for micrscope</td>
			<td>Cairn Research Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB) / LB agar</td>
			<td>Lab Stock</td>
			<td>N/A</td>
			<td>10 g/L Tryptone; 10 g/L NaCl; 5 g/L Yeast Extract (1.5 g/L agar)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metamorph imaging software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF-Millipore Membrane filter (0.1 &#181;m, MCE)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>VCWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Express PLUS membrane filter (0.45 &#181;m, PES)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>HPWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Lab Stock</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids allowing expression of protein of interest with different VNp amino terminal fusions&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
			<td>https://www.addgene.org/Dan_Mulvihill/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth (TB)</td>
			<td>Lab Stock</td>
			<td>N/A</td>
			<td>12 g/L Tryptone; 24 g/L Yeast Extract; 4 ml/L 10% glycerol; 17 mM KH2PO4 72 mM K2HPO4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized production and analysis of recombinant protein-filled vesicles from e. coli

Dieses innovative System, das einen kurzen Peptid-Tag verwendet, der mehrere rekombinante Proteine in membrangebundenen Vesikeln aus E. coli exportiert, bietet eine effektive Lösung für eine Reihe von Problemen, die mit der bakteriellen rekombinanten Proteinexpression verbunden sind. Diese rekombinanten Vesikel unterteilen Proteine in einer Mikroumgebung, die die Produktion von ansonsten schwierigen, toxischen, unlöslichen oder disulfidbrückenhaltigen Proteinen aus Bakterien erleichtert. Die Proteinausbeute ist im Vergleich zur typischen bakteriellen Expression in Abwesenheit des vesikelnukleierenden Peptid-Tags erheblich erhöht. Die Freisetzung von Vesikel-verpackten Proteinen unterstützt die Isolierung aus dem Nährmedium und ermöglicht eine langfristige aktive Proteinspeicherung. Diese Technologie führt zu einer höheren Ausbeute an vesikelverpackten, funktionellen Proteinen für eine vereinfachte nachgelagerte Verarbeitung für eine Vielzahl von Anwendungen, von der angewandten Biotechnologie bis hin zu Entdeckungswissenschaft und Medizin. Im vorliegenden Artikel und dem dazugehörigen Video wird ein detailliertes Protokoll der Methode bereitgestellt, das die wichtigsten Schritte der Methodik zur Maximierung der rekombinanten proteingefüllten Vesikelproduktion hervorhebt.

The Gram-negative bacteria E. coli is an attractive system for recombinant protein production on both industrial and academic scale. It is not only cost-effective and straightforward to culture in batches to high densities, but a broad-spectrum of reagents, strains, tools, and promoters have been established to promote the generation of functional proteins in E. coli1. Additionally, synthetic biology techniques are now overcoming obstacles typically related to the application of post-translational modifications and folding of complex proteins2. The ability to target the secretion of recombinant proteins into culture media is attractive for improving yield and reducing manufacturing costs. Controlled packaging of user-defined proteins into membrane vesicles assists the development of products and technologies within the applied biotechnology and medical industries. Until now, there has been a lack of widely applicable methods for secreting recombinant proteins from E. coli 3.
Eastwood et al.&#160;have recently developed a peptide tagging-based method for producing and isolating recombinant protein-containing vesicles from E. coli1. This Vesicle Nucleating peptide (VNp) allows the production of extracellular bacterial membrane vesicles, into which the recombinant protein of choice can be targeted to simplify purification and storage of the target protein, and allows significantly higher yields than normally allowed from shaking flask cultures. Yields of close to 3 g of recombinant protein per liter of flask culture have been reported, with &#62;100x higher yields than those obtained with equivalent proteins lacking the VNp tag. These recombinant protein-enriched vesicles can be rapidly purified and concentrated from the culture media and provide a stable environment for storage. This technology represents a major breakthrough in E. coli recombinant protein production. The vesicles compartmentalize toxic and disulfide-bond containing proteins in a soluble and functional form, and support the simple, efficient, and rapid purification of vesicle-packaged, functional proteins for long-term storage or direct processing1.
The major advantages this technology presents over current techniques are: (1) the applicability to a range of sizes (1 kDa to &#62;100 kDa) and types of protein; (2) facilitating inter- and intra- protein disulfide-bond formation; (3) applicable&#160;to multiprotein complexes; (4) can be used with a range of promoters and standard lab E. coli strains; (5) the generation of yields of proteins from shaking flasks normally only seen with fermentation cultures; proteins are exported and packaged into membrane bound vesicles that (6) provide a stable environment for storage of the active soluble protein; and (7) simplifies downstream processing and protein purification. This simple and cost-effective recombinant protein tool is likely to have a positive impact on the biotechnology and medical industries, as well as discovery science.
Here, a detailed protocol, developed over several years, describes the optimal conditions to produce recombinant protein-filled vesicles from bacteria with the VNp technology. Example images of this system in practice are shown, with a fluorescent protein being expressed, allowing the presence of vesicles during different stages of the production, purification, and concentration to be visualized. Finally, guidance is provided on how to use live cell imaging to validate the production of VNp fusion-containing vesicles from the bacteria.

Autor im Rampenlicht: Die Produktion rekombinanter Proteine 

Optimierte Herstellung und Analyse von rekombinanten, proteingefüllten Vesikeln aus E. coli

We are trying to understand the dynamic interactions between molecules within living cells. For biochemical analysis, it can be necessary to use large quantities of recombinant protein. These can be extremely difficult to express in a correctly-folded and functional form.If a protein was found to be misfolded or insoluble when expressed in bacteria, researchers would either have to resort to mammalian cells, which is expensive and relatively slow, or use synthetic polypeptides. Our protocol allows for high yield expression as well as export of challenging proteins from E.coli. Adding a short cleavable peptide sequence to the amino terminus of the protein not only enhances the production and yield of every protein we have tested to date, but also exports the protein from the cell into the media.Along with simplifying protein expression, it also simplifies downstream protein purification.

BL21 DE3 E. coli, die das VNp6-mNeongreen-Expressionskonstrukt enthalten, wurden in die späte logarithmische Phase gezüchtet (Abbildung 2A). Die VNp6-mNeongreen-Expression wurde durch Zugabe von IPTG (20 μg/ml oder 84 μM Endkonzentration) induziert, das anschließend über Nacht bei 37 °C unter kräftigem Schütteln (200 U/min, ≥25 mm Orbitalwurf) wachsen gelassen wurde. Am nächsten Morgen zeigte die Kultur mNeongreen-Fluoreszenz7 (Abbildung 2B), die nach der Entfernung von Bakterienzellen durch Zentrifugation im Medium sichtbar blieb (Abbildung 2C). Das Vorkommen von VNp-mNeongreen in der Kultur und in den freigegebenen Nährmedien wurde durch SDS-PAGE bestätigt (Abbildung 2D). Die mNeongreen-haltigen Vesikel wurden auf einen 0,1 μm MCE-Filter isoliert (Abbildung 2E) und in PBS resuspendiert (Abbildung 2F). Die gereinigten Vesikel wurden anschließend auf ein Agarosepad montiert (Abbildung 3A-C) und mittels Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie abgebildet (Abbildung 4A). Das Vorhandensein von Vesikelmembranen wurde mit dem lipophilen Fluoreszenzfarbstoff FM4-64 bestätigt (Abbildung 4B). Die E. coli-Zellen, die das innere Membranprotein CydB exprimieren, das mit mNeongreen (grün) und VNp6-mCherry2 (magenta)8 fusioniert ist, zeigen die Vesikelproduktion und die Cargo-Insertion in lebenden Bakterienzellen (Abbildung 4C). Die Abbildungen 4A und B wurden mit einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop aufgenommen, während die Abbildung 4C mit Hilfe der strukturierten Beleuchtungsmikroskopie (SIM) unter Verwendung der zuvor beschriebenen Methodenaufgenommen wurde 9,10.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65442/65442fig01.jpg"> Abbildung 1: Zusammenfassung der VNp-Technologie von der Entwicklung einer Klonierungsstrategie bis zur Aufreinigung und Lagerung extrazellulärer Vesikel. (A) Schematische Darstellung eines typischen VNp-Fusionsproteins. VNp am NH2-Terminus, gefolgt von einem flexiblen Linker und einer geeigneten Kombination aus Affinitäts- und Fluoreszenz-Tags (Tag1, Tag 2, Protease-Spaltstelle [z.B. TEV]) und Protein von Interesse. (B) Schematische Darstellung des Protokolls für die Expression und Reinigung von rekombinanten, proteingefüllten Membranvesikeln aus E. coli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65442/65442fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65442/65442fig02.jpg"> Abbildung 2: Produktions- und Reinigungsstufen von VNp6-mNg-Vesikeln. Kulturen von E. coli-Zellen , die die VNp-mNeongreen-Expression enthalten, werden in blauem Licht entweder vor (A) oder nach (B) IPTG-induzierter Expression des Fusionsproteins konstruiert. Die Zellen von (B) wurden durch Zentrifugation entfernt, so dass VNp-mNeongreen-gefüllte Vesikel im Medium (C) verblieben. (D) Äquivalente Proben aus A, B und C wurden mittels SDS-PAGE und Coomassie-Färbung analysiert. Die Vesikel wurden auf einen 0,1 μm Filter (E) isoliert und anschließend in ein geeignetes Volumen Puffer (F) abgewaschen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65442/65442fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65442/65442fig03.jpg"> Abbildung 3: Verfahren zur Zellmontage für die Bildgebung von Vesikeln und die Vesikelproduktion. (A-C) Die Agarose-Pad-Methode und (D-F) die PEI-Methode zur Befestigung von E. coli-Zellen auf dem Deckglas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65442/65442fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65442/65442fig04.jpg"> Abbildung 4: Mikroskopische Aufnahmen von VNp-rekombinanten Vesikel. Grüne (A) und rote (B) Emissionsbilder aus verschiedenen Feldern von FM4-64 markierten VNp6-mNeongrün-haltigen Vesikel, die auf einem Agarose-Pad montiert sind. (C) Die Bildgebung von E. coli-Zellen, die das innere Membranprotein CydB exprimieren, fusioniert mit mNeongreen (grün) und VNp6-mCherry2 (magenta), zeigt die Vesikelproduktion und die Cargo-Insertion in lebende Bakterienzellen. (A,B) wurden mit einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop abgebildet, während (C) mit strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (SIM) aufgenommen wurde. Maßstabsbalken: (A,B) = 10 μm; (C) = 1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65442/65442fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

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Das vorliegende Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren zur bakteriellen Herstellung von rekombinanten Proteinen, einschließlich typischerweise unlöslicher oder Disulfidbrücken-haltiger Proteine, die in extrazellulären membrangebundenen Vesikeln verpackt sind. Dies hat das Potenzial, auf vielseitige Bereiche der wissenschaftlichen Forschung angewendet zu werden, einschließlich der angewandten Biotechnologie und der Medizin.

This innovative system, using a short peptide tag, that exports multiple recombinant proteins in membrane bound vesicles from E. coli, provides an ...

Wir versuchen, die dynamischen Wechselwirkungen zwischen Molekülen in lebenden Zellen zu verstehen. Für die biochemische Analyse kann es notwendig sein, große Mengen an rekombinantem Protein zu verwenden. Diese können äußerst schwierig in einer korrekt gefalteten und funktionalen Form ausgedrückt werden.Würde sich herausstellen, dass ein Protein fehlgefaltet oder unlöslich ist, wenn es in Bakterien exprimiert wird, müssten die Forscher entweder auf Säugetierzellen zurückgreifen, was teuer und relativ langsam ist, oder synthetische Polypeptide verwenden. Unser Protokoll ermöglicht eine hohe Ausbeute der Expression sowie den Export anspruchsvoller Proteine aus E. coli. Das Hinzufügen einer kurzen spaltbaren Peptidsequenz zum Aminoterminus des Proteins erhöht nicht nur die Produktion und Ausbeute jedes Proteins, das wir bisher getestet haben, sondern exportiert das Protein auch aus der Zelle in das Medium.Neben der Vereinfachung der Proteinexpression vereinfacht es auch die nachgeschaltete Proteinreinigung.

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Research

JoVE Journal

Biology

Optimized Production and Analysis of Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli

4.9K Aufrufe.  University of Kent. Wir versuchen, die dynamischen Wechselwirkungen zwischen Molekülen in lebenden Zellen zu verstehen. Für die biochemische Analyse kann es notwendig sein, große Mengen an rekombinantem Protein zu verwenden. Diese können äußerst schwierig in einer korrekt gefalteten und funktionalen Form ausgedrückt werden.Würde sich herausstellen, dass ein Protein fehlgefaltet oder unlöslich ist, wenn es in Bakterien exprimiert wird, müssten die Forscher entweder auf Säugetierzellen zurückgre...

Serie: Autor im Rampenlicht: Die Produktion rekombinanter Proteine 

This innovative system, using a short peptide tag, that exports multiple recombinant proteins in membrane bound vesicles from E. coli, provides an effective solution to a range of problems associated with bacterial recombinant protein expression. These recombinant vesicles compartmentalise proteins within a micro-environment that facilitates the production of otherwise challenging, toxic, insoluble, or disulfide-bond containing proteins from bacteria. Protein yield is increased considerably when compared to typical bacterial expression in the absence of the vesicle-nucleating peptide tag. The release of vesicle-packaged proteins supports isolation from the culture medium&#160;and permits long-term active protein storage. This technology gives rise to increased yields of vesicle-packaged, functional proteins for simplified downstream processing for a diverse range of applications from applied biotechnology to discovery science and medicine. In the present article and the associated video, a detailed protocol of the method is provided, which highlights key steps in the methodology to maximize recombinant protein-filled vesicle production.

The present protocol describes a detailed method for the bacterial production of recombinant proteins, including typically insoluble or disulfide-bond containing proteins, packaged inside extracellular membrane-bound vesicles. This has the potential to be applied to versatile areas of scientific research, including applied biotechnology and medicine.

Forschung

Biologie

Recombinant Vescicle Isolation from Bacterial Culture to Release Soluble Protein

After cloning the vesicle nucleating peptide, or VNP sequence tag, at the amino terminal of the fusion protein, culture a five-milliliter lysogeny broth, or LB starters, from fresh bacterial transformations at 37 degrees Celsius to saturation. Then, use that to inoculate 25 milliliters of terrific broth, or TB, containing appropriate antibiotic selection in a 500-milliliter conical flask. Incubate the flask in an incubator at 37 degrees Celsius while shaking at 200 rotations per minute or greater than equal to a 25-millimeter orbital throw until the culture reaches a 600-nanometer optical density value, or OD 600, of 0.8 to 1.0.Then, induce recombinant protein expression from the T7 promoter by adding IPTG to a final concentration of up to 20 micrograms per milliliter or 84 micromolar. After allowing sufficient time for induction, pellet the cells by centrifugation at 3000 G at 4 degrees Celsius for 20 minutes. Pass the supernatant through a sterile and detergent free 0.45 micron PES filter to sterilize the vesicle containing media for long-term storage.To concentrate the vesicles into a smaller volume, pass the sterile vesicle containing media through a sterile and detergent free 0.1 micron MCE filter. Then, gently wash the membrane with 0.5 to 1 milliliters of sterile phosphate-buffered saline, or PBS, and use a cell scraper or plastic spreader to carefully remove vesicles from the membrane. Transfer the vesicle concentrate to a fresh micro centrifuge tube using a pipette.Purified vesicles can be stored at four degrees Celsius. Sonicate the protein containing vesicles in the sterile media using an appropriate schedule to disrupt the vesicular lipid membranes and release protein. Centrifuge the sonicated suspension at 39, 000 G and 4 degrees Celsius for 20 minutes to remove the vesicular debris.BL21DE3 Escherichia coli containing the VNp6-mNeongreen expression construct displayed mNeongreen fluorescence being induced overnight with IPTG. The fluorescence remained visible in the culture after the removal of bacterial cells by centrifugation. The presence of VNp-mNeongreen within the culture in cleared culture media was confirmed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis.The resuspended purified vesicles in PBS also displayed fluorescence.

Rekombinante Veszikula-Isolierung aus Bakterienkultur zur Freisetzung von löslichem Protein

Visualizing Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli by Fluorescence Microscopy

Visualizing Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli by Fluorescence Microscopy  

To stain the vesicle membrane, add the fluorescent lipid dye FM4-64 to the purified vesicles at a final concentration of two micromolar and incubate for 10 minutes before imaging. After isolating the protein filled vesicles from Escherichia coli culture, pipette the purified vesicles onto a less than one millimeter thin circular 2%LB agarose pad that has been allowed to form and set on a clean glass slide. Once the liquid has dried, place a 50 millimeter by 25 millimeter cover slip over the vesicles on the pad.Hold the cover slip in place with spacers and adhesive tape. Then mount the slide onto an inverted microscope using an oil immersion objective, and leave the sample for two to three minutes to settle and the temperature to equilibrate. For single frame images, use three image averaging to reduce hardware dependent random background noise.For time-lapse imaging, allow three to five minutes between individual frames. Widefield fluorescence microscopy imaging showed the purified amnion green containing vesicles. The lipophilic fluorescent dye, FM4-64, confirmed the presence of vesicle membranes.Structured illumination microscopy of the live bacterial cells expressing the inner membrane protein, CydB, fused to amnion green, and VNp6-mCherry2 showed vesicle production and cargo insertion.