Nach der Etablierung der stromalen Endothelzell-Kokultur wird das GFP-Signal aus dem GFP-Huvec mittels Fluoreszenzmikroskopie mit für die Quantifizierung geeigneten Einstellungen erfasst. Verarbeiten Sie alle Bilder, die am selben Tag aufgenommen wurden, vor, um den Kontrast weiter zu verbessern. Wenn Sie Fidschi oder Bild J verwenden, öffnen Sie alle Bilder des verbesserten GFP-Kanals zum gleichen Zeitpunkt und öffnen Sie das Helligkeits- und Kontrastmenü.
Wählen Sie ein Bild aus, das eine Zwischenbedingung darstellt, und passen Sie den Kontrast automatisch an, indem Sie "Automatisch" auswählen. Klicken Sie auf Festlegen und aktivieren Sie die Option Auf alle anderen geöffneten Bilder übertragen. Beurteilen Sie visuell, ob der automatisch ausgewählte Bereich zu allen Bildern des aktuellen Zeitpunkts passt.
Passen Sie den Bereich bei Bedarf manuell neu an und übertragen Sie ihn auf alle Bilder und speichern Sie die angepassten Bilder als TIFF-Dateien. Wenden Sie als Nächstes einen mittleren Unschärfefilter auf alle Bilder an. Reduzieren Sie die Größe durch Binning und speichern Sie sie als Graustufen-RGB-Farb-TIFF-Dateien zur Quantifizierung in einem Ordner.
Dies kann manuell oder im Batch-Modus mithilfe von Makros erfolgen. Analysieren Sie alle erstellten Bilder mit dem Batch-Prozessmodus im Angiogenese-Analysator für Bild J. Validieren Sie dann die Quantifizierungsergebnisse, indem Sie die Überlagerungen der erkannten Strukturen und der Originalbilder untersuchen. Passen Sie die Vorverarbeitungsparameter an, analysieren Sie Originalbilder erneut oder schließen Sie problematische Bereiche aus, wenn der Algorithmus künstliche Strukturen erkennt, bei denen im Originalbild nur wenige oder gar keine Zellen sichtbar sind.
Normalisieren Sie schließlich die erhaltenen Werte auf eine Fläche von einem Quadratmillimeter, indem Sie die Werte jeder Probe mit dem Verhältnis der analysierten Fläche zu einem Quadratmillimeter multiplizieren. Quantifizierte Parameter der GFP-huvec-Netzwerke zeigten, dass die Gesamtlänge des Netzwerks in Gegenwart von FGF-2 am höchsten und in Abwesenheit von Wachstumsfaktoren am niedrigsten war. Die Anzahl der Knoten, die Verzweigungspunkte in den Netzen angeben, folgte dem gleichen Trend wie die Gesamtlänge.
Umgekehrt wiesen beide Wachstumsfaktoren signifikant weniger isolierte Segmente auf, was auf eine höhere Interkonnektivität hindeutet als die Erkrankung ohne Wachstumsfaktor.
