Beginnen Sie mit der Zubereitung eines polymerisierten Seitengel-Sandwiches. Entferne die Klammern und Papierklebebandschichten und entferne langsam den Kamm. Spülen Sie die Vertiefungen gründlich mit destilliertem Wasser aus.
Legen Sie das Gel-Sandwich richtig in das vertikale Elektrophoresegerät. Füllen Sie den oberen und unteren Behälter mit TBE-Puffer. Erwärmen Sie die Platten, indem Sie einen Vorlauf der Gelelektrophorese für mindestens 30 Minuten bei 50 Watt durchführen.
In der Zwischenzeit werden die getrockneten Proben in fünf Mikroliter denaturierendem Gelladepuffer erneut suspendiert. Verwenden Sie als Nächstes eine kleine Spritze, die mit TBE-Puffer gefüllt ist, um den Harnstoff aus den Vertiefungen des Gels zu spülen. Laden Sie nun die Proben in die sauberen Vertiefungen und achten Sie auf den Geruch des Ladens.
Lassen Sie das Gel zwei Stunden lang bei 50 Watt laufen oder bis der Bromphenolblaufarbstoff 2/3 des Gels abgebaut hat. Schalten Sie nach der Elektrophorese die Stromversorgung aus, entfernen Sie vorsichtig das Glassandwich und reinigen Sie die Glasplatten. Geben Sie das Gel in einen Gel-Imager, um die Fluoreszenz der FAM-markierten Oligonukleotidbanden zu detektieren.
Nach einer, vier und 15 Stunden Inkubation reagierten entweder fünf oder 50 mikromolare Bsep 1 mit zwei mikromolaren Proben von G4-TBA, einzelsträngiger TBA und doppelsträngiger TBA. Für jeden Satz von Proben wurden Kontrollen geladen. Das G4-TBA-Substrat zeigte nur ein Alkylierungsaddukt, da nur G8 für die Alkylierung und die anschließende Strangspaltung zur Verfügung stand.
Mehrere Addukte und Banden von Spaltprodukten wurden bei einzel- und doppelsträngiger TBA beobachtet, da alle Guanine anfällig für eine Bsep-Reaktion waren. Die Sondierungsreaktion und der Tris-Puffer führten zu einer ineffizienten chemischen Kartierung aufgrund des Vorhandenseins unerwünschter Nukleophile, was zu einer reduzierten Proprioaktivität führte. Die G4-TBA-Proben zeigten nur die Bildung von Addukten ohne Strangspaltung.
Für die einzel- und doppelsträngige TBA führte nur eine 24-stündige Inkubation zu einer DNA-Fragmentierung, vergleichbar mit der 15-stündigen Fragmentierung ohne Tris.
